一种检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测A1和A2型荷斯坦牛的方法及其试剂盒，属于分子生物学检测技术领域，该方法以待测牛的DNA为模板设计专用引物，进行PCR扩增反应，扩增片段经EcoT22I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶检测DNA片段长度为434bp的牛为A1型牛；酶切后DNA片段为434bp、385bp和49bp为A1和A2杂合型牛；酶切后DNA片段为385bp和49bp为A2型牛。该检测方法操作便捷、成本低、准确性高，可以早期筛选A2型奶牛，减少养牛业的经济损失。
【专利说明】
-种检测Al和A2型e-酪蛋白奶牛的方法及其试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学检测技术领域，具体设及一种检测Al和A2型0-酪蛋白奶牛 的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 牛奶品质是奶业发展的生命，影响奶业的健康可持续发展。乳蛋白是构成牛奶品 质的主要物质基础，牛奶中的乳蛋白W酪蛋白和乳清蛋白为主。酪蛋白约占牛奶蛋白的 80%，包括alpha sl，alpha s2，beta，kappa四种类型。其中0酪蛋白约占蛋白质总量的 3〇%，是氨基酸的重要来源，研究报道0-酪蛋白有41，42,43,44,8，(：，〇,6爪化，肥，1，6共13 种遗传变体型化amiAski等，2〇〇7)。41和42型0-酪蛋白是奶牛群体中最常见的两种，其区别 在于e-酪蛋白基因发生了一个碱基变化，从而导致相应位置氨基酸由脯氨酸变成组氨酸。 研究发现，正是由于上述一个氨基酸的变化，导致了牛奶在人类消化过程中产生了差异。Al 型牛奶在消化或鲜奶加工过程中某些酶可在其组氨酸处特异性水解，从而形成一种由屯个 氨基酸组成的肤段，被称为e-酪啡肤(BCM-7)，而A2型0酪蛋白此处氨基酸为脯氨酸，不能够 被特异性水解，因此不能形成BCM-7。现已发现，BCM-7能穿过胃肠壁进入血液循环，影响消 化系统和免疫细胞，可能与一些疾病有关，如I型糖尿病、呼吸功能障碍、消化系统疾病、免 疫功能素乱和突然性婴儿死亡综合征等。近日，国内最新研究成果显示，很多人对乳糖不耐 受的认知存在误区，其实导致他们一喝牛奶就出现肠道反应的原因有可能是因为肠道对普 通牛奶中含有的Al蛋白质所产生的炎症反应而引起的。目前，全球只有新西兰建立了一家 有权生产和销售A2品牌乳制品的公司，其所有的A2牛奶都是通过DNA测序验证。2013年11 月，A2有限公司首次向中国消费者推出其A2Platinum白金婴幼儿配方奶粉系列产品，也在 积极拓展在北美及亚洲的其他市场。可W说A2品牌的出现是科研到商业开发的一次成功性 突破。
[000引随着A1、A2牛奶相关知识的宣传和报道，W及食品安全越来越受到关注，A2奶将会 更多地受到消费者的青睐。因此，有必要提供一种有效区分Al型和A2型0-酪蛋白奶牛的方 法。中国专利CN1052919839A公开了一种基于酶切法检测0-酪蛋白基因型的方法，该方法是 根据e-酪蛋白的碱基序列设计出可W扩增出TaqI酶切位点的引物，利用引物对待检测的奶 牛基因组DNA进行PCR扩增，扩增出的Al型0-酪蛋白基因片段中产生一个化ql酶切位点，利 用限制性内切酶化ql对扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，含有Al 型e-酪蛋白基因的扩增产物在酶切之后就会产生一个218bp的片段和一个35bp的小片段。 该方法虽然可W实现e-酪蛋白基因型的检测，但是该方法在设计上游引物时，创造酶切的 突变位点位于该引物的最后一个碱基，从该专利的琼脂糖凝胶电泳图可W看出，酶切后有 许多其它电泳条带存在，比较杂乱，可能存在非特性扩增现象，且酶切后小片段的长度只有 3化P，片段间长度差别太小，运些问题都极易导致出现假阳性或假阴性的检测结果。因此， 需要针对引物创造性酶切位点的位置、扩增条件及酶切体系做相应的改善，W满足快速检 测Al和A2型0-酪蛋白奶牛的需要。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术，本发明人经过创造性的劳动和大量的试验，得到了能够用于 检测Al和A2型0-酪蛋白奶牛的方法及其试剂盒，所述检测方法及其试剂盒的特异性强、灵 敏度高，能够快速、准确的检测Al和A2型0-酪蛋白奶牛。由此提供了下述发明：
[0005] 本发明的一个方面设及一种用于检测Al和A2型0-酪蛋白奶牛的引物，所述引物的 序列如下：
[0006] beta-caseinF：5'-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3' (沈Q ID NO. 1);
[0007] beta-caseinR:5 '-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 '（SEQ IDNO.2)O
[000引采用上述引物对目的基因进行扩增，若PCR扩增片段的第49为CC，为Al型牛，PCR扩 增片段的序列如SEQ ID NO.3所示;若PCR扩增片段的第49为AA，为A2型牛，PCR扩增片段的 序列如SEQ ID NO.4所示;若扩增片段序列中第49位C和A碱基都存在，则为Al和A2杂合牛。
[0009]上述引物在制备检测Al和A2型0-酪蛋白奶牛的试剂或试剂盒中的应用也是本发 明的保护范围。
[0010] 本发明的引物设计思路为：基于beta-casein基因（Ensembl参考序列 ENSBTAT00000003409)C. 2450A突变，并利用PCR-RFLP技术在上游引物(beta-caseinF)上 创造了一个突变位点，设计得到可W扩增产生ECOT22I酶切位点的引物。
[0011] 需要说明的是，本发明中引物的设计除了通常引物设计所要考虑的退火溫度、GC 含量等方面，更要考虑两个重要因素：（1)上游引物所创造的突变位点位置的选择；（2)酶切 后反应产物片段的大小;若酶切后的反应产物的片段过小，则在进行凝胶电泳检测时，条带 间显示不清晰或无法区分显示，容易出现假阳性或假阴性的检测结果，但扩增产物也不宜 过长，过长则会影响扩增的效率。
[0012] 本发明针对上游引物选择了不同的突变位点，W及酶切后扩增产物片段的长度， 设计了多对引物，经过试验反复验证后确定本发明上述所列出的用于检测Al和A2型0-酪蛋 白奶牛的引物为最佳引物，能够兼顾检测的准确性、特异性和扩增效率的需要。其他引物则 难W实现检测准确性和扩增效率的兼顾。
[0013] 本发明的另一方面设及一种用于检测Al和A2型0-酪蛋白奶牛的试剂盒，其包含本 发明的上述引物。
[0014] 上述试剂盒中，还包含hq Master Mix、EcoT22I酶、Buffer缓冲液和DNA Marker。
[0015] 所述!"aq Master Mix是由!"aq DNA 化lymerase(0.0加nits/]il)、MgC12(4mM)、和 dNTPs(0.4mM)构成。
[0016] 在本发明的一个【具体实施方式】中，所述试剂盒中包含：
[0017] 上述引物（10皿〇l/L);2Xl'aq Master Mix;10XH Buffer缓冲液;ECOT22I酶；灭 菌水；2000bp DNA Marker。
[0018] 本发明的再一方面设及一种非诊断目的的检测Al和A2型(6-酪蛋白奶牛的方法，包 括采用上述引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增的步骤，对PCR扩增产物进行酶切反应 的步骤，W及对酶切后的片段进行凝胶电泳检测的步骤。
[0019] 所述PCR扩增采用25iil反应体系，反应体系的组成为：模板DNA( IOOngAil)化I，上 游引物beta-caseinF( IOumo 1/L)、下游引物beta-caseinR( IOumo 1/L)各0 .化1，2 X Taq MasterMix 12.化1，灭菌水 10.5]il。
[0020] 所述PCR扩增的反应条件为:94°C预变性4min;然后94°C变性30s，67°C退火30s，72 °C延伸10s，此步共35个循环;72°C保持5min。
[0021] 所述酶切反应采用酶切反应体系，反应体系的组成为:PCR扩增产物IOiil; 10 X皿Uffer缓冲液化1 ;EcoT22I酶化1;灭菌水化1。
[0022] 所述酶切反应的反应条件为:37 °C消化60min。
[0023] 所述凝胶电泳检测的步骤具体为:将酶切后的片段用质量浓度为3%的琼脂糖凝 胶电泳。凝胶电泳检测酶切DNA片段长度为434bp的待测牛为Al型牛;片段为434bp、38化P和 49bp为Al和A2杂合型牛;385bp和49bp的检测牛为A2型牛。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] 本发明的检测方法操作快速、准确性高且费用低。同时根据检测方法开发出检测 试剂盒，使操作更加标准化，运一发明可W早期检测Al和A2型荷斯坦牛，消除Al型牛导致的 养牛业损失，在牛的分子遗传育种中应用前景广阔，能够产生可观的经济效益和良好的社 会效益。
【附图说明】
[0026] 图1 :PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；
[0027] 图2:利用beta-caseinF和beta-caseinR进行分型检测的3%琼脂糖凝胶电泳图； 图中1:A2型；2:A1型；3:A1 和A2杂合型;Maker:2000bp DNA Marker;
[00巧]图3:利用beta-caseinF-1和beta-caseinR敏感性试验的结果图进行分型检测的 3%琼脂糖凝胶电泳图；图中1:A2型；2:A1型；3:A1和A2杂合型;Maker:2000bp DNA Marker。
【具体实施方式】
[0029] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，或按照试剂制造厂商所建议的条件;下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
[0030] 实施例1:检测Al和A2型0-酪蛋白奶牛的方法构建
[0031] 1.引物设计
[0032] 基于 be 化-casein 基因化 nsembl 参考序列 ENSBTAT0000000：M09)c.245C〉A 突变，并 在上游引物上创造一个突变位点，设计针对含有突变位点的引物，从而产生了ECOT22I酶切 位点。分别设计出了多对引物，采用设计出的引物分别对目的基因进行PCR扩增，并对扩增 产物进行ECOT22I酶切和凝胶电泳检测验证;具体如下：
[0033] (1)从荷斯坦牛血液、精液或毛囊中提取待测牛的总DNA作为目的基因；
[0034] (2)采用设计的引物对目的基因进行PCR扩增；
[0035] PCR扩增采用反应体系，反应体系的组成为:模板DNA( IOOngAil)化1，上游引 物be1:a-caseinF( lOumol/L)、下游引物beta-caseinR( 10皿ol/L)各0.扣1，2 Xhq Master 1;[又12.化1，灭菌水10.5111。
[0036] PCR扩增的反应条件为:94°C预变性4min;然后94°C变性30s，67°C退火30s，72°C延 伸IOs，此步共35个循环;72°C保持5min。
[0037] (3)对PCR扩增产物进行酶切反应；
[003引酶切反应采用酶切反应体系，反应体系的组成为:PCR扩增产物IOiil; IOXH Buffer缓冲液化1 ;EcoT22I酶化1;灭菌水化1。
[0039] 酶切反应的反应条件为:37 °C消化60min。
[0040] (4)对酶切反应后的片段进行凝胶电泳检测；
[0041] 凝胶电泳检测的步骤具体为:将酶切后的片段用质量浓度为3%的琼脂糖凝胶电 泳。
[0042] 选择两组有代表性的引物，其序列分别如下：
[0043] be化-caseinF:5'-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3';
[0044] be化-case inR:5'-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 \
[0045] be化-caseinF-1:5'-CAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATG-3';
[0046] be化-case inR:5'-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 \
[0047] W上述两组引物进行扩增，扩增产物酶切后的凝胶电泳图分别如图2和图3所示， 由图可W看出，不同引物的扩增产物酶切后，其凝胶电泳的检测效果不同，Wbeta- caseinF-1和be化-caseinR作为引物扩增得到的产物，经酶切后进行凝胶电泳检测时，条带 显示不清晰，且小的条带无法进行区分显示（图3)，运可能是上游引物be化-caseinF-1创造 的酶切突变位点位于该引物的最后一个碱基或酶切小片段太短（只有35bp)难W区分引起 的。针对于此，我们设计beta-caseinF上游引物，在此引物的倒数第二个碱基创造了酶切突 变位点，且扩大了上游引物长度，并相应优化了检测方案。
[0048] 因此，经试验优化筛选确定W下序列作为检测Al和A2型0-酪蛋白奶牛的引物序 列。
[0049] beta-caseinF：5'-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3' (沈Q ID NO. 1);
[0050] beta-case inR:5 '-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 '（SEQ ID NO.2)。
[0051] 2.本发明检测方法的优化
[0化2] 2. IPCR反应条件的优化
[0053] 在的PCR反应体系中，对影响反应的几个条件进行优化，包括退火溫度(55~ 75°C)、引物浓度（1~20皿ol/L) W及反应时间和循环数等，观察其对检测结果的影响，确定 最佳退火溫度、引物浓度、反应时间和循环数等反应条件。
[0054] 结果表明：最优的PCR反应条件为：引物浓度为10皿ol/L、94°C预变性4min;然后94 。(:变性30s，67°C退火30s，72°C延伸10s，此步共35个循环;72°C保持5min。^上述PCR反应条 件进行反应的扩增效率最高。
[0055] 2.2酶切反应条件的优化
[0056] 在的酶切反应体系中，对酶切反应的溫度(25-45°C)，消化时间（30-120min) 进行优化。
[0057]结果表明：最优的酶切反应条件为37°C消化60min。
[005引实施例2:用于检测Al和A2型0-酪蛋白奶牛的试剂盒
[0059] 试剂盒的组成包括：引物（10皿OVLhSXhq Master Mix; 10 XH Buffer缓冲液； EcoT22I酶；灭菌水；2000bp DNA Marker。
[0060]引物组为实施例1中筛选优化得到的，其序列为：
[0061 ] beta-caseinF：5'-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3' (沈Q ID NO. 1);
[0062] beta-case inR:5 '-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 '（SEQ ID NO.2)。
[0063] hq Master Mix是由hq DNA Polymerase(0.OSunits/山）、MgC12(4mM)、和dNTPs (0.4mM)构成。
[0064] 采用该试剂盒进行临床检测的检测方法为：
[0065] (1)从荷斯坦牛血液、精液或毛囊中提取待测牛的总DNA;
[0066] (2)采用设计的引物对目的基因进行PCR扩增；
[0067] ?〇?扩增采用25]11反应体系，反应体系的组成为:模板0魁（100]1旨/111)化1，上游引 物be1:a-caseinF(l0皿ol/L)、下游引物beta-caseinR(l0皿ol/L)各0.扣l，2Xl'aqMaster 1;[又12.化1，灭菌水10.5111。
[006引 PCR扩增的反应条件为:94°C预变性4min;然后94°C变性30s，67°C退火30s，72°C延 伸IOs，此步共35个循环;72°C保持5min。
[0069] (3)对PCR扩增产物进行酶切反应；
[0070] 酶切反应采用酶切反应体系，反应体系的组成为:PCR扩增产物IOiil; IOXH Buffer缓冲液化1 ;EcoT22I酶化1;灭菌水化1。
[0071] 酶切反应的反应条件为:37°C消化60min。
[0072] (4)对酶切反应后的片段进行凝胶电泳检测；
[0073] 凝胶电泳检测的步骤具体为:将酶切后的片段用质量浓度为3%的琼脂糖凝胶电 泳，凝胶电泳检测酶切DNA片段长度为434bp的待测牛为Al型牛;片段为434bp、38化P和49bp 为Al和A2杂合型牛;385bp和49bp的检测牛为A2型牛。
[0074] 实施例3:试剂盒的特异性检测
[00对 W已知基因型的Al, A2，A3，A4型0-酪蛋白奶牛为检测对象，采用实施例2的试剂盒 进行检测，结果为:Al, A2型0-酪蛋白奶牛在凝胶电泳中能够跑出相应长度的条带，而A3，A4 型e-酪蛋白奶牛无法跑出相应长度的条带。表明本发明试剂盒中的引物组、PCR反应体系和 检测方法具有良好的特异性。
[0076] 实施例4:试剂盒的重复性检测
[0077] W已知基因型的Al和A2的型0-酪蛋白奶牛为检测对象，采用本发明的试剂盒进行 多次重复试验，多次重复检测的结果均一致，表明本发明的试剂盒及检测方法的稳定性好。
[0078] 实施例5:临床样本检测
[0079] 采用本发明实施例2的试剂盒对12头荷斯坦牛进行检测。
[0080] 根据上述检测Al和A2型荷斯坦牛的试剂盒，利用如下步骤PCR扩增牛beta-casein 基因片段序列，扩增的片段用质量浓度为1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。
[00川（I)PCR 反应体系：DNA(IOOngAU)IiU,上，下游引物（lOwnol/L)各 0.5iU，2 X I^qMaster Mix 12.化1，灭菌水 10.5]il。
[0082] (2)PCR 反应条件:94°C 预变性 4min;94°C 变性 30s，67°C 退火 30s，72°C 延伸 10s，此 步共35个循环;72°C保持5min。
[0083] (3)扩增产物的电泳检测：取化1 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。检测显示12 个泳道的DNA样品均为单一的条带，大小为434bp，与目的片段大小一致。
[0084] 3. PCR产物的酶切分型检测
[0085] (1)20山酶切体系：PCR扩增产物IOiil; 10XH Buffer缓冲液化l;EcoT22I酶化1;灭 菌水化K37°C酶切60min。
[0086] (2)电泳检测：用质量浓度为3%琼脂糖凝胶对酶切后的产物共计20iU进行电泳检 电压90V;时间40min。
[0087] 4.基因分型与结果分析:A1型、A2型和杂合型牛的分型结果如下表1所示。
[008引总共检测了 12头何斯坦牛，其中共有2头牛酶切后DNA片段为434bp，为Al型牛;3头 DNA片段为434bp、38化P和49bp为Al和A2杂合型牛;7头38化P和49bp的检测牛为A2型牛。
[0089] 表1.牛be1:a-casein 分型结果
[0090]
[0091] 所有的样本均经过直接测序检测验证，结果与采用本发明试剂盒的检测结果完全 一致，准确率达100%，说明本发明的试剂盒及其检测方法准确、有效，特异性强，检测结果 无假阳性和假阴性。
【主权项】
1. 一种用于检测Al和A2型β-酪蛋白奶牛的引物，其特征在于，所述引物的序列为： beta-caseinF:5 '-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3 '； beta-caseinR:5 '-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3 '。2. 权利要求1所述的引物在制备检测Al和A2型β-酪蛋白奶牛的试剂或试剂盒中的应 用。3. -种用于检测Al和Α2型β-酪蛋白奶牛的试剂盒，其包含权利要求1所述的引物。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，还包含Taq Master Mix、 EcoT22 頂每、Buffer缓冲液和DNA Marker。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述Taq Master Mix是由Taq DNA Polymerase(0 · 05units/yl)、MgCl2(4mM)、和dNTPs(0.4mM)构成。6. -种非诊断目的的检测Al和A2型β-酪蛋白奶牛的方法，其特征在于，包括采用权利 要求1所述的引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增的步骤，对PCR扩增产物进行酶切反 应的步骤，以及对酶切后的片段进行凝胶电泳检测的步骤。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增采用25μ1反应体系，反应体系的 组成为：模板DNA ΙμL，上游引物beta-caseinF、下游引物beta-caseinR各O · 5μ1，2 X Taq Master Mix 12.5μ1，灭菌水 10.5μ1。8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94°C预变性 4min;然后94°C变性30s，67°C退火30s，72°C延伸IOs，共35个循环；72°C保持5min。9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶切反应采用20μ1酶切反应体系，反应 体系的组成为:PCR扩增产物10μ1; 10 XH Buffer缓冲液2μ1 ;EcoT22頂每ΙμL;灭菌水7μ1。10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述凝胶电泳检测的步骤为:将酶切后的片 段用质量浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳检测酶切DNA片段长度为434bp的待测牛 为Al型牛;片段为434bp、385bp和49bp为Al和A2杂合型牛;385bp和49bp的检测牛为A2型牛。
【文档编号】C12Q1/68GK105925717SQ201610522855
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】王秀革, 黄金明, 都彦伶, 姜强, 张燕, 鞠志花, 王长法, 孙艳, 仲跻峰
【申请人】山东省农业科学院奶牛研究中心