一种塞内加谷病毒实时荧光定量pcr检测引物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物检测技术领域，公开了一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒；首先通过设计并筛选得到一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～3所示；利用该引物和探针可特异性扩增出来塞内加谷病毒，实时荧光定量可通过实时监测PCR过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据CT值来鉴别SVV；利用所述方法进行PCR扩增后即可鉴别SVV，准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高效地进行鉴定SVV，有利于在临床实践中推广应用。
【专利说明】
-种塞内加谷病毒实时黄光定量PCR检测引物及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及生物检测技术领域，更具体地，设及一种塞内加谷病毒实时巧光定量 PCR检测引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 塞内加谷病毒(Seneca Valley virus SW)是单股正链RNA病毒，是小核糖核酸病 毒科Senecavirus病毒属的典型代表。其最初被认为是PER. C6细胞培养物中的污染物，随后 在美国和加拿大的猪群中被分离，2007年在美国一屠宰场的猪群中出现水瘤性疾病临床症 状，约80%的猪出现贩足，PCR检测猪口蹄疫、猪水瘤病、水瘤性口炎和水瘤性疹均为阴性，而 SVV却为阳性，从而被认为是原发性水瘤性疾病。近期猪塞内加谷病毒(SVV)在己西猪群中 的感染与爆发，证明了猪塞内加谷病毒很有可能是猪的原发性水瘤性疾病病原之一。2015 年我国及己西出现了几次SVV感染猪群并出现严重的临床发病及死亡症状，造成严重的经 济损失。SVV在临床上所引起的临床症状与其他一些猪的水泡病极为相似，在临床和组织病 理学上很难区分，运就给该病的确诊带来一定难度，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技 术，传统的检测方法费时费力，操作方法繁琐，不利于疾病的及时诊断治疗。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中塞内加谷病毒检测所存在的上述 缺陷，提供一种特异性检测塞内加谷病毒实时巧光定量PCR的引物。
[0004] 本发明的第二个目的是提供含上述检测引物的试剂盒。
[0005] 本发明的目的是通过W下技术方案予W实现的： 一种塞内加谷病毒实时巧光定量PCR检测引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针 的序列如沈Q ID NO: 1~3所示。
[0006] 优选地，所述探针的5'端标记的是巧光报告基团；3'端标记的是泽灭基团。
[0007] 更优选地，所述巧光报告基团为FAM，所述泽灭基团为TAMAR。
[000引本发明还提供含有所述塞内加谷病毒实时巧光定量PCR检测引物和探针的试剂 盒。
[0009] 优选地，所述上游引物、下游引物和探针的浓度为10測。
[0010] 优选地，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、巧光染料、阳性标准品。
[00川更优选地，所述阳性标准品的制备方法是从SVV细胞病毒抽提RNA并反转录成 CDNA，再经PC时尋SW-3C基因扩增出来，得到与目的片段大小一致的扩增产物。PCR产物回收 后，经与PMD19-T载体连接、转化、扩增含有目的片段的重组质粒，经菌液PCRW及测序鉴定， 证实已成功地构建了 SW重组质粒标准品，命名为PMD19-T-3C，作为阳性标准品待用。
[0012] 优选地，所述试剂盒进行巧光定量PCR的反应体系为：Premix Ex Taq(P;robe qPCR)(2X)10iiL、10 咖，0.4化上游引物、10 咖，0.4化下游引物、ROX Reference Dye II 巧OX )0.2化、10 yM，0.祉L探针、DNA模板2.0化、d地2〇 6.2化。
[0013] 优选地，所述试剂盒进行进行巧光定量PCR的反应条件为：95 °C 30秒，95 °C 5 秒，60 °C 34秒，40个循环。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果： 本发明通过设计并筛选得到一种塞内加谷病毒实时巧光定量PCR检测引物和探针，所 述上游引物、下游引物和探针的序列如SEQ ID N0:1~3所示;利用该引物和探针可特异性 扩增出来塞内加谷病毒，实时巧光定量可通过实时监测PCR过程中双链DNA巧光染料与PCR 扩增产物的结合情况，采集巧光数据，根据CT值来鉴别SVV;利用所述方法进行PCR扩增后即 可鉴别SW，准确性高、特异性好，重复性好，可W准确、快速、高效地进行鉴定SVV，有利于在 临床实践中推广应用。
【附图说明】
[0015] 图1为重组质粒标准品PMD19-T-3C的PCR扩增结果。
[0016] 图2为实时巧光定量PCR的标准曲线。
[0017] 图3为实时巧光定量PCR的灵敏性试验；其中1为1 X IO9Copies/化；2为1 X l〇8copies/iiL;3为 1 X l〇7copies/iiL;4为 1 X l〇6copies/iiL;5为 1 X l〇5copies/iiL;6为 1 X l〇4copies/化;7为 1 X l〇3copies/化;8为 1 X l〇2copies/化;9为 1 X loVopies/化；10为 1 X 10*^cop i e s/化;11为阴性对照。
[001引图4为实时巧光定量PCR的特异性试验，其中1为SVV; 2为FMDV; 3为SVDV; 4为VSV; 5 为PRRSV; 6 为PCV; 7 为PRV; 8 为PK-15 细胞。
【具体实施方式】
[0019] 下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对 本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改 或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人 员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。
[0020] 实施例1标准阳性模板的制备 一、病毒总RNA的抽提 按Invi化Ogen公司TRIZOL LS Reagent RNA提取试剂盒使用说明书进行。在1.5 ml eppendorf管中加入250 yL已分装好的细胞繁殖所得的病毒液上清和750 yL TRIZ0L，充分 混匀，室溫放置10 min;加入200 yL的氯仿，剧烈摇动15sec，室溫静置5min，4°C，12000巧m 离屯、15 min;将上清转移到新的1.5 ml eppendorf管中，加入500 yL异戊醇，充分混匀，室 溫放置10111111，41：，12000巧111离屯、10 111111;弃去上清液，沉淀用冰预冷的70%乙醇1000化， 轻轻混匀，洗涂一次，4°C ,12000 rpm离屯、10 min;弃去上清液，风干；用20 yL DEPC处理的 =蒸水溶解RNA，-80°C保存或直接用于反转录。
[0021] 二、引物设计 根据GenBank中SVV-OOl (DQ641257)的3C区域基因序列，设计PCR引物：上游引物Pl: 5'-ATCCTTTTGCTGCCCATGTG-3'，下游引物P2: 5'-AGAACTCTACCCAACGCCTC-3'，利用该引物 扩增3C基因，反应体系如下:PremixTaq 2扣L、上游引物Pl化L、下游引物P2化L、模板DNA 化L，最后用dd出0补足反应体系总体积为50化。
[0022] 扩增程序为：（1)94°C预变性5min，（2)94°C变性lmin，57°C退火30 s，72°C延伸30 S，共32个循环；（3)72°C延伸lOmin。
[0023] 回收PCR产物（参照Omega公司E.Z.N.A. ? Gel Extraction Kit的使用说明书）， 进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定为正确的目标片段，用于后续的克隆。
[0024] S、目的基因的克隆 (1)回收产物连接PMD19-T载体 参照pMD ? 19-T VectoH式剂盒说明书，连接反应体系为:纯化的PCR产物化L、pMD19-T vector 0.扣L、Solution I 2.扣レ最终连接反应体系的总体积为化L。将上述反应体系混 匀并稍作离屯、后，4°C连接过夜。
[00巧](2)连接产物转化 将（1)的连接产物化L轻轻地加到50化的大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min;42°C热休 克90s然后迅速转移到冰浴中冷却2min;加到20化L LB液体培养基中，37°C，ieOrpm振摇培 养45min，使大肠杆菌复苏，抗性基因表达;将W上复苏的感受态细胞均匀涂布AmpVLB固体 培养基平皿，37 °C培养过夜。
[00%] (3)重组子的PCR鉴定与筛选 从(2)过夜培养的平板中挑取S个单菌落，分别接种于ImL含有10化g/mL Amp+的LB液 体培养基中，37°C，220巧m振摇培养化W上(0D600值0.3~0.4);取菌液进行PCR鉴定，产物 用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测；取20化鉴定阳性的菌液Wl: 100的比例接种到2mL Amp+的 LB液体培养基中，37 °C，220巧m振摇培养过夜。
[0027] (4)重组质粒的提取与鉴定 参照Omega公司E.Z.N.A. ? Plasmid Mini Kit I的说明书，对过夜培养菌液进行质粒 抽提，用1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果。
[00%]将重组质粒抽提产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定结果见图1，经鉴定阳性的重 组PMD19-T质粒送北京奥科生物科技有限责任公司进行核巧酸序列测定。
[0029] 实施例2引物与化qMan探针的设计与筛选 根据SW基因序列中的3C保守片段设计特异引物和化qMan探针，由华大公司合成，引物 和探针序列见表1，探针的5'端标记的巧光报告基团为FAM，3'端标记的泽灭基团为TAMRA。
[0030]由表1中的引物和探针，对SW进行PCR，结果发现:其他3对引物有出现非特异性扩 增或引物二聚体，不符合实验要求，因此只有引物1和引物2可W作为特异性扩增检测SVV的 引物。
[0031 ]实施例3巧光定量PCR反应条件优化和标准曲线制作 对引物浓度、探针浓度和退火溫度条件最优化，Real-Time PCR 20化反应体系为 Premix Ex 化9(?'〇66 qPCR)(2X)10 化，各特异性上、下游引物（10 yM)各0.4 化，ROX Reference Dye IK50X)0.2 化，巧光探针（10 yM)0.8 化，DNA模板2.0 yL，d地2〇 6.2 y L。最佳反应条件为:95°C 30 s，95°C 5 s，60°C 34 s，40个循环。
[00创巧憶标准重组阳性质粒的0D26日皿和0028日皿值及其比值，计算质粒浓度，并换算成拷 贝数，W双蒸水10倍系列稀释成7个梯度（IO8~103copiesAiL)DW此为模板，建立20化反应 体系，根据优化后的PCR反应体系，在ABI 7500型巧光定量PCR仪上扩增，所得标准曲线见图 2。结果，扩增曲线与Ct值之间的线性关系紧密，相关系数(R2)可达0.999。
[0033] 实施例4实时巧光定量PCR的灵敏性试验 8^阳性标准品10倍系列稀释作为模板进行实时巧光定量？03(1 X 10<^~1 X IO9CopiesAiL,共10个梯度，W确定它们的检出下限。结果，WPMD19-T-3C标准品为模板，巧 光定量PCR的检出下限为lXl〇2 copies/化(图3)。
[0034] 实施例5实时巧光定量PCR的特异性试验 W SVV、FMDV、SVDV、VSV、PRRSV、PCV、PRV、阳 DV 和正常 PK-15 细胞的 cDNA 或 DNA 为模板，应 用所建立的实施例3优化的反应体系和反应条件进行实时巧光定量PCR扩增，结果发现该 PCR扩增只有SW呈阳性（图4)。
[0035] 实施例6实时巧光定量PCR的重复性试验 将SVV的阳性标准品质粒进行IO9、IO7、I 〇5 cop i eSAiL共3个梯度为模板，进行组内和组 间重复性检验，每个梯度都要重复5次，共做3次反应。对SVV所建立起来的方法进行PMD19- T-3C标准品质粒重复性检验。结果表2所示:组内和组间的变异系数(CV)均小于0.96%。
[0036] 实施例7试剂盒的组成 按照下列组成配制用于检测猪塞内加谷病毒的试剂盒：1〇咖引物1、1〇測引物2、10 y M探针、ROX Reference Dye 11(50X )、Premix Ex !"agCProbe qPCR)(2X )。
[0037] 该试剂盒的一种反应体系可W为:Premix Ex Taq(P;robe qPCR)(2X )10化、10 Ji M，0.4化引物l、10i^M，0.4化引物2、R0XReferenceDyeII(50X)0.2化、10i^M，0.如L探 针、DNA模板2.化L、d地2〇 6.化L，反应总体积为20化。
[0038] 利用该试剂盒进行实时巧光定量PCR的反应条件为:95°C 30秒，95°C 5秒，60°C 34秒，40个循环。
【主权项】
1. 一种塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，所述上游引物、 下游引物和探针的序列如SEQ ID NO: 1~3所不。2. 根据权利要求1所述塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于， 所述探针的5'端标记的是荧光报告基团；3'端标记的是淬灭基团。3. 根据权利要求2所述塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于， 所述荧光报告基团为FAM，所述淬灭基团为TAMAR。4. 含有权利要求1至3任一项所述塞内加谷病毒实时荧光定量PCR检测引物和探针的试 剂盒。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物和探针的浓度 为10 μΜ。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、荧光 染料、阳性标准品。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为PMD19-T-3C。8. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应体 系为：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X)10yL、10 μΜ，0·4μL上游引物、10 μΜ，0·4μL下游引 物、ROX Reference Dye 11(50 X )0.2yL、10 μΜ，0·8μL探针、DNA模板2.OyUddH2O 6.2yL〇9. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行荧光定量PCR的反应条 件为:95°C 30秒，95°C 5秒，60°C 34秒，40个循环。
【文档编号】C12R1/93GK105925728SQ201610379248
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】马静云, 赵晓亚, 陈桂华, 伍绮文
【申请人】华南农业大学