一种先导化合物及其在制备抗去势抵抗性前列腺癌药物中的用图
【专利摘要】本发明提供了一种先导化合物及其在制备抗去势抵抗性前列腺癌药物中的用途，属于生化制药技术领域。本发明对FKBP51和FKBP52蛋白进行高通量虚拟筛选，并对所得的化合物在分子、细胞及动物个体水平上验证其有效性，对最终遴选出的有开发前景的先导化合物作用于CRPC的分子机制进行探讨，为CRPC的治疗提供一种新的更为有效的途径。
【专利说明】
一种先导化合物及其在制备抗去势抵抗性前列腺癌药物中的 用途
技术领域
[0001] 本发明属于生化制药技术领域，具体地涉及一种具有抗前列腺癌活性的先导化合 物及其在制备抗去势抵抗性前列腺癌药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 前列腺癌在欧美等发达国家是男性癌症死亡的第二大原因，而在中国前列腺癌的 发生以及死亡率也不断攀升。雄激素受体(androgen receptor，AR)被认为在前列腺癌的发 生、发展和转移中起到关键作用。因此，雄激素撤除疗法(androgen deprivation therapy) 成为治疗晚期前列腺癌的最常用和有效的方法。但是在治疗的两到三年内，大部分晚期前 列腺癌就会发展成去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。对于CRPC目前缺乏有效治疗手段，成为前 列腺癌治疗中最为棘手的问题。
[0003] 多项研究表明，AR信号通路在去势环境中的再激活是CRPC的发生的主要原因，而 局部雄激素的合成以及AR的基因突变、倍增及可变剪切都是导致AR的再激活因素。目前针 对CRPC的药物研发的思路主要是更进一步的降低雄激素的浓度或设计出更强效的抗雄激 素，但是这些方法都对AR的基因突变和可变剪切产物无效。而免疫亲和蛋白FKBP51和 卩1(1^52作为协同分子伴侣(〇〇〇1^口61'〇116)，与!18口90-起帮助41?的正确折叠，为41?发挥功能 所必需，通过抑制FKBP51/FKBP52可以达到降低AR、AR突变体及可变剪切产物的转录活性的 效果。
[0004] FKBP51与FKBP52蛋白属于免疫亲和蛋白家族，两者有70%的序列相似性，且都具 有顺脯氨酸异构酶活性(PPIase)。二者结构非常类似，都包括N端的FK506结合结构域，这 个结构域具有PPIase活性，通常被称为FK1结构域。邻接FK1结构域的是FK2结构域，它与FK1 结构域约有19%的序列相似度，不能结合?1(506。(]端是11^(丨61^31：1'；[00卩6卩1:丨(16代卩631:)结 构域，它介导FKBP5UFKBP52与Hsp90C端相互作用。FKBP51在大多数细胞中是抑制类固醇受 体的信号转导，而FKBP52能够促进类固醇受体的信号转导。FKBP51、FKBP52都对AR的激活起 到正调控作用。FKBP52对AR的激活至关重要，但是不会改变AR对雄激素的结合，因此，对 FKBP5 2功能的抑制能够减少AR、AR突变体及其可变剪切产物的激活，这对CRPC的靶向治疗 有重大意义。
[0005] 对FKBP5UFKBP52基因敲除小鼠的研究进一步表明，特异性的阻断或抑制FKBP51、 FKBP52的功能不会产生潜在的副作用。此外，对已经进入临床一期试验FKBP家族的广谱抑 制剂FK1706(所抑制的靶点包括FKBP51和FKBP52)的毒理学研究结果表明，即使长时间的抑 制FKBP51与FKBP52的活性不会对人体造成非常严重的后果。由此可见，FKBP51、FKBP52是 CRPC治疗的非常有前景的药物靶点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种先导化合物及其筛选方法和在制备抗去势抵抗性前列 腺癌药物中的应用。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007] 一种先导化合物，具有式(I)的化学结构：
[0010]本发明还提供了所述先导化合物的筛选方法，包括以下步骤：
[0011] (1)高通量虚拟筛选
[0012]利用薛定谔程序包进行高通量虚拟筛选，从蛋白质结构数据库PDB分别下载 FKBP51和FKBP52的FK1结构域的晶体结构（PDB code: 305R和1N4A)，对结构进行优化、加电 荷与氢原子，选取其FK506结合口袋，利用分子对接程序Glide，从Chemdiv公司所提供的的 150多万个化合物中进行高通量虚拟筛选，利用QikProp计算所筛选的小分子先导化合物的 物化性质，如脂水分配系数QPl〇gP〇/w，按照利宾斯基规则(Lipinski' srule)筛选出对接得 分最好的前150个小分子先导化合物，并从Chemdiv公司购买小分子先导化合物；
[0013] (2)荧光淬灭实验
[0014] FKBP51/FKBP52的FK1结构域只含有一个色氨酸且恰好位于FK506结合口袋，由于 Trp在蛋白质中有很强的自发荧光，而且其发射光谱的强度与波长受到周围化学微环境的 影响，因此可以通过监测Trp发射光谱的淬灭程度来测量FK1与小分子先导化合物的结合强 弱，将纯化好的FK1蛋白浓度设定在ΙΟμΜ，小分子先导化合物终浓度100μΜ，反应体系100yL， 利用Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶标仪以96孔板格式测量小分子先导化合物对 FK1的Trp荧光的淬灭程度，激发波长设为295nm，发射波长设为335nm，每种小分子先导化合 物平行做三次，以雷帕霉素作为对照，对于荧光淬灭程度高于雷帕霉素或与其相当的小分 子先导化合物，利用PerkinElmer公司LS55荧光分光光度计进一步测量其解离常数Kd，FKl 的浓度设为1〇μΜ，小分子先导化合物的浓度在0-100μΜ之间设置梯度，每个小分子先导化合 物平行做三次，对所得数据利用Prism程序进行非线性拟合，求得解离常数Kd;
[0015] (3)蛋白的表达与纯化
[0016] 全基因合成FKBP51/FKBP52的FK1结构域(19-126)并分别克隆到pET28b载体中，用大 肠杆菌菌株BL21(DE3)或R〇SSeta(DE3)进行表达，用镍柱纯化进行粗纯化，然后用阴离子或阳 离子交换柱纯化，最后用分子筛superdex75柱纯化，同时构建不带Histag的FKBP51-FK1和 FKBP52-FK1，利用它们等电点大于8的性质，使用阳离子交换柱SPFF进行粗纯化，再用分子筛 superdex75柱纯化，纯化好的蛋白浓缩到40mg/mL后分装，用液氮速冻后置于-80 °C冰箱保存； [0017] (4)表面等离子共振(SPR)实验
[0018]利用SPR技术定量测定FK1与小分子化合物之间相互作用的强弱，用氨基偶联法将 FK1偶联到CM5芯片或利用FK1上的Histag将其偶联到NTA芯片上，选取响应较好的芯片进行 测定，以NaOH或HC1或EDTA为芯片再生条件，选取最优的再生条件进行循环测定；
[0019] (5)细胞及生化实验
[0020] 利用MTT/MTS实验（Promega)测定小分子化合物对前列腺癌细胞LNCaP、PC3及 DU145的生长抑制作用；对于能够较强抑制LNCaP，但对PC3和DU145基本不抑制的小分子先 导化合物，继续以下几种方法验证其对AR信号通路的抑制:①抽提细胞的总mRNA，用荧光定 量RT-PCR技术检测筛选的小分子化合物对?0?51、？0?52、41?及41?下游调控基因如？3八、 hK2、TMPRSS2的转录水平的影响；②用AR及PSA的特异性抗体，通过Western blot技术检测 筛选的小分子化合物对AR及下游基因 PSA在翻译水平的影响；③用慢病毒转染构建稳转 ARELuc和ARE-EGFP的LNCaP细胞系，分别用Luciferase酶活报告系统以及荧光显微镜定量 研究筛选的小分子化合物对AR转录活性的抑制作用;④共慢病毒转染构建稳转CRPC剪切 子AR-V7及AR-NTD的DU145细胞系，即DU145-V7和DU145-NTD，用荧光定量RT-PCR技术及 Western blot技术检测筛选的小分子化合物对AR活性的抑制；
[0021] (6)蛋白的结晶与结构解析
[0022]对FKBP51/FKBP52的FK1蛋白与筛得的小分子先导化合物共结晶，筛选各种结晶条 件，获得高衍射质量的晶体，利用同步辐射光源收集X射线晶体衍射数据，使用分子置换法 解析FK1与小分子先导化合物复合物的晶体结构；
[0023] (7)结构分析与分子动力学模拟
[0024] 软件分析FK1与小分子先导化合物复合物的晶体结构，比较FKBP51与FKBP52在结 合不同小分子先导化合物时结构的变化，使用Amber 14的GPU版本进行FK1-小分子先导化合 物复合物的分子动力学模拟，用mmpbsa方法计算小分子先导化合物与FK1结合的自由能，利 用Ambertools软件包中的程序分析构象变化及蛋白与小分子先导化合物的相互作用模式， Amber 14的GPU版本使用Nvidia公司的GTX970显卡进行计算，通过以上的结构分析，总结FK1 与小分子先导化合物的作用规律，为先导化合物的进一步改造提供指导；
[0025] (8)CRPC 动物实验
[0026] 具体CRPC动物模型建立:将5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成两组，其中一组为实验 组进行去雄，恢复5天后将LNCaP细胞（IX 106个)皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠 (BALB/C-nunu)，实时观察肿瘤大小生长，并且每周2-3次用数字卡尺称量小鼠体重和肿瘤 体积(宽 2X长/2)，以平均肿瘤体积作为参考，肿瘤生长8周并且肿瘤大小达到lcm3即为成功 建立的移植瘤模型;在CRPC动物模型的基础上，再分为不同的给药组，化疗药物组:多西他 赛，卡巴多赛;抑制雄激素合成药物组:阿比特龙组;与雄激素竞争性抑制AR活性药物恩杂 鲁胺；以及小分子先导化合物组，每组7只小鼠，连续28天给药1，10,或者50mg/kg的药物， 并设空白对照，通过测量肿瘤大小的变化，称取瘤重，计算抑瘤率，比较动物存活天数，及小 动物活体荧光成像系统，评估小分子先导化合物对CRPC小鼠的肿瘤的影响，观察结束后，处 死动物，取移植瘤组织，CRPC模型小鼠加药后与未加药以及PCa小鼠进行AR靶向基因 PSA和 下游相关基因如TMPRSS2表达做对比；药物作用后仍发生转移性的CRPC小鼠与未用药发生 癌转移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率进行比较。
[0027] 本发明还提供了式I化合物在制备治疗去势抵抗性前列腺癌的药物中的用途。 [0028] 本发明的有益技术效果：（1)已知的对于FKBP5UFKBP52的药物发现的主要思路是 基于FK506与雷帕霉素的分子改造，但是，基于FK506和雷帕霉素设计出的FKBP51/FKBP52的 抑制剂往往与FKBP12的结合能力更强，因此所得到的化合物可能会有很强的脱靶效应，本 发明首次以FKBP51和FKBP52蛋白为靶点，高通量虚拟筛选抗前列腺癌的新型先导化合物， 并在分子水平、细胞水平与动物个体水平验证这些先导化合物的有效性；（2)虽然CRPC显现 出对雄激素撤除的抵抗性，但它的进展通常仍依赖于AR，FKBP51、FKBP52作为协同分子伴 侣，为AR激活所必需，通过建立CRPC的细胞模型与小鼠模型，本发明首次研究了筛选得到的 先导化合物对CRPC的作用效果和机制；（3)通过解析靶蛋白与先导化合物结合的晶体结构， 分析靶蛋白与先导化合物的结合模式，总结结合规律，并通过分子动力学模拟方法，研究先 导化合物对FKBP51、FKBP52的构象的影响，为今后的药物结构改造提供了基础。
【附图说明】
[0029] 图1为FKBP51和FKBP52的结构。（A)FKBP51与FKBP52蛋白的结构域组成；（B) FKBP51的FK1结构域与FK506的相互作用方式。
[0030] 图2为FK1结构域与小分子化合物的分子对接。(A)(B)分别是对接构象分别与晶体 结构4DRK、4JFK的叠合情况。
[0031]图3为FKBP51与小分子化合物的相互作用。(A)用阳离子交换纯化获得的FKBP51的 FK1结构域，FK1的分子量约为14KDa;(B)购买的150种小分子化合物对FK1的荧光淬灭实验， 红色为正对照雷帕霉素(a)，绿色为不含小分子化合物的buffer(b)。
[0032] 图4为FKBP51蛋白分子筛(FPLC)纯化结果。（A)用HiLoad 16/60Superdex75柱子凝 胶过滤纯化获得的FKBP51蛋白；（B) 15 % SDS-PAGE的FKBP51电泳图。
[0033]图5为小分子先导化合物与FKBP51浓度依赖的荧光淬灭实验。分别用10,20,50， 80，100μπι小分子先导化合物浓度与20ymFKBP51发生荧光淬灭反应得到结合曲线图，其中， compound5为本发明的小分子化合物。
[0034]图6为小分子先导化合物筛选的技术路线图。
[0035]图7为小分子先导化合物对CRPC的作用及机理的技术路线图。
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体实施例与【附图说明】对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下 实施例。
[0037] 实施例1
[0038]先导化合物的化学结构：
[0041] 1、具有式(I)化学结构的先导化合物的高通量虚拟筛选方法
[0042] 利用薛定谔程序包进行，从蛋白质结构数据库roB分别下载FKBP51和FKBP52的FK1 结构域的晶体结构（PDB code:305R和 1N4A)，使用Prime，QSite，Liasion and MacroModel 等程序对结构进行优化、加电荷与氢原子，选取其FK506结合口袋，利用分子对接程序 G1 ide，从Chemdiv公司所提供的的150多万个化合物中进行高通量虚拟筛选，筛选在4核CPU 的服务器上进行，每天大约可以筛选10万个化合物，利用QikProp计算所筛选的小分子先导 化合物的物化性质如脂水分配系数QPl〇gP〇/w等，按照利宾斯基规则(Lipinski' s rule)筛 选出docking-score最好的前150个小分子先导化合物。利宾斯基规则包括:①化合物的分 子量小于500Da;②化合物结构中的氢键给体(包括羟基、氨基等）的数量不超过5个;③化合 物中氢键受体的数量不超过10个;④化合物的脂水分配系数的对数值(logP)在-2到5之间。 符合利宾斯基规则的化合物有更好的药代动力学特性，在代谢过程中有更好的生物利用 度，易于成为口服药。小分子先导化合物在Chemdiv公司购买。
[0043] 2、荧光淬灭实验
[0044] FKBP51/FKBP52的FK1结构域只含有一个色氨酸且恰好位于FK506结合口袋，由于 Trp在蛋白质中有很强的自发荧光，而且其发射光谱的强度与波长受到周围化学微环境的 影响，因此可以通过监测Trp发射光谱的淬灭程度来测量FK1与小分子先导化合物的结合强 弱，将纯化好的FK1蛋白浓度设定在10μΜ，小分子先导化合物终浓度100μΜ，反应体系100yL， 利用Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶标仪以96孔板格式测量小分子先导化合物对 FK1的Trp荧光的淬灭程度，激发波长设为295nm，发射波长设为335nm，每种小分子先导化 合物平行做三次，以雷帕霉素作为对照，对于荧光淬灭程度高于雷帕霉素或与其相当的小 分子先导化合物，利用PerkinElmer公司LS55荧光分光光度计进一步测量其解离常数Kd， FK1的浓度设为10μΜ，小分子先导化合物的浓度在0-100μΜ之间设置梯度，每个小分子先导 化合物平行做三次，对所得数据利用Prism程序进行非线性拟合，求得解离常数Kd。
[0046] 3、蛋白的表达与纯化
[0047] 全基因合成FKBP51/FKBP52的FK1结构域（19-126)并分别克隆到pET28b载体中，用 大肠杆菌菌株BL21(DE3)或R〇SSeta(DE3)进行表达，用镍柱纯化进行粗纯化，然后用阴离子 或阳离子交换柱纯化，最后用分子筛superdeX75柱纯化。同时构建不带Histag的FKBP51-FK1和FKBP52-FK1，利用它们等电点较高（大于8)的性质，使用阳离子交换柱SPFF进行粗纯 化，再用分子筛superdex75柱纯化。纯化好的蛋白浓缩到40mg/mL后分装，用液氮速冻后置 于-80°C冰箱保存。
[0048] 4、表面等离子共振(SPR)实验
[0049]我们利用SPR技术更精确的定量FK1与小分子化合物之间相互作用的强弱。用氨基 偶联法将FK1偶联到CM5芯片或利用FK1上的Histag将其偶联到NTA芯片上，最后选取响应较 好的芯片进行测定，选择各种不同的芯片再生条件，如Na0H、HCl、EDTA等，最后选取最优的 再生条件。
[0050] 5、细胞及生化实验
[0051 ] 利用MTT/MTS实验（Promega)测定小分子化合物对前列腺癌细胞LNCaP、PC3及 DU145的生长抑制作用。对于能够较强抑制LNCaP，但对PC3和DU145基本不抑制的小分子先 导化合物，继续以下几种方法验证其对AR信号通路的抑制:①抽提细胞的总mRNA，用荧光 定量RT-PCR技术检测筛选的小分子化合物对?0?51、？0?52)1?及41?下游调控基因如？3八、 hK2、TMPRSS2等的转录水平的影响；②用AR及PSA的特异性抗体，通过Western blot技术检 测筛选的小分子化合物对AR及下游基因 PSA在翻译水平的影响；③用慢病毒转染构建稳转 ARELuc和ARE-EGFP的LNCaP细胞系，分别用Luciferase酶活报告系统以及荧光显微镜定量 研究筛选的小分子化合物对AR转录活性的抑制作用;④共慢病毒转染构建稳转CRPC剪切子 AR-V7及AR-NTD的DU145细胞系，即DU145-V7和DU145-NTD，用荧光定量RT-PCR技术及 Western blot技术检测筛选的小分子化合物对AR活性的抑制。
[0052] 6、蛋白的结晶与结构解析
[0053]我们对FKBP51/FKBP52的FK1蛋白尝试与筛得的小分子先导化合物共结晶，筛选各 种结晶条件（如Hampton公司的ScreenI&ScreenII，SaltRX，Index，PEGion和MiTeGen公司的 JBScreen Classic等条件），尝试并改进各种沉淀剂、缓冲剂和添加剂，以获得高衍射质量 的晶体。利用同步辐射光源收集X射线晶体衍射数据，利用HKL2000，CCP4及Phenix等软件， 使用分子置换法解析FK1与小分子先导化合物复合物的晶体结构。
[0054] 7、结构分析与分子动力学模拟
[0055 ]使用Pymo 1、L i gp 1 〇 t等软件分析FK1与小分子先导化合物复合物的晶体结构，比较 FKBP51与FKBP52在结合不同小分子先导化合物时结构的变化，使用Amberl4的GPU版本进行 FK1-小分子先导化合物复合物的分子动力学模拟，用mmpbsa方法计算小分子先导化合物与 FK1结合的自由能，利用Ambertools软件包中的程序分析构象变化，蛋白与小分子先导化合 物的相互作用模式等，Amberl4的GPU版本（即CUDA版本)使用Nvidia公司的GTX970显卡进 行计算，经过我们的前期测试，发现其计算能力相当于64核的计算机集群。通过以上的结构 分析，总结FK1与小分子先导化合物的作用规律，为先导化合物的进一步改造提供指导。
[0056] 8、CRPC动物实验
[0057] 具体CRPC动物模型建立:将5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成两组，其中一组为实验 组进行去雄，恢复5天后将LNCaP细胞（IX 106个)皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠 (BALB/C-nunu)，实时观察肿瘤大小生长，并且每周2-3次用数字卡尺称量小鼠体重和肿瘤 体积（宽2X长/2)，以平均肿瘤体积作为参考。肿瘤生长8周左右并且肿瘤大小达到lcm3即 为成功建立的移植瘤模型。在CRPC动物模型的基础上，再分为不同的给药组。化疗药物组： 多西他赛，卡巴多赛;抑制雄激素合成药物组:阿比特龙组;与雄激素竞争性抑制AR活性药 物恩杂鲁胺；以及小分子先导化合物组，每组7只小鼠，连续28天给药1，10,或者50mg/kg的 药物，并设空白对照，通过测量肿瘤大小的变化，称取瘤重，计算抑瘤率，比较动物存活天 数，及小动物活体荧光成像系统，评估小分子先导化合物对CRPC小鼠的肿瘤的影响，观察结 束后，处死动物，取移植瘤组织，CRPC模型小鼠加药后与未加药以及PCa小鼠进行AR靶向基 因 PSA和下游相关基因如TMPRSS2表达做对比;药物作用后仍发生转移性的CRPC小鼠与未用 药发生癌转移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率进行比较。
【主权项】
1. 一种具有式α)化学结构的先导化合物在制备前列腺癌肿瘤药物中的用途，2. 权利要求1中所述先导化合物在制备治疗去势抵抗性前列腺癌药物中的用途。3. 权利要求1中所述先导化合物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 高通量虚拟筛选 利用薛定谔程序包进行高通量虚拟筛选，从蛋白质结构数据库PDB分别下载FKBP51和 FKBP52的FK1结构域的晶体结构（PDB code:305R和1Ν4Α)，对结构进行优化、加电荷与氢原 子，选取其FK506结合口袋，利用分子对接程序G1 ide，从Chemdi v公司所提供的的150多万个 化合物中进行高通量虚拟筛选，利用QikProp计算所筛选的小分子先导化合物的物化性质， 如脂水分配系数QPl〇gP〇/w，按照利宾斯基规则(Lipinski'srule)筛选出对接得分最好的 前150个小分子先导化合物，并从Chemdiv公司购买小分子先导化合物； (2) 荧光淬灭实验 FKBP51/FKBP52的FK1结构域只含有一个色氨酸且恰好位于FK506结合口袋，由于Trp在 蛋白质中有很强的自发荧光，而且其发射光谱的强度与波长受到周围化学微环境的影响， 因此可以通过监测Trp发射光谱的淬灭程度来测量FK1与小分子先导化合物的结合强弱，将 纯化好的FK1蛋白浓度设定在ΙΟμΜ，小分子先导化合物终浓度100μΜ，反应体系100yL，利用 Thermo公司的Varioskan Flash多功能酶标仪以96孔板格式测量小分子先导化合物对FK1 的Trp荧光的淬灭程度，激发波长设为295nm，发射波长设为335nm，每种小分子先导化合物 平行做三次，以雷帕霉素作为对照，对于荧光淬灭程度高于雷帕霉素或与其相当的小分子 先导化合物，利用PerkinElmer公司LS55荧光分光光度计进一步测量其解离常数Kd，FKl的 浓度设为1〇μΜ，小分子先导化合物的浓度在0-100μΜ之间设置梯度，每个小分子先导化合物 平行做三次，对所得数据利用Prism程序进行非线性拟合，求得解离常数Kd; (3) 蛋白的表达与纯化 全基因合成FKBP51/FKBP52的FK1结构域（19-126)并分别克隆到pET28b载体中，用大肠 杆菌菌株BL21(DE3)或R〇SSeta(DE3)进行表达，用镍柱纯化进行粗纯化，然后用阴离子或阳 离子交换柱纯化，最后用分子筛superdex75柱纯化，同时构建不带Histag的FKBP51-FK1和 FKBP52-FK1，利用它们等电点大于8的性质，使用阳离子交换柱SPFF进行粗纯化，再用分子 筛superdex75柱纯化，纯化好的蛋白浓缩到40mg/mL后分装，用液氮速冻后置于-80°C冰箱 保存； (4) 表面等离子共振(SPR)实验 利用SPR技术定量测定FK1与小分子化合物之间相互作用的强弱，用氨基偶联法将FK1 偶联到CM5芯片或利用FK1上的Histag将其偶联到NTA芯片上，选取响应较好的芯片进行测 定，以NaOH或HC1或EDTA为芯片再生条件，选取最优的再生条件进行循环测定； (5) 细胞及生化实验 利用MTT/MTS实验(Promega)测定小分子化合物对前列腺癌细胞LNCaP、PC3及DU145的 生长抑制作用；对于能够较强抑制LNCaP，但对PC3和DU145基本不抑制的小分子先导化合 物，继续以下几种方法验证其对AR信号通路的抑制:①抽提细胞的总mRNA，用荧光定量RT-PCR技术检测筛选的小分子化合物对?0?51、？0?52、六1?及41?下游调控基因如？34、111(2、 TMPRSS2的转录水平的影响；②用AR及PSA的特异性抗体，通过Western blot技术检测筛选 的小分子化合物对AR及下游基因 PSA在翻译水平的影响;③用慢病毒转染构建稳转ARELuc 和ARE-EGFP的LNCaP细胞系，分别用Luciferase酶活报告系统以及荧光显微镜定量研究筛 选的小分子化合物对AR转录活性的抑制作用;④共慢病毒转染构建稳转CRPC剪切子AR-V7 及AR-NTD的DU145细胞系，即DU145-V7和DU145-NTD，用荧光定量RT-PCR技术及Western b 1 ot技术检测筛选的小分子化合物对AR活性的抑制； (6) 蛋白的结晶与结构解析 对FKBP51/FKBP52的FK1蛋白与筛得的小分子先导化合物共结晶，筛选各种结晶条件， 获得高衍射质量的晶体，利用同步辐射光源收集X射线晶体衍射数据，使用分子置换法解析 FK1与小分子先导化合物复合物的晶体结构； (7) 结构分析与分子动力学模拟 软件分析FK1与小分子先导化合物复合物的晶体结构，比较FKBP51与FKBP52在结合不 同小分子先导化合物时结构的变化，使用Amberl4的GPU版本进行FK1-小分子先导化合物复 合物的分子动力学模拟，用mmpbsa方法计算小分子先导化合物与FK1结合的自由能，利用 Ambertools软件包中的程序分析构象变化及蛋白与小分子先导化合物的相互作用模式， Amber 14的GPU版本使用Nvidia公司的GTX970显卡进行计算，通过以上的结构分析，总结FK1 与小分子先导化合物的作用规律，为先导化合物的进一步改造提供指导； (8) CRRC动物实验 具体CRPC动物模型建立:将5-9周的雄性免疫缺陷小鼠分成两组，其中一组为实验组进 行去雄，恢复5天后将LNCaP细胞（IX 106个)皮下注射于完整或去雄的免疫缺陷小鼠（BALB/ C-nunu)，实时观察肿瘤大小生长，并且每周2-3次用数字卡尺称量小鼠体重和肿瘤体积 (宽2X长/2)，以平均肿瘤体积作为参考，肿瘤生长8周并且肿瘤大小达到lcm 3即为成功建立 的移植瘤模型;在CRPC动物模型的基础上，再分为不同的给药组，化疗药物组:多西他赛，卡 巴多赛;抑制雄激素合成药物组:阿比特龙组;与雄激素竞争性抑制AR活性药物恩杂鲁胺； 以及小分子先导化合物组，每组7只小鼠，连续28天给药1，10,或者50mg/kg的药物，并设空 白对照，通过测量肿瘤大小的变化，称取瘤重，计算抑瘤率，比较动物存活天数，及小动物活 体荧光成像系统，评估小分子先导化合物对CRPC小鼠的肿瘤的影响，观察结束后，处死动 物，取移植瘤组织，CRPC模型小鼠加药后与未加药以及RCa小鼠进行AR靶向基因 PSA和下游 相关基因如TMPRSS2表达做对比；药物作用后仍发生转移性的CRPC小鼠与未用药发生癌转 移CRPC小鼠以及PCa小鼠成活率进行比较。
【文档编号】A61P13/08GK105949195SQ201610300718
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】王志平, 何永兴, 武丹
【申请人】兰州大学