与植物开花时间相关的蛋白及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明公开了一种与植物开花时间相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明蛋白质，命名为GmNMHC5蛋白，获自大豆(Glycine max(L.)Merrill)，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物开花时间相关的由序列1衍生的蛋白质。编码所述GmNMHC5蛋白的基因(GmNMHC5基因)也属于本发明的保护范围。GmNMHC5蛋白及其编码基因具有促进植物开花时间提前、缩短童期的作用。本发明对于植物育种具有重大的应用价值。
【专利说明】
与植物开花时间相关的蛋白及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明生物技术领域，尤其涉及一种与植物开花时间相关的蛋白及其编码基因与 应用。
【背景技术】
[0002] 大豆是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物，在人类生活和国际农产品 贸易中占有举足轻重的地位，在培肥地力、改良土壤、轮作倒茬等耕作方面发挥着不可替代 的作用。开花是植物由营养生长转向生殖生长的重要过程，是植物生长的一个最主要的阶 段。作为典型的短日照作物，大豆的开花过程受到光周期的严格调控。大豆开花相关基因的 克隆以及功能研究对指导大豆正常的生长，提高作物产量具有重要的意义。
[0003] 对模式植物个体发育的研究表明，植物的开花过程主要受四个途径调控:光周期 途径（photoperiod pathway)、春化途径（vernalization pathway)、自发途径（autonomous pathway)和赤霉素途径(GA pathway)，这四个途径构成的调控网络对植物开花相关基因的 表达严格控制。相关研究表明，长日植物(如拟南芥)和短日植物(如水稻)开花的分子途径 在进化上是保守的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种与植物开花时间相关的蛋白及其编码基因与应用。
[0005] 本发明蛋白质，命名为GmNMHC5蛋白，获自大豆(Glycine max(L. )Merrill)，是如 下(a)或(b):
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与植物开花时间相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0008] 为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0009] 表1标签的序列
[0012]上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个 氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端 连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0013] 编码所述GmNMHC5蛋白的基因(GmNMHC5基因）也属于本发明的保护范围。
[0014] 所述GmNMHC5基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0015] 1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物开花时间相关蛋白的DNA分 子；
[0017] 3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96%、至少具有97 %、至少具有98%或至少 具有99%以上同源性且编码植物开花时间相关蛋白的DNA分子。
[0018] 上述严格条件可为在6XSSC、0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、 0 · 1 % SDS和 1 X SSC、0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0019] 含有所述GmNMHC5基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本 发明的保护范围。
[0020] 可用现有的植物表达载体构建含有GmNMHC5基因的重组表达载体。所述植物表达 载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外 源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的 DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3 '端。使用GmNMHC5基因构 建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动 子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用GmNMHC5基因构建重组表 达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相 同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是 天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转 基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物 中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗 化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以性 状筛选转化植株。
[0021] 所述表达盒中，可由组成型启动子启动GmNMHC5基因的表达。所述组成型启动子具 体可为35S启动子。
[0022] 所述重组表达载体具体可为在载体pGFPGUSplus的多克隆位点插入GmNMHC5基因 得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将载体pGFP⑶Splus的Xbal和SacI酶切位点 之间的小片段取代为GmNMHC5基因得到的重组质粒。
[0023] 本发明还保护GmNMHC5蛋白的应用，为如下（cl)至(c4)中的至少一种：
[0024] (cl)调控植物的花期；
[0025] (c2)促进植物的花期提前；
[0026] (c3)调控植物的开花时间；
[0027] (c4)促进植物的开花时间提前。
[0028] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0029]所述双子叶植物可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
[0030]本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将GmNMHC5基因导入目的植物，得到 转基因植物;所述转基因植物满足如下(dl)至(d4)中的至少一种表型：
[0031 ] (dl)开花早于所述目的植物；
[0032] (d2)花期早于所述目的植物；
[0033] (d3)营养生长阶段短于所述目的植物；
[0034] (d4)进入生殖生长阶段早于所述目的植物。
[0035] GmNMHC5基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述 重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农 杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0036] 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0037]所述双子叶植物可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
[0038] 本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤(el)和/或(el):
[0039] (e 1)通过增加目的植物中GmNMHC5蛋白的活性，获得具有如下性状的植物:开花早 于所述目的植物和/或花期早于所述目的植物和/或营养生长阶段短于所述目的植物和/或 进入生殖生长阶段早于所述目的植物；
[0040] (e2)通过促进目的植物中GmNMHC5基因的表达，获得具有如下性状的植物:开花早 于所述目的植物和/或花期早于所述目的植物和/或营养生长阶段短于所述目的植物和/或 进入生殖生长阶段早于所述目的植物。
[0041 ]所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0042]所述双子叶植物可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
[0043] "促进目的植物中GmNMHC5基因的表达"的实现方式可为如下(Π )或(f2)或(f3):
[0044] (Π )将GmNMHC5基因导入目的植物；
[0045] (f2)引入强启动子和/或增强子；
[0046] (f 3)本领域内的其它常见方法。
[0047] 本发明还保护GmNMHC5蛋白、GmNMHC5基因或以上任一所述重组表达载体或表达盒 在植物育种中的应用。所述植物育种的目的为培育花期提前的植物。所述植物为单子叶植 物或双子叶植物。所述双子叶植物可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。
[0048] 本发明从大豆中发现了GmNMHC5蛋白及其编码基因，将其导入出发植物，得到转基 因植物，该转基因植物的开花时间比野生植株提前。因此，GmNMHC5蛋白及其编码基因具有 促进植物开花时间提前的作用。本发明对于植物育种具有重大的应用价值。
【附图说明】
[0049 ] 图1为V3期和R3期GmNMHC5基因在不同组织的表达水平。
[0050] 图2为性状鉴定中的植株照片。
[0051] 图3为性状鉴定中的开花时间以及开花时的莲座叶片数。
【具体实施方式】
[0052]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0053] 载体pGFPGUSplus:参考文献：Claudia E.Vickers.pGFPGUSPlus,a new binary vector for gene expression studies and optimising transformation systems in 卩1已]^8.13;[(^6(31111011^1:1:，2007年29期。
[0054] 根癌农杆菌GV3101:天根生化科技有限公司。
[0055] 哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Col-Ο):参考文献:郭晓丽.Columbia型拟南芥愈 伤组织培养研究.河南农业科学，2009年01期。
[0056]实施例l、GmNMHC5蛋白及其编码基因的获得
[0057] 通过大量序列分析、比对、读码框识别和预实验验证，从大豆中发现一个新蛋白， 将其命名为GmNMHC5蛋白。
[0058] GmNMHC5蛋白如序列表的序列1所示（由241个氨基酸残基组成）。
[0059] 将编码GmNMHC5蛋白的基因命名为GmNMHC5基因，其开放阅读框如序列表的序列2 所示（726bp)。
[0060] 实施例2、GmNMHC5蛋白的表达谱
[0061] 选择自贡冬豆(光周期敏感品种）为实验材料，短日照处理，选取具有代表性的营 养生长阶段(V3期)及生殖生长阶段(R3期）的叶片、茎尖(V3期的茎尖在R3期转变为荚）、根 和根瘤为材料。
[0062] 分别提取各个材料的总RNA，反转录为cDNA。应用Real-time RT-PCR方法，以 GmActin为内标基因，检测GmNMHC5基因在大豆体内的组织特异性表达情况。
[0063] 组织表达分析结果如图1所示。营养生长阶段，GmNMHC5基因主要在根和根瘤中表 达，尤其在根中的表达量最高。生殖生长阶段，GmNMHC5基因在豆荚中也有一定的表达。结果 表明，GmNMHC5基因不仅与根系发育有关，而且与生殖生长和花荚发育有关。
[0064] 实施例3、转基因植物的获得和鉴定 [0065] 一、重组质粒的构建
[0066] 1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0067] 2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得 到PCR扩增产物。
[0068] Fl:5 '-TCTAGAATGGGGAGAGGTAAGATTGCG-3'；
[0069] Rl:5'-GAGCTCCTAATGCAGCTGCAATCCGAGTTT-3'。
[0070] 3、取载体pGFP⑶Splus，用限制性内切酶Xbal和SacI双酶切，回收约13000bp的载 体骨架。
[0071] 4、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Xbal和SacI双酶切，回收酶切产 物。
[0072] 5、将步骤3的载体骨架和步骤4的酶切产物连接，得到重组质粒pGUS-GmNMHC5。
[0073] 根据测序结果，对重组质粒pCTS-GmNMHC5进行结构描述如下:将载体pGFPGUSplus 的Xbal和SacI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列2所示的双链DNA分子。重组质 粒pGUS-GmNMHC5中，由35S启动子启动GmNMHC5基因的表达，由⑶S作为阳性转化事件的筛选 记 D
[0074]二、转基因植物的获得
[0075] 1、将重组质粒pGUS-GmNMHC5导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
[0076] 2、取步骤1得到的重组农杆菌，用5g/100ml的蔗糖水溶液悬浮，得到0D6Q() nm值为0.5 的菌液，最后每l〇〇ml菌液加入50μ1 Silwet L-77,得到侵染液。
[0077] 3、取步骤2得到的侵染液，采用沾花浸染法对哥伦比亚生态型拟南芥进行遗传转 化，然后正常培养并收获种子(T1代种子）。
[0078] 4、取步骤3收获的种子，播种于含有含有50mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上进行 培养，筛选到10株叶片展开、长势良好的抗性植株(T1代植株）。收获抗性植株的种子(T2代 种子）。
[0079] 5、取步骤4收获的种子，播种于含有含有50mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上进行 培养，筛选叶片展开、长势良好的抗性植株(T2代植株）。收获抗性植株的种子(T3代种子）。
[0080] 6、取步骤5收获的种子，正常播种并培养，得到T3代植株。
[0081] 7、分别从T1代植株、T2代植株和T3代植株中取样，提取总RNA并反转录为cDNA，采 用F2和R2组成的引物对进行PCR鉴定(如果得到441bp的扩增产物，鉴定结果为阳性;否则， 鉴定结果为阴性）。在T3代，得到稳定遗传的转GmNMHC5基因拟南芥纯合株系。
[0082] F2:5，-ACCCATCACCTCATGAATCCG-3，；
[0083] R2:5 '-AGACTGTGGCTGACTTAGCTG-3 '。
[0084]三、转空载体植物的获得
[0085] 用载体pGFP⑶Splus代替重组质粒pGUS-GmNMHC5,进行步骤二，得到转空载体拟南 芥。
[0086]四、性状鉴定
[0087]待测样本分别如下：株系1(转Gm匪HC5基因拟南芥纯合株系）的T3代种子、株系2 (转GmNMHC5基因拟南芥纯合株系）的T3代种子、转空载体拟南芥的T3代种子、哥伦比亚生态 型拟南芥。
[0088] 1、取种子，在无菌水中4°C浸泡72h。
[0089] 2、分组处理
[0090]长日照处理组：完成步骤1后，取种子，播种于装有育苗基质的育苗穴盆中，在21 °C、16h光照/8h黑暗的条件下进行培养；
[0091]短日照处理组:完成步骤1后，取种子，播种于装有育苗基质的育苗穴盆中，在21 °C、8h光照/16h黑暗的条件下进行培养；
[0092 ]育苗基质是将等体积的土和輕石混合得到的。育苗穴盆的尺寸为7cm X 7cm X 8cm 〇
[0093] 持续进行表型观察，记录开花时间（以肉眼可见拟南芥花序的时间为开花时间）以 及开花时的莲座叶片数。
[0094]进行三次重复试验，每次重复试验中每种待测样本统计15株植株，结果取平均值。 [0095] 长日照处理下，播种30天后，植株的照片见图2A。
[0096] 短日照处理下，播种40天后，植株的照片见图2B。
[0097] 每种待测样本的开花时间以及开花时的莲座叶片数见图3。
[0098] 在长日照条件下:株系1的开花时间为播种后的第25天，开花时莲座叶片数为8片； 株系2的开花时间为播种后的第26天，开花时莲座叶片数为9片；哥伦比亚生态型拟南芥的 开花时间为播种后的第33天，开花时莲座叶片数为14片;转空载体拟南芥的开花时间为播 种后第34天，开花时莲座叶片数平均15片。在短日照条件下:株系1的开花时间为播种后的 第33天，开花时莲座叶片数为9片;株系2的开花时间为播种后的第34天，开花时莲座叶片数 为10片;哥伦比亚生态型拟南芥的开花时间为播种后的第48天，开花时莲座叶片数为23片； 转空载体拟南芥的开花时间为播种后第49天，开花时莲座叶片数平均24片。
[0099]以上结果表明，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，转GmNMHC5基因拟南芥的开花明显 提前，即GmNMHC5蛋白具有促进植物开花的功能。
【主权项】
1. 一种蛋白质，是如下(a)或(b): (a) 由序列表中序列1所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 与植物开花时间相关的由序列1衍生的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白质的基因。3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子： 1) 编码区如序列表中序列2所示的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物开花时间相关蛋白的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具 有99%以上同源性且编码植物开花时间相关蛋白的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5. 权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(cl)至(c4)中的至少一种： (cl)调控植物的花期； (c2)促进植物的花期提前； (c3)调控植物的开花时间； (c4)促进植物的开花时间提前。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。7. -种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物，得到转基 因植物;所述转基因植物满足如下(dl)至(d4)中的至少一种表型： (dl)开花早于所述目的植物； (d2)花期早于所述目的植物； (d3)营养生长阶段短于所述目的植物； (d4)进入生殖生长阶段早于所述目的植物。8. -种植物育种方法，包括如下步骤(el)和/或(el): (el)通过增加目的植物中权利要求1所述蛋白质的活性，获得具有如下性状的植物:开 花早于所述目的植物和/或花期早于所述目的植物和/或营养生长阶段短于所述目的植物 和/或进入生殖生长阶段早于所述目的植物； (e2)通过促进目的植物中权利要求2或3所述基因的表达，获得具有如下性状的植物： 开花早于所述目的植物和/或花期早于所述目的植物和/或营养生长阶段短于所述目的植 物和/或进入生殖生长阶段早于所述目的植物。9. 权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述基因、权利要求2所述基因、权利要求4所述重 组表达载体或权利要求4所述表达盒在植物育种中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于:所述植物育种的目的为培育花期提前的植 物。
【文档编号】C07K14/415GK105949295SQ201610561640
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】吴存祥, 王志莉, 冯永君, 韩天富, 刘薇, 韩祥东, 侯文胜, 孙 石, 蒋炳军
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所