清洗卵子或受精卵表面的方法
【专利摘要】本发明涉及一种清洗卵子或受精卵表面的方法。具体地，本发明公开的方法包括步骤(1)将未经处理的卵子或未经处理的受精卵置于第一培养皿中，其中，所述第一培养皿经标准细胞培养表面处理且含有第一培养液，所述第一培养液含蛋白；然后加入透明质酸酶处理所述卵子或受精卵，从而得到经第一次处理的卵子或受精卵；(2)将经第一次处理的卵子或受精卵移入第二培养皿中，其中，所述第二培养皿未经表面处理且含有第二培养液，所述第二培养液不含蛋白；然后用带有第三培养液的棒状工具拨动所述卵子或受精卵，其中，所述第三培养液含蛋白；使颗粒细胞和/或多余精子脱离卵子或受精卵表面，从而被彻底清除干净。
【专利说明】
清洗卵子或受精卵表面的方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生殖医学领域，具体地，本发明涉及一种清洗卵子或受精卵表面的方法。
【背景技术】
[0002] 试管婴儿技术是一项对抗不孕不育的强大技术手段。但因各种原因，从胚胎植入子宫到胎儿出生的成功率不高(通常只有40%左右）。除母亲健康原因外，受精卵质量是导致胚胎发育失败的重要原因之一。
[0003] 早期，在试管婴儿技术过程中，仅依靠显微镜下的形态观察，从多个胚胎中挑选2-3个相对“正常”者植入母亲子宫。而显微镜下的形态正常并无法反映染色体是否正常。错误地挑选形态正常而染色体异常的胚胎植入母亲子宫导致了很多试管婴儿受孕失败。
[0004] 近年以来，人们建立了一些技术（统称为Preimplantation Genetic Screen，PGS) 对体外培养胚胎的染色体状态进行检测，以筛选染色体正常的胚胎植入母亲子宫，从而提高受孕成功率。各种PGS方法检测所需的生物样本都是从体外培养胚胎中获得的一个至数个细胞，通过对这写细胞的检测可反映整个胚胎的染色体是否正常。胚胎活检有极体活检、 卵裂球活检和囊胚滋养层细胞活检。PGS检测通常是活检卵裂球或囊胚滋养层细胞。但是， 越来越多的研究表明卵裂期活检的安全性受到质疑，因此囊胚滋养层细胞活检逐渐成为 PGS胚胎活检的主流。
[0005] 当受精卵在体外培养液中生长发育5天时，胚胎是由约80-100个细胞组成的囊状结构，称为囊胚。此时，可在显微镜下，用毛细玻璃管吸取一个至数个滋养层细胞进行检测。 已有研究表明，胚胎早期体外发育过程中（第1-5日）会将少量DNA释放入培养液(囊胚培养液）中。尽管对此机制尚不明了，但囊胚培养液中存在着胚胎来源的DNA提供了对胚胎染色体状态进行无损检测的物质基础。我们的前期发明《一种利用囊胚培养液检测胚胎染色体异常的方法》(CN105368936A)正是建立了一套达成此目的技术方法(NICS)。但是，NICS方法容易受到一些常规试管婴儿体外胚胎培养过程中所忽略因素的干扰。
[0006] 第一代试管婴儿(IVF)使用大量精子对卵子进行体外受精。然而对每个卵子而言， 只有一个精子能够有效受精，使卵子成为受精卵，其它多余的无效精子会粘附在受精卵表面，它们死亡后释放入体外培养液中，因此，父源DNA会对后续的NICS检测形成干扰。另外， 从母体提取的卵细胞表面不可避免地会附着大量母体来源的颗粒细胞，这些颗粒细胞向培养液中释放，因此，母源DNA也会对NICS检测形成干扰。
[0007] 尽管二代试管婴儿采用了卵胞浆内单精子注射方法(ICSI)对卵子进行体外受精， 避免了多余精子造成的污染问题。并且，体外受精前会对卵子表面附着的颗粒细胞做常规清洗以部分暴露卵子表面，为精子注射针提供通道，但常规清洗后的卵子表面仍会粘附有较多的颗粒细胞，对后续的NICS检测形成干扰。
[0008] 因此，本发明建立了将卵子(针对ICSI)或受精卵(针对IVF)表面的颗粒细胞和/或多余精子彻底清除干净，以避免干扰NICS检测的技术方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是建立在试管婴儿（IVF及ICSI)过程中彻底清除卵子表面的颗粒细胞和/或多余精子，使后续的胚胎培养液适用于NICS检测的技术方法。
[0010] 在本发明的第一方面中，提供了一种清洗卵子或受精卵表面的方法，其特征在于， 包括步骤：
[〇〇11] (1)将未经处理的卵子或未经处理的受精卵置于第一培养皿中，其中，所述第一培
养皿经标准细胞培养表面处理且含有第一培养液，所述第一培养液含蛋白；
[0012] 然后加入透明质酸酶处理所述卵子或受精卵，从而得到经第一次处理的卵子或受精卵；
[0013] (2)将经第一次处理的卵子或受精卵移入第二培养皿中，其中，所述第二培养皿未经表面处理且含有第二培养液，所述第二培养液不含蛋白；
[0014] 然后用带有第三培养液的棒状工具拨动所述卵子或受精卵，其中，所述第三培养液含蛋白；使颗粒细胞和/或多余精子脱离卵子或受精卵表面，从而被彻底清除干净。
[0015] 在另一优选例中，所述带有第三培养液的棒状工具是指棒状工具上蘸有第三培养液。
[0016] 在另一优选例中，所述棒状工具为棒或棍。
[0017] 在另一优选例中，所述棒状工具为玻璃的、塑料的等任何适合的材料制成的。
[0018] 在另一优选例中，所述蛋白为血清蛋白。
[0019] 在另一优选例中，所述未经处理的卵子是从母体取出2-3小时后的卵子。
[0020] 在另一优选例中，所述未经处理的受精卵是在体外受精4小时或16-20小时后的受精卵。
[0021] 在另一优选例中，所述第一培养液模拟人输卵管液的成分，且用HEPES做缓冲成份。
[〇〇22] 在另一优选例中，所述第一培养液可参照Quinn等人于1984年公开发表(《生育与不孕》（Fertil Steril ·) 1984;41:202或 1985;44:493 ·)的文献制备。
[〇〇23]该培养液用HEPES做缓冲成份，在空气中可较长时间地保持pH值的稳定性。培养时无需二氧化碳气体环境。
[〇〇24] 该培养液可从各商业公司（如，SAGE media)购买，也可以自行配制。
[0025]在另一优选例中，所述第一培养液为IM培养液。
[〇〇26] 在另一优选例中，所述第一培养皿为Falcon 353037培养皿、康宁公司的430166培养皿或塞默飞公司的150288培养皿。
[〇〇27]在另一优选例中，所述第一培养皿为任意的市售的经标准细胞培养表面处理的细胞培养皿。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形状或尺寸的。
[0028]在另一优选例中，所述透明质酸酶可从任何细胞培养试剂供应商购得。
[〇〇29] 在另一优选例中，步骤(1)中，所述处理的时间为10-60秒;较佳地，为20-40秒。 [〇〇3〇]在另一优选例中，所述第二培养液的成分与第一培养液相同，区别仅在于第二培养液不含有蛋白。
[0031]在另一优选例中，所述第二培养液为M-IM培养液。
[0032] 在另一优选例中，所述第二培养皿为Falcon 351006培养皿、康宁公司的430589培养皿或塞默飞公司的150340培养皿。
[〇〇33]在另一优选例中，所述第二培养皿为任意的市售的未经表面处理的细胞表面膜。 可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形状或尺寸的。
[〇〇34]在另一优选例中，所述第三培养液的成分与第一培养液相同，区别仅在于第三培养液不含缓冲成分HEPES。
[〇〇35]在另一优选例中，所述第三培养液可参照Quinn等人于1984年公开发表(《生育与不孕》（Fertil Steril ·) 1984;41:202或 1985;44:493 ·)的文献制备。
[〇〇36]所述第三培养液与第一培养液的区别在于其中没有缓冲成份(HEPES)，所以必须在5 %二氧化碳环境(二氧化碳培养箱中）下使用。
[〇〇37] 该培养液可从各商业公司（如，SAGE media)购买，也可以自行配制。
[〇〇38]在另一优选例中，所述第三培养液为GM培养液。
[0039] 在另一优选例中，所述颗粒细胞和/或多余精子从卵子或受精卵表面脱离后附于培养皿底部表面。
[0040] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附图说明】
[0041] 图1显示了刚从母体中取出的未经处理的卵子，表面附着有大量颗粒细胞。
[0042] 图2显示了经步骤3清洗处理过的卵子，其表面颗粒细胞附着明显减少，但仍有颗粒细胞附着。
[〇〇43]图3显示了操作过程中颗粒细胞脱离卵子，附着于培养皿底。
[〇〇44]图4显示了经步骤3和步骤4清洗处理过的卵子，其表面颗粒细胞被彻底清除。
[〇〇45]图5显示了两个卵子透明带上附着的颗粒细胞被彻底清除。
[〇〇46]图6显示了处理后的两个卵子表面仍有颗粒细胞残留。
【具体实施方式】
[0047] 本发明人经过广泛而深入的研究，意外发现了一种彻底清洗卵子或受精卵表面的方法。在此基础上，发明人完成了本发明。
[0048] 本文中所提及的蛋白为血清蛋白。
[0049] 清洗卵子或受精卵表面的方法
[0050] 本发明提供了一种清洗卵子或受精卵表面的方法，所述方法包括步骤：
[0051] (1)将未经处理的卵子或未经处理的受精卵置于第一培养皿中，其中，所述第一培养皿经标准细胞培养表面处理且含有第一培养液，所述第一培养液含蛋白；
[0052] 然后加入透明质酸酶(可从任何细胞培养试剂供应商购得)处理所述卵子或受精
卵一段时间（如10-60秒;较佳地，为20-40秒），从而得到经第一次处理的卵子或受精卵； [〇〇53] (2)将经第一次处理的卵子或受精卵移入第二培养皿中，其中，所述第二培养皿未
经表面处理且含有第二培养液，所述第二培养液不含蛋白；
[0054] 然后用带有第三培养液的棒状工具拨动所述卵子或受精卵，其中，所述第三培养液含蛋白；使颗粒细胞和/或多余精子脱离卵子或受精卵表面，从而被彻底清除干净。
[0055] 其中，所述颗粒细胞和/或多余精子从卵子或受精卵表面脱离后附于培养皿底部表面。
[0056] 所述棒状工具为棒或棍类似工具。所述棒状工具可以为玻璃的、塑料的等任何适合的材料制成的。所述带有第三培养液的棒状工具是指棒状工具上蘸有第三培养液。
[〇〇57] 未经处理的卵子或未经处理的受精卵
[〇〇58] 所述未经处理的卵子可以是从母体取出2-3小时后的卵子。
[0059]所述未经处理的受精卵可以是在体外受精4小时或16-20小时后的受精卵。
[0000]第一培养液
[0061 ]所述第一培养液模拟人输卵管液的成分，且用HEPES做缓冲成份。该培养液用 HEPES做缓冲成份，在空气中可较长时间地保持pH值的稳定性。培养时无需二氧化碳气体环境。
[〇〇62] 所述第一培养液可参照Quinn等人于1984年公开发表（《生育与不孕》（Fertil
Steri 1.) 1984; 41: 202或1985;44:493.)的文献制备。也可从各商业公司（如，SAGE media) 购买。
[0063] 在另一优选例中，所述第一培养液为IM培养液。
[0064] 第一培养皿
[〇〇65]所述第一培养皿为任意的市售的经标准细胞培养表面处理的细胞培养皿。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形状或尺寸的。
[〇〇66] 在另一优选例中，所述第一培养皿为Falcon 353037培养皿、康宁公司的430166培
养皿或塞默飞公司的150288培养皿。
[〇〇67]第二培养液
[0068] 所述第二培养液的成分与第一培养液相同，区别仅在于第二培养液不含有蛋白。
[0069] 在另一优选例中，所述第二培养液为M-IM培养液。
[0070] 第二培养皿
[0071] 所述第二培养皿为任意的市售的未经表面处理的细胞表面膜。可以是任何其它公司出售的，也可以是任何形状或尺寸的。
[〇〇72] 在另一优选例中，所述第二培养皿为Falcon 351006培养皿、康宁公司的430589培
养皿或塞默飞公司的150340培养皿。
[〇〇73] 第三培养液
[〇〇74]所述第三培养液的成分与第一培养液相同，区别仅在于第三培养液不含缓冲成分 HEPES。所述第三培养液与第一培养液的区别在于其中没有缓冲成份(HEPES )，所以必须在 5 %二氧化碳环境(二氧化碳培养箱中）下使用。
[〇〇75]在另一优选例中，所述第三培养液可参照Quinn等人于1984年公开发表(《生育与不孕》(Ferti 1 Steri 1.) 1984; 41:202或1985; 44:493.)的文献制备或可从各商业公司（如， SAGE media)购买。
[0076]在另一优选例中，所述第三培养液为GM培养液。
[〇〇77]本发明技术方案的有益效果是：
[0078] 1.彻底清除卵子(或受精卵）表面的颗粒细胞，避免了试管婴儿（IVF及ICSI)过程中NICS检测可能遭受的颗粒细胞和/或多余精子污染。
[0079] 2.避免了胚胎透明带剥除的操作，简化了技术操作步骤，避免了透明带剥除操作可能带来的胚胎损伤风险。
[0080] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0081] 实施例1.
[〇〇82] 一、试剂和耗材
[0083] 1.试剂
[0084] 1.1含80U/ml的透明质酸酶的HEPES-HTF培养液（Hyaluronidase 80U/ml in HEPES-HTF)(规格：SAGE，产品号:ART4007-A)
[0085] 1 · 2 M-IM培养液：Quinn，s Advantage含HEPES培养液（Quinn，s Advantage Medium with HEPES)(规格：SAGE，产品号：ART-l〇23)
[0086] 1 · 3 IM培养液：Quinn ’ s Advantage加蛋白受精培养液（Quinn ’ s AdvantageTM Protein Plus Fertilization(TIF)Medium)(规格：SAGE，产品号：ART_1520)
[0087] 1 · 4 GM培养液：Quinn ’ s Advantage加蛋白卵裂培养液（Quinn ’ s Advantage Protein Plus Cleavage Medium)(规格：SAGE，产品号：ART_1526)
[0088] 2.耗材
[0089] 2.1 Falcon 351006培养皿
[0090] 2.2 Falcon 363037培养皿
[0091] 2.3巴斯德吸管
[0092] 3.操作时机
[0093] ICSI的卵子清除颗粒细胞处理是在取卵后2 — 3小时。
[0094] 刚从母体中取出的未经处理的卵子，表面附着有大量颗粒细胞，如图1所示。
[〇〇95] 4.操作程序：
[〇〇96] 4.1在卵子清洗前，准备好剥卵用吸管（100-120μπι)，移卵用吸管（180-200μπι)及一
根末端烧圆的小玻棒。
[0097] 4.2
[〇〇98] 在1个Falcon 353037(聚苯乙烯材质，标准细胞培养表面处理)培养皿中加入lml 頂培养液(ART-1520);
[0099] 1个Falcon 351006(聚苯乙烯材质，无处理)培养皿中加入2ml不含蛋白的M-IM培养液(ART-1023)。
[0100] 4.3把从母体中取出的未经处理的卵子先放入含有頂培养液(ART-1520)的Falcon 353037培养皿中，再加入lml 80U/ml的透明质酸酶的HEPES-HTF培养液，反复吹吸，持续30 秒。在这一步骤中，因培养液中含有带负电的蛋白质，中和了颗粒细胞表面的正电荷。同时， 聚苯乙烯材质的培养皿经细胞培养表面处理后，其表面成亲水的电荷中性状态。因此，卵子与其表面附着的颗粒细胞会悬浮在液体培养液中。透明质酸酶的消化作用弱化了颗粒细胞与卵子之间的粘附作用。在吹打的冲洗作用下，部分颗粒细胞即可脱离与卵子的附着。
[0101] 经上述步骤3清洗处理过的卵子，其表面颗粒细胞附着明显减少，但仍有颗粒细胞附着。如图2所示。
[0102] 4.4将表面粘附有剩余颗粒细胞的卵子移入含有不含血清蛋白的M-IM培养液 (ART-1023)的Falcon 351006培养皿中。此时，因培养液中不存在蛋白质的负电中和作用， 颗粒细胞带有正电荷。同时，Falcon 351006培养皿为未经处理聚苯乙烯材质，其表面为疏水的负电状态。因此，卵子与其表面附着的颗粒细胞就会粘附于培养皿底部表面(如图3所示）。此时，用蘸过含蛋白GM培养液(ART-1526)的玻璃小棒(含蛋白培养液的作用是中和玻璃棒表面的负电荷，避免细胞黏附于玻璃棒上)不断拨动卵子，使卵子在培养皿底部表面滚动。在滚动过程中，卵子表面的剩余颗粒细胞就会粘附于培养皿底部表面与卵子脱离，持续推动卵子滚动，直至其表面的颗粒细胞被彻底清除干净。
[0103] 经上述步骤3和4清洗处理过的卵子，其表面颗粒细胞被彻底清除，如图4所示。
[0104] 4.5去除完颗粒细胞后，用吸管(先吸一点含蛋白的培养液)把卵子转移到GM培养液中，放入37°C，5%C02，5%02培养箱内培养，随后即可进入常规的单精子注射(ICSI)、胚胎体外培养(IVF及ICSI)和NICS检测流程。
[0105] 实施例2
[0106] 采用实施例1的方法，不同之处在于用受精卵代替卵子。而IVF清除受精卵表面颗粒细胞和多余精子的处理时间是在加精4小时(短时受精)或16 — 20小时(常规受精)之后。
[0107] 结果发现，IVF受精卵表面的颗粒细胞和多余精子可以被彻底清除。
[〇1〇8] 实施例3
[0109] 采用实施例1的方法，不同之处在于使用康宁公司的培养皿，并根据文献(Fertil Steri 1.1984;41:202，1985;44:493.)中的配方自制培养液。
[0110] 用含人血清白蛋白及HEPES的HTF培养液(根据文献自配)和经标准细胞培养表面处理的培养皿（购自：康宁；产品号：430166)代替含lml IM培养液(ART-1520)的Falcon 353037(聚苯乙烯材质，标准细胞培养表面处理)培养皿；
用不含蛋白，但含有HEPES的HTF培养液(根据文献自配)和未经表面处理的培养皿 (购自：康宁；产品号：430589)代替含2ml不含蛋白的M-IM培养液(ART-1023)的Falcon 351006(聚苯乙烯材质，无处理)培养皿。
[0112] 结果表明：两个卵子透明带上附着的颗粒细胞被彻底清除，如图5所示。
[0113] 对比例1
[0114] 采用实施例1的方法，不同之处在于在步骤4.4中用頂培养液代替了不含蛋白的M-IM培养液。
[0115] 结果导致颗粒细胞与培养皿底粘附不牢，无法从卵子表面脱离。处理后的两个卵子表面仍有颗粒细胞残留，如图6所示。
[0116] 本发明的优点是在对卵子、受精卵或胚胎不产生任何损伤，不触动透明带的情况下提供了一种彻底清除卵子表面颗粒细胞和/或多余精子的方法。其要点在于利用细胞表面、培养液成份(蛋白质）和细胞培养皿底部表面的电荷关系将颗粒细胞和/或多余精子从卵子(或受精卵)表面粘除。
[0117]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种清洗卵子或受精卵表面的方法，其特征在于，包括步骤： (1) 将未经处理的卵子或未经处理的受精卵置于第一培养皿中，其中，所述第一培养皿 经标准细胞培养表面处理且含有第一培养液，所述第一培养液含蛋白； 然后加入透明质酸酶处理所述卵子或受精卵，从而得到经第一次处理的卵子或受精 卵； (2) 将经第一次处理的卵子或受精卵移入第二培养皿中，其中，所述第二培养皿未经表 面处理且含有第二培养液，所述第二培养液不含蛋白； 然后用带有第三培养液的棒状工具拨动所述卵子或受精卵，其中，所述第三培养液含 蛋白；使颗粒细胞和/或多余精子脱离卵子或受精卵表面，从而被彻底清除干净。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未经处理的卵子是从母体取出2-3小时 后的卵子。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未经处理的受精卵是在体外受精4小时 或16-20小时后的受精卵。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养液模拟人输卵管液的成分，且 用HEPES做缓冲成份。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养皿为Falcon 353037培养皿、康 宁公司的430166培养皿或塞默飞公司的150288培养皿。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述处理的时间为10-60秒。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培养液的成分与第一培养液相同， 区别仅在于第二培养液不含有蛋白。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培养皿为Falcon 351006培养皿、康 宁公司的430589培养皿或塞默飞公司的150340培养皿。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第三培养液的成分与第一培养液相同， 区别仅在于第三培养液不含缓冲成分HEPES。10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述颗粒细胞和/或多余精子从卵子或受精 卵表面脱离后附于培养皿底部表面。
【文档编号】C12N5/075GK105950546SQ201610584345
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月22日
【发明人】蔡立义, 陆思嘉
【申请人】上海序康医疗科技有限公司