Dc细胞的培养方法、tlr激动剂及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种DC细胞的培养方法、TLR激动剂及其应用，其中，所述TLR激动剂包括：多聚T寡脱氧核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶剂；其中，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为1～90μmol/L；所述咪唑喹啉衍生物的浓度为0.1～900μg/ml，且结构式如下：本发明TLR激动剂可以促进DC细胞的快速成熟，且强化DC细胞的抗原呈递能力。
【专利说明】
DC细胞的培养方法、TLR激动剂及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及免疫细胞技术领域，尤其涉及一种DC细胞的培养方法、TLR激动剂及其 应用。
【背景技术】
[0002] TLR(Toll-like Receptors，Toll样受体)是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质 分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLR是单个的跨膜非催化性蛋白质，可 以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜 等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。具体地，TLR是I型跨膜受体，由胞质 To 11-1L-1受体结构域(Toll-IL-1 receptor domain，TIR结构域）、跨膜结构域和胞外结构 域组成。TIR结构域提供了一个关键点，能和MyD88(髓样分化因子88)家族中的包含TIR结构 域的连接蛋白产生同型交互作用进而启动两条主要的信号通路下传到TLRs:-条是介导的 途径导致促炎细胞因子的产生；另一条是IRF(干扰素调节因子)介导的途径导致干扰素的 产生。TLR胞外域的特点是含19~26个拷贝的富含亮氨酸的重复序列(LLRs)，每个LLRs含24 个氨基酸残基，进而TLR胞外域可以通过LLRs识别配体。
[0003] 在所有TLRs中，TLR7和TLR8在种系发生上彼此接近并且具有高度的序列同源性， 因此它们的配体识别有重叠区。迄今为止，多种配体被鉴定为TLR7和/或TLR8配体（即TLR7/ 8激动剂），这些配体按其来源分为合成化合物和天然核苷类化合物。
[0004] 树突细胞(Dendritic Cells，DC细胞)是近年来倍受人们关注的专职抗原呈递细 胞(Antigen Presenting Cells，APC)，能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反 应。DC细胞的生物学功能包括:抗原提呈和免疫调节。具体地，DC细胞可表达TLR，借助TLR识 别LPS(脂多糖）、GpG-DNA、肽聚糖、脂蛋白以及分支杆菌的细胞壁成分等具有PAMP (pathogen-associated molecular patterns，病原体相关分子模式）的分子，DC细胞通过 TLR作为桥梁而被微生物成分引起活化而成熟，提供获得性免疫的共刺激信号，进而可以诱 导抗微生物防御系统，产生IL-lf3、IL-6和TNF以及趋化型细胞因子，从而调节机体Thl和Th2 两种方面的平衡。业已发现，一旦某些TLR被刺激，可以促进DC细胞成熟，细胞粘附分子和趋 化因子受体表达发生改变，上调细胞表面MHC分子、粘附分子及共刺激分子如CD40、CD54、 CD80、CD83、CD86的表达，分泌促炎细胞因子11^-1、几-6、几-12、几-18和11^-23。因此，1'1^能 诱导DC成熟和细胞因子分泌，从而调节抗原呈递、T细胞的极化，影响和控制天然和适应性 免疫应答的强度及质量。
[0005] 鉴于DC细胞在免疫反应中的重要作用，通常采用体外培养的方法对DC细胞进行扩 增。目前，DC细胞的扩增方案很多，如采用组合细胞因子IL-lβ、IL-6、TNF-α、PGE-2等或者联 合聚肌胞苷酸、细菌脂多糖等促进DC细胞成熟，然而上述促DC成熟剂仅能缓慢地促进DC细 胞成熟，且低水平分泌促炎细胞因子，抗原呈递能力弱。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的在于提供一种TLR激动剂，旨在促进DC细胞的快速成熟以及强 化DC细胞的抗原呈递能力。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供一种TLR激动剂，所述TLR激动剂包括：多聚T寡脱氧 核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶剂;其中，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为1~90ymol/L;所 述咪唑喹啉衍生物的浓度为0.1~900μg/ml，且结构式如下：
〇
[0009] 优选地，所述咪唑喹啉衍生物的浓度为500μg/ml。
[0010]优选地，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为50ymol/L。
[0011] 此外，为实现上述目的，本发明还提供一种DC细胞的培养方法，所述培养方法包括 步骤如下：
[0012] 获取未成熟DC细胞，将所述未成熟DC细胞置于培养基中；
[0013]再向所述培养基中加入TLR激动剂进行培养至所述未成熟DC细胞成熟；
[0014] 其中，所述TLR激动剂包括多聚T寡脱氧核苷酸和咪唑喹啉衍生物，所述咪唑喹啉 衍生物在所述培养基中的终浓度为0.1~0.9μg/ml且所述多聚T寡脱氧核苷酸在所述培养 基中的终浓度为1~4ymol/L。
[0015] 优选地，所述咪唑喹啉衍生物的终浓度为0.5μg/ml。
[0016] 优选地，所述多聚T寡脱氧核苷酸的终浓度为2.5ymol/L。
[0017] 优选地，所述DC细胞的培养时间为6~48h。
[0018]优选地，所述培养基为含巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4的无血清培养基。 [0019]优选地，所述DC细胞为人树突状细胞。
[0020]此外，为实现上述目的，本发明还提供一种如上所述的TLR激动剂在免疫佐剂的应 用。
[0021] 本发明技术方案，通过将咪唑喹啉衍生物与多聚T寡脱氧核苷酸共混而可以起到 协同刺激DC细胞上的TLR7/8的作用，引起DC细胞表达TLR8，进而TLR8诱导了DC细胞的活化 而促进DC细胞的快速成熟；而且DC细胞大量表达TNF-a、IL-12,即TLR8同时强化了DC细胞的 抗原呈递能力。
【附图说明】
[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图示出的内容获得其他的附图。
[0023]图1A为本发明实施例1培养24h后在倒置相差显微镜下的形态示意图；
[0024]图1B为本发明对比例1培养24h后在倒置相差显微镜下的形态示意图；
[0025]图1C为本发明对比例2培养24h后在倒置相差显微镜下的形态示意图；
[0026]图1D为本发明对比例3培养24h后在倒置相差显微镜下的形态示意图；
[0027]图2A为RT-PCR检测实施例1培养的DC细胞TLR8表达的示意图；
[0028] 图2B为Western blot检测实施例1培养的DC细胞TLR8蛋白表达的示意图；
[0029]图2C为免疫荧光法检测实施例1培养的DC细胞TLR8表达的示意图；
[0030]图2D为激光共聚焦检测实施例1培养的DC细胞TLR8的分布的示意图；
[0031] 图3A为ELISA检测DC细胞在培养12h和24h TNF-α蛋白表达的示意图；
[0032] 图3B为ELISA检测DC细胞在培养12h和24h IL-12蛋白表达的示意图；
[0033] 图3C为ELISA检测DC细胞在培养12h和24h IL-10蛋白表达的示意图。
【具体实施方式】
[0034]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]本发明提供一种TLR激动剂，该TLR激动剂包括:多聚T寡脱氧核苷酸、咪唑喹啉衍 生物和溶剂;其中，该多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为1~90ymol/L;该咪唑喹啉衍生物的浓度 为0.1~900μg/ml，且化学结构式如下：
〇
[0037] 本发明TLR激动剂作为TLR的配体，将咪唑喹啉衍生物与多聚T寡脱氧核苷酸共混 而可以起到协同刺激DC细胞上的TLR7/8的作用，引起DC细胞表达TLR8，进而TLR8诱导了DC 细胞的活化而促进DC细胞的快速成熟;而且DC细胞大量表达TNF-a、IL-12，即TLR8同时可以 强化DC细胞的抗原呈递能力；因此，该TLR激动剂有效提高了DC细胞活化的效率，大大节省 了培养时间，同时可以缩短免疫应答时间，提高了免疫应答的强度及质量。
[0038] 需要说明的是，在该TLR激动剂中，多聚T寡脱氧核苷酸(Poly dT)是寡聚脱氧核苷 酸中的一种，也可以称为富含胸腺啼啶（T )的寡聚脱氧核苷酸（OND )(thymidine homopolymer phosphorothioate 0DN，Poly T ODN/PolydT)。该溶剂优选为水，但不限于 水，可以扩大解释为培养液或PBS缓冲液等等，同样是利用水溶解多聚T寡脱氧核苷酸和咪 唑喹啉衍生物，且不影响多聚T寡脱氧核苷酸和咪唑喹啉衍生物的性能。
[0039]本发明还提供一种DC细胞的培养方法，该培养方法包括步骤如下：
[0040] SI、获取未成熟DC细胞，将该未成熟DC细胞置于培养基中；
[0041 ] S2、再向该培养基中加入TLR激动剂进行培养至该未成熟DC细胞成熟；
[0042] 其中，该TLR激动剂包括多聚T寡脱氧核苷酸和咪唑喹啉衍生物，该咪唑喹啉衍生 物在培养基中的终浓度为〇. 1~〇. 9μg/ml且该多聚T寡脱氧核苷酸在培养基中的终浓度为1 ~4ymol/L〇
[0043] 本发明DC细胞的培养方法通过向培养基中加入TLR激动剂，DC细胞上的TLR7/8被 刺激而大量表达，进而促进DC细胞的快速成熟，同时强化了DC细胞的抗原呈递能力，有效地 提高了 DC细胞活化的效率，大大节省了培养时间。
[0044] 进一步地，该培养基为含巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL_4) 的无血清培养基。
[0045] 该巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素 4可以进一步促进DC细胞的活化，以加速 DC细胞的成熟，进而诱导DC细胞的分化和增殖。
[0046] 进一步地，在步骤S2中，DC细胞的培养时间为6~48h，优选为24h。
[0047] 在该培养时间范围内，TLR激动剂可以充分活化DC细胞，以保证DC细胞的快速成熟 和抗原呈递能力的强化。需要说明的是，该培养时间从加入TLR激动剂后开始计算，而非从 DC细胞加入培养基后开始计算。
[0048] 本发明还提供一种上述TLR激动剂在免疫佐剂的应用。
[0049] 该TLR激动剂作为免疫佐剂进行应用时，可以通过DC细胞调节抗原递呈、T细胞的 极化，影响和控制天然和适应性免疫应答的强度及质量。
[0050] 现通过实施例对本发明TLR激动剂及DC细胞的培养方法做进一步解释，以详细说 明其技术方案及带来的技术效果。
[0051 ] 实施例1
[0052] 一、TLR激动剂的配制
[0053]本实施例涉及到的TLR受体为TLR7/8;所用的多聚T寡脱氧核苷酸（PolydT)从 Invitrogen公司直接购买获得;所用的咪唑喹啉衍生物（CL075)从Invitrogen公司直接购 买获得，化学结构式如下：
[0055] (1)、制备CL075水溶液:将500yg CL075粉末溶于ΙΟΟΟμΙ水中，配成浓度为500yg/ ml的原液，然后分装成10管存于-20 °C备用；
[0056] (2)、制备PolydT水溶液：将lOOnmol PolydT液体溶于2ml水中，配成浓度为50μ mol/L的原液，然后分装成10管存于-20°C备用；
[0057] (3)、制备TLR激动剂:取0.03ml CL075水溶液、1.5ml PolydT水溶液和8.47ml的水 共混均匀，而得到约10ml TLR激动剂。
[0058]二、未成熟的人树突状细胞的获取
[0059] (1)、采集外周静脉血50ml，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞：
[0060] 具体步骤为：1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56°C灭活30分钟后离心备 用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1:2的比例加入离 心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600 转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到外周血单个核细胞；
[0061 ] 将上述分离的PBMCs重悬于PAA?培养基、GT-T551?培养基、Opti-MEM?培养基的任 意一种培养基中，调整细胞密度为(5~10)X106/ml，总体积为10ml加入T75ml的细胞培养 瓶内，于37°C、5 % C02和饱和湿度的培养箱内贴壁2h;
[0062]轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮，然后吸弃悬浮的未贴壁细胞;补加10ml PAA?培养基、GT-T551?培养基、Opti-MEM?培养基的任意一种培养基，轻轻晃动培养瓶，使 未贴壁细胞重新悬浮，然后吸弃悬浮的未贴壁细胞，该步骤重复1~2次，则留下的贴壁细胞 即为单核细胞。
[0063] (2)、诱导单核细胞向DC分化：
[0064] 具体步骤为：
[0065]将20ml含有 10% 自体血浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4的X-VIV0-15?培养 基或者A頂-V?培养基加入上述T75的培养瓶内，然后置于37 °C、5 % C02和饱和湿度的培养箱 内培养；
[0066]第三天(72h)后吸弃10ml培养瓶内的培养基，并补加10ml新鲜的含有10%自体血 浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4、10μg/ml的肿瘤抗原的X-VIV0-15?培养基或者A頂-V?培养基，从而获得未成熟的人树突状细胞。
[0067]三、人DC细胞的培养
[0068]选择状态良好的对数生长期的未成熟的人DC细胞，按2xl06个/孔接种于2个6孔培 养板中，培养板中置有20ml RPMI-1640培养基;其中，RPMI-1640培养基为添加了细胞因子 GM-CSF和IL-4的无血清培养基；
[0069]向RPMI-1640培养基中加入10ml TLR激动剂，然后培养6~48h，完成后即换新鲜的 RPMI-1640培养基；
[0070] 其中，CL075在RPMI-1640培养基中的终浓度为0.5μg/ml，PolydT在RPMI-1640培养 基中的终浓度为2.5ymol/L，GM-CSF在RPMI-1640培养基中的终浓度为1000IU/ml，IL-4在 RPMI-1640培养基中的终浓度为1000IU/ml，培养条件:37°C、5 % C02的细胞培养箱。
[0071] 对比例1(CL075)
[0072]与实施例1的不同之处在于：
[0073] 采用实施例1制备的CL075水溶液替换TLR激动剂，即向RPMI-1640培养基中加入 CL075水溶液，使CL075的终浓度为0.5μg/ml。
[0074] 对比例 2(PolydT)
[0075] 与实施例1的不同之处在于：
[0076] 采用实施例1制备的PolydT水溶液替换TLR激动剂，即向RPMI-1640培养基中加入 PolydT水溶液，使PolydT的终浓度为2.5ymol/L。
[0077] 对比例 3(PBS)
[0078] 与实施例1的不同之处在于：
[0079] 采用PBS缓冲液替换TLR激动剂，即向RPMI-1640培养基中加入10ml PBS缓冲液。其 中，该PBS缓冲液通过NaCl 8.0g，KCl 0.2g，NaHP〇4.12H20 3.58g，KH2P〇4 0.27g，加双蒸水 溶解，定容至1L，而制得。
[0080] 验证方法
[0081] 1、人树突状细胞的形态学观察
[0082]将实施例1、对比例1、对比例2、对比例3培养24h后的人树突状细胞，在倒置相差显 微镜下观察细胞的生长状况与形态学特征。
[0083] 2、免疫荧光检测人DC细胞TLR8的表达与分布
[0084]选取对数生长期状态良好的DC细胞，按5xl04个/孔接种于铺有玻片的24孔板，加 培养液lml;
[0085]培养1~3天后，取出玻片，PBS洗2次(注意轻柔，以防洗脱细胞）；
[0086] 4%多聚甲酸0.3ml/孔固定，4°C过夜；
[0087] 吸去多聚甲醛，PBS洗2次；
[0088] 加裂解液0.3%tritoir X-100破膜，室温反应30min，吸去，PBS洗2次；
[0089] 加封闭液0.3%BSA(铺满即可），在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色， 吸取PBS洗2次，每次5min;
[0090] 加入一抗工作液(抗TLR8兔多克隆抗体），4°C反应3h后，37°C水浴反应45min，ros 洗2次；
[0091] 加入荧光二抗工作液(PE标记羊抗兔IgG二抗，避光），37°C水浴30min~lh，PBS洗2 次；
[0092] 加入 Hochest33258 核荧光染色，37Γ 水浴 30min;
[0093] 甘油封存，在荧光倒置显微镜及激光共聚焦显微镜下观察，拍片。
[0094] 3、RT-PCR检测人DC细胞TLR8表达
[0095] 调整DC细胞至lxlO6个/孔，接种于6孔板，分别对应实施例1、对比例1、对比例2和 对比例3培养的DC细胞而分成四组，加药孵育6h、12h和24h后，收集培养的各组细胞，用PBS 离心洗漆细胞，加入lml Trizol，颠倒混匀数次，置-70°C冰箱保存。
[0096] (1)、总RNA 的提取：
[0097]于-70 °C冰箱取出Trizol裂解的细胞，室温融化；
[0098] 按200μ1氯仿/ml Trizol加入氯仿，震荡混勾15s后室温放置15min;
[0099] 4Γ12 000g离心 15min;
[0100] 吸取上层水相，至另一离心管中；
[0101] 按500μ1异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混勾，室温放置10min;
[0102] 4°C12 000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
[0103] 加入lml 75%乙醇，4°C7500g离心5min，尽量弃上清；
[0104] 室温吹干至RNA沉淀呈半透明状；
[0105] 加入10μ1 DEPC水溶解RNA样品；
[0106] 测量0D值定量RNA浓度；
[0107] (2)、逆转录cDNA的合成：
[0108] a、反应液的配制
[0109] 逆转录反应体系如下：
[0112] b、逆转录反应：
[0113] 在37°C条件下，进行15分钟逆转录反应;在85°C条件下，进行5秒钟逆转录酶失活 反应。反应结束之后，核酸检测仪检测cDNA浓度并于-20°C保存。
[0114] (3)、RT-PCR 检测 TLR8 表达：
[0115] a、RT_PCR反应体系如下：
[0117] b、循环参数：共 25以1，94°(：，51^11494°(：，3〇8455°(：(1'1^8引物）/56°(：(阳性对照）， 30s-72 °C，30s，35个循环-72 °C，lOmin;
[0118] c、电泳:取10ul的上述PCR产物，在1.0 %的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条件：110 伏，约 15min;
[0119] d、染色拍照:将电泳胶泡入溴化乙锭中染色，15min后取出冲洗，拍片。
[0120] 4、ELISA检测人DC细胞中TNF-a、IL-12以及IL-10的表达
[0121 ]调整DC细胞至2 X 106/孔，接种于6孔细胞培养板，收集实施例1、对比例1、对比例2 和对比例3培养12h和24h的DC细胞培养液上清，于无菌EP管中，1000r/min、4°C离心5min，吸 取上清于另一批无菌EP管。利用博士德公司分装的进口 TNF-a、IL-12和IL-10ELISA试剂盒， 检测DC细胞培养液上清中IL-6、IL-12、TNF-a和IL-10的含量。这些试剂盒是典型的夹心法 酶联免疫吸附测定试剂盒，检测范围为15.6口8/1111-100(^8/1111，敏感性〈]^8/1111。按照试剂盒 说明书进行操作。
[0122] 5、Western blot检测DC细胞TLR8的表达
[0123] 样品制备：调整DC细胞至2 X106个/孔，接种于75cm2培养瓶，收集实施例1、对比例 1、对比例2和对比例3培养48h后的DC细胞，加入RIPA裂解液100μΙ，蛋白酶抑制剂cocktail 3μ1，冰上放置30min，每lOmin震荡一次，4°C、12000g离心15min，留取上清液，并测定蛋白浓 度。按比例在蛋白样品中加入5 X SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴加热lOmin，保存于-20度；
[0124] SDS-PAGE电泳；
[0125] Western-blot 分析。
[0126] 6、统计学分析
[0127]图像制作采用GraphPad Prism5软件处理。采用SPSS11.5软件进行统计学分析。实 验结果用-X土sd(平均数土标准差）表示，给药组的多个均数间比较采用单因素方差分析 (One-way AN0VA)，接着进行Dunnett多重比较试验来比较组间差异。两样本均数比较采用t 检验(Student's t test)，Ρ<0·05表示差异有统计学意义。
[0128] 验证结果如下：
[0129] 一、人DC细胞光镜下形态学特点
[0130] 未成熟的DC细胞形态特点是呈梭形、星形和多角形的树突状细胞，与成熟的树突 状细胞相比，树突不长，个体较小，细胞透亮，细胞核清晰。图1A至图1D依次为实施例1、对比 例1、对比例2和对比例3的DC细胞用药物刺激24h后在倒置相差显微镜下的形态示意图，结 果显示:对比例3(未刺激）、对比例1(单用CL075刺激)或对比例2(单用Poly dT刺激)的细胞 较幼小，树突较短且少（图1B、图1C、图1D)。实施例1 (CL075+P〇ly dT联合用药刺激）的细胞 树突增多且伸长（图1A)。因此，实施例1的TLR激动剂对DC细胞的刺激效果优于对比例1或对 比例2的刺激效果，且优于对比例1与对比例2的效果之和。
[0131] 二、TLR8在DC细胞的表达与分布
[0132] 将实施例1的DC细胞培养1~2天，并收集，用roS洗涤细胞，提取总RNA、逆转录合成 cDNA，用双蒸水作为阴性对照，用RAW细胞(RAW 264.7)作为阳性对照；
[0133] (1)、RT-PCR检测TLR8 mRNA的表达，如图2A所示，图2A中RT-PCR检测DC细胞TLR8 mRNA的表达：
[0134] "DC"代表DC细胞TLR8 mRNA的RT-PCR产物；
[0135] 代表采用双蒸水作为阴性对照；
[0136] "+"代表采用RAW细胞作为阳性对照，RAW细胞TLR8 mRNA的RT-PCR产物；
[0137] "M"代表采用DL2000作为DNA标准参照物；
[0138] (2)、提取总蛋白，Western blot检测TLR8蛋白表达，如图2B所示，图2B中Western blot检测DC细胞TLR8蛋白表达：
[0139] "Γ代表采用RAW细胞TLR8条带作为阳性对照；
[0140] "2"代表DC细胞TLR8条带；
[0141] (3)、用免疫荧光法进一步确定DC细胞TLR8的表达，如图2C所示，图2C中免疫荧光 法检测DC细胞TLR8蛋白表达(荧光显微镜，400x)，红色荧光不规则团块表示TLR8,蓝色荧光 圆点表示细胞核；
[0142] (4)、最后通过激光共聚焦确定TLR8的分布，如图2D所示，图2D中激光共聚焦检测 TLR8表达与分布:红色荧光圆点表示TLR8，蓝色荧光不规则团块表示细胞核，图中标尺比例 为 ΙΟμπι;
[0143] 因此，结果从mRNA水平（表达为365bp)(图2Α)和蛋白水平（图2Β、图2C、2D)都证实 DC细胞表达TLR8，而且TLR8主要分布于细胞浆内（图2D)。
[0144] 三、实施例1(CL075+Poly dT合用）促进DC细胞分泌TNF-α和IL-12
[0145] 收集实施例1、对比例1、对比例2和对比例3培养12h和24h后的培养液上清，ELISA 检测其TNF-a、IL-12和IL-10蛋白表达。结果显示：与对比例相比，实施例l(CL075+PolydT合 用）细胞分泌TNF-a和IL-12的水平均显著增加 (*p〈0.05)，且远优于对比例1和对比例2,如 图3A和图3B所示;而IL-10的分泌水平显著降低(*p〈0.05)，如图3C。尽管对比例1细胞分泌 TNF-a、和IL-12水平也略有增加，但与对比例3相比均无统计学意义，而且对比例1对IL-10 的表达没有影响，而对比例2的DC细胞TNF-a、IL-12和IL-10表达量均无变化，如图3A、图3B 图3C所示。因此，实施例1显著促进DC细胞分泌TNF-α和IL-12。
[0146] 综上所示，实施例1(CL075+Poly dT合用)培养的DC细胞树突增多，TLR激动剂能显 著激活DC细胞，使DC细胞快速成熟。实施例1培养的DC细胞表达的蛋白水平证实，DC细胞表 达TLR8，而且TLR7/8主要分布于细胞浆内，即TLR激动剂能够刺激TLR8，活化TLR8，进而促进 DC细胞快速成熟。实施例1培养的DC细胞分泌的TNF-α、IL-12显著增加，而IL-10的分泌显著 减少，即TLR激动剂可以增强免疫应答，而强化抗原呈递。
[0147] 以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本 发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其 他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种TLR激动剂，其特征在于，包括： 多聚T寡脱氧核苷酸、咪唑喹啉衍生物和溶剂； 其中，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为1~90ymol/L; 所述咪唑喹啉衍生物的浓度为0.1~900μg/ml，且结构式如下：〇2. 如权利要求1所述的TLR激动剂，其特征在于，所述咪唑喹啉衍生物的浓度为500ug/ ml〇3. 如权利要求1或2所述的TLR激动剂，其特征在于，所述多聚T寡脱氧核苷酸的浓度为 50ymol/L〇4. 一种DC细胞的培养方法，其特征在于，包括步骤如下： 获取未成熟DC细胞，将所述未成熟DC细胞置于培养基中； 再向所述培养基中加入TLR激动剂进行培养至所述未成熟DC细胞成熟； 其中，所述TLR激动剂包括多聚T寡脱氧核苷酸和咪唑喹啉衍生物，所述咪唑喹啉衍生 物在所述培养基中的终浓度为0.1~〇.9μg/ml且所述多聚T寡脱氧核苷酸在所述培养基中 的终浓度为1~4ymol/L。5. 如权利要求4所述的DC细胞的培养方法，其特征在于，所述咪唑喹啉衍生物的终浓度 为0·5μg/ml。6. 如权利要求4或5所述的DC细胞的培养方法，其特征在于，所述多聚T寡脱氧核苷酸的 终浓度为2.5ymol/L。7. 如权利要求4所述的DC细胞的培养方法，其特征在于，所述DC细胞的培养时间为6~ 48h〇8. 如权利要求4所述的DC细胞的培养方法，其特征在于，所述培养基为含巨噬细胞集落 刺激因子和白细胞介素4的无血清培养基。9. 如权利要求4所述的DC细胞的培养方法，其特征在于，所述DC细胞为人树突状细胞。10. -种如权利要求1至3任意一项所述的TLR激动剂在免疫佐剂的应用。
【文档编号】C12N5/0784GK105950555SQ201610377498
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】曾宪卓, 唐熙
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司