一个水稻休眠性相关蛋白及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明公开了一个水稻休眠相关蛋白及其编码的基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与水稻种子休眠性相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。本发明的水稻种子休眠相关蛋白影响种子成熟后的休眠性。过表达该蛋白编码基因的可导致转基因植株种子休眠性增强，从而可以培育具有适度休眠性的转基因植物，以降低不良环境对水稻产量的影响。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。
【专利说明】
一个水稻休眠性相关蛋白及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一个水稻休眠性相关蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 种子休眠是普遍存在的，可以使物种逃避自然灾害，减少种内个体间竞争及防止 种子在不合时宜的季节萌发，是物种在长期进化过程中获得的一种对环境及季节性变化的 适应性，是高等植物受基因和环境因子共同影响的复杂性状，具有普遍的生物学意义。水稻 种子休眠是由多基因控制的复杂性状，也是水稻进化过程中重要的农艺性状，在栽培过程 中种子休眠具有双重性:一方面，要求播种后种子能发芽迅速、整齐;另一方面，需要种子具 有一定的休眠性，防止种子在收获季节遇到不适宜的气候而产生穗发芽，影响产量和品质。
[0003] 在种子成熟过程中，随着种子储藏物质的积累、脱水耐性的获得及代谢活动的停 止，种子休眠得以形成。种子休眠的形成由很多调控因子共同调控，这些调控因子的作用方 式及调控水平是不一样的。植物激素 ΑΒΑ和GA是种子休眠的主要调控因子，且它们的作用是 相互拮抗的。ΑΒΑ和GA的含量平衡及信号途径的响应对于种子休眠的形成、维持具有重要的 调控作用。在植物种子中，ΑΒΑ参与休眠的形成与休眠的维持，GA等激素则参与种子休眠的 破除和促进种子发芽。种子休眠和萌发是典型的受多基因调控的数量性状，非常容易受到 外界环境条件影响，而数量性状位点(QTL)定位是研究复杂数量性状的有效方法。对于水稻 休眠的研究，首先通过一个强休眠材料和一个弱休眠材料构建的分离群体，对群体内各单 株休眠性进行检测，并结合分子标记分析对控制休眠性的位点进行初定位。然后选择贡献 率高的位点进行后续研究。主要通过与其中一个亲本进行多代回交，获得只含有目标位点 的近等基因系(NIL)，通过对NIL与背景亲本回交获得的F2分离群体进行重组体筛选，并对 重组体的后代进行表型验证，结合重组体的基因型对QTL位点进行精细定位，从而获得影响 休眠表型的相关基因。近年来，利用分子标记对不同的遗传群体进行分析，已初步定位了 100多个与水稻休眠性相关的QTL，广泛分布于12条染色体上。但由于种子休眠的复杂性及 易受外界环境影响，检测到的QTL往往效应值不高或表达不稳定，给进一步的精细定位和图 位克隆带来困难，到目前为止，只有两个QTL被克隆，但其对种子休眠的调控机理仍不清楚。 野生稻和杂草稻有极强的种子休眠性，往往被用于种子休眠的研究，但这种休眠性很难破 除，加之连锁累赘现象的存在，使得这些QTL难于利用于生产实际。因此挖掘优良的休眠 QTL，并对相关基因进行研究，对水稻生产尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一个水稻休眠相关的蛋白。
[0005] 本发明的另一目的是提供该蛋白的编码基因与应用。
[0006] 与水稻种子休眠相关的蛋白qSdn-Ι，来源于稻属水稻(Oryza sativa var.N22)， 具有如(a)或(b)所示的氨基酸残基序列：
[0007] (a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (b)将SEQ ID NO. 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加衍生得到的与水稻种子休眠相关的蛋白质。
[0009] 序列表中的序列1由966个氨基酸残基组成，为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶家族蛋 白。
[0010]为了使(a)中的qSdn-l便于纯化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋 白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0011] 表1标签的序列
[0013] 上述(b)中的qSdn-l可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述(b)中的qSdn-l的编码基因可通过将SEQ ID勵.2所示的0嫩序列中缺失一个或几个氨 基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连 上表1所示的标签的编码序列得到。
[0014] 编码上述与水稻种子休眠相关的蛋白的基因〇SqSdn-l(N22)也属于本发明的保护 范围。
[0015] 所述基因优选为如下1)或2)或3)所述的DNA分子：
[0016] 1)SEQ ID从).2所示的0嫩分子；
[0017] 2)SEQ ID NO .3所示的DNA分子；
[0018] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
[0019] 4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物休眠相关蛋白 的DNA分子。
[0020] 含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
[0021 ]可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
[0022] 所述植物表达载体可构建双元农杆菌载体。所述植物表达载体还可包含外源基因 的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。 所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导(Ti)质粒 基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具 有类似功能。
[0023] 使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子 (Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外，使用本发明的基因 构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可 以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整 个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0024]为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤 光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物(潮霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学 试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记 基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0025] 所述重组表达载体可为在pCUbi 1390载体的EcoRI重组位点插入所述基因（qSdn- 1)得到的重组质粒。将含有qSdn-1的pCUbi 1390命名为pCUbi 1390-qSdn-l。
[0026] 含有以上任一所述基因（qSdn-1)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明 的保护范围。
[0027] 扩增所述基因（qSdn-Ι)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述 的引物对优选 Primer 1/Primer2、Primer3/Primer4 和 Primer5/Primer6〇
[0028] 一种水稻休眠性位点qSdn-1，其该位点定位于Indel标记F19和F18之间，29.8kb范 围内；所述的Indel标记F19的上游引物如序列表中SEQ ID N0.36所示，下游引物如序列表 中SEQ ID N0.37所示；Indel标记F18的上游引物如序列表中SEQ ID N0.34所示，下游引物 如序列表中SEQ ID N0.35所示。
[0029] 在精细定位此基因过程中涉及到的定位引物（见表2)，除引物RM11669和RM11694 外，其余SSR引物和InDel引物为本实验需要而自行设计的引物，这些自行设计的引物也属 于本发明的保护范围。
[0030] 有益效果：
[0031] 本发明的水稻休眠性相关蛋白影响水稻种子的休眠性。过表达该蛋白可导致种子 休眠性增强。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良，以获得具有适度休眠性的 品种，保证恶劣条件下水稻产量和品质不受或少受影响。
【附图说明】
[0032]图1为N22和南粳35的表型分析。
[0033] a为N22和南粳35的株型图；b为两者的发芽率;c为两者的灌浆速率;d为两者的发 芽表型图；e为两者不同吸胀阶段的胚变化情况。
[0034] 图2为NIL构建过程。
[0035]图3为NIL和南粳35的表型分析
[0036] a为NIL和南粳35的株型图；b为两者的抽穗期情况;c、d为两者的发芽情况;e为两 者不同吸胀阶段的胚变化情况;f-Ι为两者部分农艺性状考察情况。
[0037]图4为NIL、南粳35和它们的F1的表型分析。
[0038]图5为qSdn-Ι的精细定位和交换单株验证。
[0039] a为qSdn-Ι的精细定位;b为交换单株验证
[0040] 图6为过表达载体pCUbil390质粒图谱。
[0041 ]图7为转基因植株进行PCR分子检测结果。
[0042] 泳道1为未转入0sqSdn_l(N22)的cDNA为模板扩增作为负对照，除了2、25、26、30 外，其余为转化获得的35株转pCUbil390-qSdn-l(N22)阳性植株。
[0043]图8为部分转基因植株发芽情况。
[0044] 对照的发芽率约为99%，T〇-15的发芽率为71%，T〇-9的发芽率为64%。
【具体实施方式】
[0045] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0046] 实施例1、水稻休眠性相关位点及其编码基因的发现
[0047] -、水稻休眠性鉴定、近等基因系构建及遗传分析
[0048] Ν22为具有极强休眠性的籼稻品种，南粳35为无休眠的粳稻品种。抽穗35天后分别 收取Ν22和南粳35种子，选取成熟饱满籽粒进行休眠性检测。每个重复50粒，共三个重复，盛 于铺有两层滤纸的l〇cm培养皿中，加入10ml水，30°C暗培养7天后记录发芽情况。以根或芽 长度超过籽粒一半记为发芽。N22的发芽率为0%，南粳35的发芽率接近100%。利用体视显 微镜对吸胀时期的种胚进行观察，南粳35的胚在吸胀36h后出现胚根和胚芽伸长的现象，而 N22的胚在吸胀48h后仍无明显变化。但对两者的吸胀速率进行检测则未见明显差异（见图 1)。对N22与南粳35杂交获得的分离群体进行休眠表型鉴定，并结合分子标记分析对影响种 子休眠性的位点进行分析后，选取贡献率较高的qSdn-Ι进行分析。构建以南粳35为背景亲 本，N22(qSdn-l)为插入片段的近等基因系(NIL)(见图2)。对NIL和南粳35进行分析，NIL休 眠性强于南粳35外，在株高、抽穗期、灌浆速率、吸胀速率、分蘖数、结实率和千粒重等农艺 性状上无明显差异。对吸胀时期种胚进行观察，NIL的种胚在吸胀60h后开始出现胚根和胚 芽的变化，且NIL的发芽率约为40% (见图3)。对NIL与南粳35回交获得的F1进行分析，其种 子休眠性接近NIL的种子休眠性，所以我们认为水稻种子休眠性是由显性基因控制的（见图 4)
[0049] 二、水稻休眠位点及其相关基因的获得
[0050] 1、水稻休眠位点及其相关基因的精细定位
[00511用NIL与南粳35回交获得的？2分离群体4826株，分单株取各株的叶片，分别提取 DNA，用初定位的SSR标记RM11669和RM11694进行交换单株筛选，同时对各个单株进行休眠 性检测，选取极端表型的交换单株用于后续试验。次年选取分离群体8248株，分单株去叶片 并提取DNA，用自行开发Indel标记Y25和Y37进行交换单株筛选，结合各单株的休眠表型，选 取极端交换单株用于后续试验。通过这种方法，将水稻休眠性位点qSdn-Ι定位在自行开发 的Indel标记Y78和Y75之间。对这些筛选到的交换单株后代进行休眠性检测，并结合该交换 单株的基因型，进一步精细定位。最终，将水稻休眠性位点 -qSdn-l定位于Indel标记F19和 F18之间，29.8kb范围内（见图5)。
[0052]上述交换单株后代验证方法如下：
[0053] (1)每个用于分析的交换单株进行种植，每个种植40株
[0054] (2)对交换单株产生的后代，分单株考察各单株的休眠性
[0055] (3)统计每个交换单株的所有后代的表型分布，及无休眠记为H，强休眠记为L，后 代表型出现分离记为S。
[0056] 上述SSR标记分析的方法如下所述：
[0057] (1)提取上述选取单株的总DNA作为模板，具体方法如下：
[0058] ①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于2.0ml Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠， 把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GEN0/GRINDER仪器上粉碎样品 lmin〇
[0059] ②加入660μ1 提取液（含 100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8·0)，1·4Μ NaCl，0.2g/ml CTAB的溶液），漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。
[0060] ③加入40μ1 20%SDS，65°C温浴lOmin，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。
[0061] ④加入100μ1 5M NaCl，温和混匀。
[0062] ⑤加入100μ1 10XCTAB，65°C温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。
[0063] ⑥加入900μ1氯仿，充分混勾，12000rpm离心3min。
[0064] ⑦转移上清液至1 · 5mL Eppendorf管中，加入600μ1异丙醇，混勾，12000rpm离心 5min〇
[0065] ⑧弃上清液，沉淀用70% (体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。
[0066] ⑨加入100μ1 1 XTE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶 解 DNA。
[0067] ⑩取2μ1电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Beckman Instrument Inc.U.S.A)〇
[0068] (2)将上述提取的DNA稀释成约20ngAU，作为模板进行PCR扩增；
[0069] PCR反应体系（10μ1): DNA(20ng/ul) lul，上游引物（2pmol/ul) lul，下游引物 (2pmol/ul)lul,lOxBuffer(MgCl2free)lul,dNTP(10mM)0.2ul ,MgCl2(25mM)0.6ul,rTaq (5u/ul)0.1ul，ddH2〇 5.1ul，共10ul。
[0070] PCR 反应程序：94.0°(：变性5111丨11;94.0°(：变性3〇8、55°(：退火3〇8、72°(：延伸1111丨11，共 循环35次;72°C延伸7min;10°C保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。
[0071] 上述引物开发过程如下：
[0072] (l)SSR标记开发
[0073]将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC 克隆序列。用SSRHunter(李强等，遗传，2005，27(5): 808-810)或SSRIT软件搜索克隆中潜在 的SSR序列（重复次数多6);将这些SSR及其邻近400~500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在 线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR 产物在籼、粳间存在多态性;再利用Primer Premier 5·0软件设计SSR引物，并由上海英俊 生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在N22和南粳35之 间的多态性，表现多态者用作精细定位qSdn-Ι的分子标记。用于精细定位的分子标记见表 2〇
[0074] SSR标记的PCR产物检测：
[0075]扩增产物用8%非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分析。以50bp的DNA Ladder为对照比 较扩增产物的分子量大小，银染显色。
[0076] (2)InDel 标记开发
[0077] InDel引物设计:对N22和南粳35在qSdn-Ι所在位置附近的部分区段进行测序，并 进行比对，发现两者之间存在的SNPs，以这些SNPs为基础用软件设计InDel标记，同时运用 Primer Premier 5.0软件设计对应的另一条引物，见表2。
[0078] InDel标记分析的PCR反应体系：DNA(20ng/ul )2ul，Primerl (10pmol/ul )2ul， Primer2(lOpmol/ul)2ul,lOxBuffer(MgCl2free)2ul,dNTP(10mM)0.4ul,MgCl2( 25mM) 1 · 2ul，rTaq(5u/ul)0 · 4ul，ddH2〇 lOul，总体积20ul。
[0079] 扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc. )PCR仪上进行：94°C3min;94°C30sec，55 °C (引物不同，有所调整)4586(3,721€2.511^11，35个循环;721€511^11。
[0080] PCR产物纯化回收，按试剂盒(北京Tiangen公司）步骤进行。PCR产物酶切消化过夜 后，用1-4%的琼脂糖凝胶中电泳分离，经EB染色后于紫外灯下观察拍照。dCAPS用8%的非 变性PAGE胶分离，银染。
[0081 ]表2用于精细定位的分子标记
[0084] (3)突变基因的获得
[0085] 根据定位的位点设计引物，序列如下所述：
[0086] primerl ：
[0087] 5'一AGAAGGGGGAAAAGGA-3'（SEQ ID N0.4)
[0088] primer2：
[0089] 5'一CTTAGCATCCCCTTATTTAC-3'（SEQ ID N0.5)
[0090] 以primerl和primer2为引物，分别以N22和南粳35的cDNA为模板，进行PCR扩增获 得目的基因。该对引物位于SEQ ID如.3上游4仙?和下游10仙？，扩增产物包含了该基因的 全部编码区
[0091]扩增反应用K0D酶扩增（购自Τ0Υ0Β0公司），在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪 上进行：941€2111丨11;98°(：1086。，601€3086。，68°(：10111丨11，35个循环 ；681€20111丨11。将？〇?产物回 收纯化后连接到载体pMbl8T载体上(购自TAKARA公司），转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(购 自Tiangen公司），挑选阳性克隆，进行测序。
[0092]序列测定结果表明，PCR反应获得的片段包含SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，编 码966个氨基酸残基组成的蛋白质（见SEQ ID N0.1)。将SEQ ID NO. 1所示的蛋白命名为 0sqSdn_l(N22)，将编码SEQ ID N0.1所示的蛋白的基因命名为0sqSdn_l(N22)。
[0093]实施例2、转基因植物的获得和鉴定 [0094] 一、重组表达载体构建
[0095] 以N22的cDNA为模板，进行PCR扩增获得0sqSdn_l(N22)基因，PCR引物序列如下： [0096] Primer3(下划线所示的序列为EcoRI重组位点）：
[0097] 5'一CCATGATTACGAATTCATGGCGCGCAATGCGGCGGAC-3'（SEQ ID NO.6)
[0098] Primer4(下划线所示的序列为EcoRI重组位点）：
[0099] 5'-TACCGAGCTCGAATTCCCCAGTGTTCTGCATACCAGCAG-3'(SEQ ID NO.7)
[0100] 上述引物位于SEQ ID NO. 2所示基因的编码区起始的21bp和编码区终止子前 23bp，扩增产物包含了该基因的完整编码区，将PCR产物回收纯化。采用In-Fusion?HD Cloning Kit重组试剂盒(Takara公司）将PCR产物克隆到载体pCUbi 1390(图6)中。
[0101] In-Fusion 重组反应体系（10yL):PCR 产物 10-200ng，经 EcoRI 酶切回收 pCUbi 1390 载体50_200ng，5 X In-Fusion HD Enzyme Premix 2yL，Deionized water to 10yL。枪头吹 打混匀后将混合体系50°C反应15min后置于冰上，取2yL反应体系用热激法转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞(Tiangen公司）。将全部转化细胞均匀涂布在含100mg/L卡那霉素的LB固体 培养基上。37°C培养12-16h，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ 1〇勵.3所示〇895(111-1022)基因的重组表达载体，将含有〇895(111-1022)的口〇]1^139〇命 名为 pCUbi 1390-qSdn-l(N22)。
[0102] 二、重组农杆菌的获得
[0103] 用电击法将pCUbi 1390-qSdn_l(N22)转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公 司），得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名 为EH-pCUbi 1390-qSdn-l(N22)。
[0104]三、转基因植物的获得
[0105] 将EH-pCUbi 1390-qSdn_l(N22)转化水稻南粳35,具体方法为：
[0106] (1)28°C 培养 EH-pCUbi 1390-qSdn-l(N22) 16 小时，收集菌体，并稀释到含有 100μ mo 1 /L的Ν6液体培养基(S i gma公司，Cl 416)中至浓度为0D6QQ~0.5，获得菌液；
[0107] (2)将培养至一个月的南粳35水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤（1)的菌液混合侵 染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司）中，24°C共 培养3天；
[0108] (3)将步骤（2)的愈伤接种在含有100mg/L潮霉素 （Phyto Technology Laboratories公司）的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天）；
[0109] (4)挑取健康愈伤转入含有lOOmg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每 15天继代一次；
[0110] (5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每 15天继代一次；
[0111] (6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；
[0112] 得到分化成苗的To代阳性植株。以转pCUbi 1390空载体的南粳35为阴性对照。
[0113] 四、转基因植株的鉴定
[0114] 1、PCR分子鉴定
[0115] 将步骤三获得的T 〇代阳性植株提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用 pCUbil390上SEQIDN0.3插入位点左边界附近的引物Primer5和SEQIDN0.3上的引物 Primer6作为引物对进行扩增（Primer5:5 ' -TTTGTCGGGTCATCTTTTC-3 '（ SEQ ID N0 · 8)和 Primer6:5 ' -TCAGCCAAGTTTGCCAG-3 '（ SEQ ID NO · 9))，扩增长度 1018bp。JCR反应体系：DNA (20ng/ul)2ul,Primer5(lOpmol/ul)2ul,Primer6(lOpmol/ul)2ul,10xBuffer(MgCl2free) 2ul，dNTP( 10mM)0 ·4ul，MgCl2(25mM) 1 · 2ul，rTaq(5u/ul)0 · 4ul，ddH20 lOul，总体积20ul。扩 增反应在PTC-200(MJ Research Inc · )PCR仪上进行：94°C3min; 94°C30sec，55°C45sec，72 °(：111^11，35个循环;721€511^11。
[0116] 用试剂盒(北京Tiangen公司）纯化回收PCR产物。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检 测。结果表明获得35株PCR检测阳性的植株。见图7，图7中泳道1为以南粳35DNA为模板扩增 作为阴性对照，除了2、25、26和30外，其余为转化获得的35株转pCUbi 1390-qSdn-l(N22)植 株。
[0117] 2、表型鉴定
[0118] 分别将Το代转Hl-pCUbi 1390-qSdn-l(N22)植株、南粳35和N22种植在南京农业大 学水稻试验站，对抽穗35天的转基因植株进行收种，进行休眠表型的鉴定。转空载的南粳35 转基因植株发芽率约为99%，转入转EH-pCUbi 1390-qSdn-l(N22)的转基因植株发芽率出 现分离，其中To-15的发芽率约为71%，T〇-9的发芽率约为64%。说明0sqSdn-l(N22)确实可 以影响种子的休眠性(见图8)。
【主权项】
1. 一种与水稻种子休眠相关的蛋白，其特征在于:选自（a)或(b)所示的蛋白： (a) 由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 将SEQ ID NO. 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加衍生得到的与水稻种子休眠相关的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白的基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分 子： 1. SEQ ID NO.2所示的DNA分子； 2. SEQ ID NO.3所示的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子； 4) 与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码水稻种子休眠性蛋白的 DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCUbi 1390载体的EcoRI重组位点之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。6. 扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对，优选Primer 1/Primer2、 Primer3/Pr imer4或Primer5/Pr imer6 ;其中，Pr imer 1 如序列表中 SEQ ID NO · 4所不， Primer2如序列表中SEQ ID N0.5所不，Primer3如序列表中SEQ ID N0.6所不，Primer4如序 列表中SEQIDN0.7所示，Primer5如序列表中SEQIDN0.8所示，Primer6如序列表中SEQ ID NO .9所示。7. 权利要求1所述的蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4所述重组表达载体、表达 盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。8. -种培育水稻种子适度休眠性的方法，是将权利要求2或3所述基因导入无休眠水稻 品种中，得到休眠性增强的转基因水稻;所述无休眠水稻品种为发芽率接近100%的水稻品 种;所述休眠性增强的转基因水稻为发芽率低于80%的转基因水稻。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于:权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5 所述重组表达载体导入无休眠水稻中。10. -种培育种子休眠性增强的转基因植物的方法，是过表达目的植物中权利要求2或 3所述基因的表达，得到休眠性增强的转基因植物;所述目的植物为携带权利要求2或3所述 基因的植物。11. 一种水稻休眠性基因 qSdn-Ι，其特征在于定位于Indel标记F19和F18之间，29.8kb 范围内；所述的Indel标记F19的上游引物如序列表中SEQ ID NO.36所示，下游引物如序列 表中SEQ ID NO.37所示；Indel标记F18的上游引物如序列表中SEQ ID NO.34所示，下游引 物如序列表中SEQ ID NO.35所示。12. 权利要求11中所述的水稻休眠性基因 qSdn-Ι的定位引物，其特征在于选自表2所示 的除RMl 1669和RMl 1694之外的所有引物均为自行设计。
【文档编号】A01H5/00GK105950598SQ201610567000
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】万建民, 江玲, 杨春艳, 吴涛, 朱星洁, 王茜, 刘世家, 刘喜, 陈亮明, 田云录, 赵志刚
【申请人】南京农业大学