一种提取陈化烟叶表面细菌基因组的方法

一种提取陈化烟叶表面细菌基因组的方法
【专利摘要】本发明涉及了一种提取陈化烟叶表面细菌基因组的方法。该方法包括陈化烟叶表面细菌富集和基因组DNA的提取两个主要步骤，通过缓冲液浸泡和梯度离心富集细菌，采用trizol试剂与试剂盒相结合的方法提取细菌基因组DNA。trizol试剂不仅能够充分裂解细菌，有效防止核酸物质降解，还能通过高速离心处理，分层后获得较纯的核酸物质，提高DNA的提取效率，再经过试剂盒的处理可有效提高基因组的获得率。本发明方法能够有效，快速的提取陈化烟叶表面细菌的基因组DNA。
【专利说明】
一种提取陈化烟叶表面细菌基因组的方法
技术领域
[0001]本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种提取陈化烟叶表面细菌基因组DNA的方法。
【背景技术】
[0002]新鲜的烤烟烟叶成熟后采集进行初烤，再经过打叶复烤等处理后进入陈化工段，陈化工段能够调整、改善烟叶品质，保持烟叶质量的稳定性，是卷烟生产中必不可少的处理阶段。进行陈化处理的烟叶表面和内部寄附了丰富的微生物，并且陈化中的烤烟烟叶富含各类化合物，包括糖类、蛋白质、烟碱等，满足微生物生存的营养条件，烟叶内的许多物质具有亲水性，能够从陈化环境中吸收水分，在合适条件下，导致烤烟烟叶表面上滋生大量的微生物，其中大部分为细菌。
[0003]烟叶陈化过程中，微生物作用扮演着重要的作用，各类细菌存在于陈化的各个阶段，这些细菌在繁衍中将烟叶中的大分子物质分解成许多致香陈分的前体物质，细菌产生的酶还能促成各类化学反应的进行，产生许多具有特殊气味的香料物质。通过各类细菌的作用降解了烟叶内的糖类、蛋白质、烟碱等物质，提高了烟叶的燃烧性能，烟气的香吃味。但也有一些细菌能够产生一些不利于人类健康的有害物质，如果这些有害细菌过多繁殖，将会影响烟叶的安全性。所以研究烟叶上细菌来提高烟叶品质和降低烟叶危害具有较大的实践意义。
[0004]对于烟草微生物的研究，传统的纯培养研究方法具有很大的局限性，环境中拥有大量的微生物，但可培养的微生物只占I %左右，而大部分的微生物是无法通过培养获得的。许多学者利用宏基因组的方法，直接从样品中获取样品的基因组，对基因组进行克隆，将克隆条带处理后测序，鉴定各类微生物的种类，发掘更多的新物种，客观全面的揭示样品中微生物的多样性。在这类免培养的研究方法中提取到纯度较高的基因组是后续实验的基础。
[0005]目前市场上的商用DNA提取试剂盒虽能得到质量较高的基因组DNA，但只是针对纯培养得到的微生物，对于直接从环境样品中提取微生物基因组DNA的试剂盒效果较差，非微生物物质会堵塞DNA吸附柱，并且提取的DNA质量不稳定。手工提取样品基因组的方法效率较低，并且容易导致基因组的损失。直接利用试剂盒提取烟叶表面细菌的基因组DNA时，细小的烟叶碎片及尘土会堵塞DNA吸附柱，影响效率，甚至导致实验中断，烤烟烟叶浸泡后会有部分油性物质溢出，在遇到一些化合物时会形成粘性较大絮状物，这也会堵塞吸附柱。本发明的方法中使用Trizol试剂的处理样品，不但能有效的防止DNA的降解，并在高速离心分层时可以使烟叶碎片及尘土沉降到离心管底部，直接收集中间相可以直接避免油性物质的影响。获得的DNA粗提液利用试剂盒处理，可以提高基因组DNA的获得率，提高提取效率。通过本发明可最大限度地提取烟叶样品中细菌的基因组DNA。

【发明内容】

[0006]本发明的目的在于提供一种提取陈化烟叶表面细菌基因组的方法，实现高效、方便提取大量烤烟烟叶表面细菌基因组的目的。
[0007]本发明提取陈化烟叶表面细菌基因组的方法通过以下步骤进行:
[0008](I)陈化烟叶表面细菌的富集
[0009]称取250g?300g的烟叶样品，剪碎，平均分装成4份，每份加入100mL的pH 7.0PBS缓冲液，充分震荡I?2小时；用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000 X g，4°C) 15?20min，弃上清，加入80mL的pH 7.0PBS缓冲液，将沉淀充分重悬，不超过80g离心(4°C )3min，弃沉淀，收集液体，再将液体离心(10000 X g，4°C ) 15?20min，弃上清，沉淀即为细菌富集物；
[0010](2)使用trizol试剂处理细菌富集物
[0011]在细菌富集物中加入对应量的trizol试剂，反复吹打均匀，室温静置5min，离心(12000g，4°C ) 1min，吸取上部液转移至一新的离心管内；加入对应量的氯仿，轻微震荡15s，冰上静置2min;离心(12000rpm，4°C)15min，弃上层水相，将中间相转移到一个新的离心管内，加入对应量的无水乙醇，混匀静置3min，2-8°C，不超过2000 X g离心5min，沉淀DNA；移去苯酚-乙醇上清液，沉淀既为基因组初提物；
[0012](3)使用试剂盒提取样品基因组
[0013]在沉淀中加入10yL 70°C温育的缓冲液TE，涡旋震荡直至沉淀全部溶解;加入500yL试剂盒自带的调节DNA存在环境条件的缓冲液;温和翻转4?6次混合均匀;吸取混合液加入到基因组提取试剂盒的离心吸附柱中，盖上管盖，12000rpm离心30?60秒，直至全部的混合液通过吸附柱;弃滤液，将吸附柱放回收集管中，再在吸附柱中加入500yL调节DNA环境条件的缓冲液;盖上管盖，12000rpm离心30?60秒;弃滤液，将吸附柱放回一个新的2mL收集管中，在吸附柱中加入600?800yL漂洗液(以各试剂盒自带漂洗液为准)，盖上管盖，12000rpm离心30?60秒;弃滤液，将吸附柱放回2mL收集管中，HOOOrpm离心I?2分钟。弃收集管，将吸附柱置于一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附柱中央加入100?150yL 70°C温育的缓冲液TE，盖上管盖，室温静置I分钟，12000rpm离心30?60秒;弃纯化柱，-20°C保存洗脱的DNA。
[0014]本发明方法采用了Trizol试剂与试剂盒提取相结合的方法，一方面用Trizol试剂可以避免烟叶碎末影响试剂盒离心柱膜的通透性的弊端，另一方面结合试剂盒提取可以有效提高基因组的获得率。
[0015]本发明前期处理烟叶样品时，所有接触到的工具必须经过灭菌或酒精擦拭，以免带入外界细菌污染样品。在富集细菌时，要保证每次离心的时间15?20min，若离心时间较少则影响富集细菌的种类和数量，增加最终实验结果的误差。实验过程中，收集中间相时要尽量避免吸取到下层沉淀物质，否则会影响试吸附柱的使用，还要充分去除苯酚-乙醇上清液，否则会影响是后续的实验，例如PCR、酶切等。
[0016]本发明具有如下优点=Trizol试剂的处理可以避免烟叶碎沫及尘土堵塞基因组提取试剂盒吸附柱膜的弊端，便于处理大量的烟叶样品；Trizol试剂处理后的基因组初提取液通过试剂盒离心吸附柱洗脱后，可以增加基因组的获得率，比传统手工洗脱后的基因组获得率高。
[0017]本发明方法针对烟叶样品的特殊性进行设计，避免烟叶碎沫及烟叶浸泡后溢出的油性物质对实验的不良影响。此方法可以运用于全部的陈化烟叶表面细菌基因组的提取， 具有应用范围广、提取效率高的特点。
【附图说明】
[0018]图1是利用手提方法CTAB/NaCl法提取K326品种陈化中的烟叶表面细菌基因组的琼脂糖凝胶电泳图谱；
[0019]图2是利用试剂盒提取K326品种陈化中的烟叶表面细菌基因组的琼脂糖凝胶电泳图谱；
[0020]图3是经Trizol试剂处理和试剂盒相结合的方法提取K326品种陈化中的烟叶表面细菌基因组的琼脂糖凝胶电泳图谱。
【具体实施方式】
[0021]下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法;实施例中所使用的材料、试剂如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
[0022]本发明一种提取陈化烟叶表面细菌基因组DNA的方法按如下步骤进行:
[0023](I)称取250g?300g的烟叶样品，剪碎，平均分装成4份，每份加入100mL的pH7.0PBS缓冲液，充分震荡I?2小时。
[0024](2)用双层纱布过滤收集浸泡液，将得到的过滤液进行离心(10000 X g，4°C ) 15?20min，弃上清，在沉淀中加入80mL的pH 7.0PBS缓冲液，将沉淀充分重悬，再将重悬液离心(不超过80g，4 °C) 3min，弃沉淀，收集液体，再将液体离心(10000 X g，4°C ) 15?20min，弃上清，收集沉淀。
[0025](3)按照每克沉淀物使用ImL trizol试剂的比例，在沉淀中加入相应的trizol试剂，用吸管或加样器反复吹打均匀，室温静置5min。
[0026](4)按照初始加入每毫升trizol试剂添加0.2mL氯仿的比例，在步骤(3)得到的上部液体中加入对应体积的氯仿，轻微震荡15s，冰上静置2min。离心(12000rpm，4°C ) 15min，弃上层水相，将中间相和下层有机相(其中含有DNA和蛋白质)转移到一个新的离心管内。
[OO27 ] (5)按照初始加入每毫升tr i zο I试剂添加0.3mL无水乙醇的比例，在中间相和下层相中加入对应体积的无水乙醇，混勾，静置3min，离心(2-8°C，不超过2000 X g)5min，沉淀DNA。充分移去苯酚-乙醇上清液，保留沉淀。
[0028](6)在沉淀中加入10yL 70°C温育的缓冲液TE，涡旋震荡直至沉淀全部溶解。
[0029](7)加入500yL调节DNA环境条件的缓冲液(以各试剂盒自带缓冲液为准)。温和翻转4?6次混合均匀。吸取混合液加入到基因组提取试剂盒的离心吸附柱中，盖上管盖，12000rpm离心30?60秒，直至全部的混合液通过吸附柱。
[0030](8)弃滤液，将吸附柱放回收集管中，再在吸附柱中加入500yL调节DNA环境条件的缓冲液。盖上管盖，12000rpm离心30?60秒。
[0031](9)弃滤液，将吸附柱放回一个新的2mL收集管中，在吸附柱中加入600?800yL漂洗液(以各试剂盒自带漂洗液为准)，盖上管盖，12000rpm离心30?60秒。
[0032](10)弃滤液，将吸附柱放回2mL收集管中，HOOOrpm离心I?2分钟。
[0033](11)弃收集管，将吸附柱置于一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附柱中央加入100?150yL 70 °C温育的缓冲液TE，盖上管盖，室温静置I分钟，12000rpm离心30?60秒。(如想增加DNA的获得率，可将滤液重新加入到吸附柱内，12000rpm离心30?60秒)。
[0034](12)弃纯化柱，洗脱的DNA立即进行16S rRNA基因扩增检测，判断基因组提取是否成功。将提取成功的基因组_20°C保存，用于后续实验。
[0035]利用16S rRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在45?55°C退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出细菌的16S rRNA基因，证明成功提取了基因组。
[0036]实施例1:利用CTAB/NaCl方法提取品种为K326烤烟在陈化中的烟叶表面细菌基因组基因组，包括以下步骤:
[0037](I)试剂的制备:
[0038]样品前处理试剂有pH = 8.0的I X TE缓冲液、20mg/mL的溶菌酶、质量体积比浓度20 %的SDS、5mo 1/L的氯化钠溶液、CTAB/NaCl溶液、20mg/ml的蛋白酶K溶液、20yg/ml的RNaseA溶液、氯仿、异戊醇、Tr i s饱和酸、异丙醇、质量百分比浓度70 %的乙醇;所述试剂的配制方法如下:
[0039]所述ILEDTA(pH=8.0，终浓度0.5M)的配制:取 186.1g Na2EDTA.2H20，用NaOH(约20g)调节pH = 8.0，用过滤的ddH20混合至IL，高温高压灭菌后室温保存；IM Tris-HCl(pH8.0)的配制:取121.1g Tris,加浓盐酸约42ml，高温高压灭菌后冷却至室温后调节pH=8.0；
[0040]所述ILlOX TE缓冲液(pH8.0)的配制:取100ml Tris-HCl (pH8.0，终浓度IM)、0.5MEDTA(pH8.0)取20ml，用过滤ddH20混合至IL，高温高压灭菌后，室温保存；I X TE Buffer是将10 X TE Buffer 稀释 1倍。
[0041 ] 所述20mg/mL溶菌酶的配制:用过滤的ddifeO配制成20mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于_20°C ;每一小份一经使用后便予丢弃。
[0042]所述20mg/ml蛋白酶K (proteinase K)的配制:将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合，加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20°C。
[0043]所述20yg/ml的RNaseA溶液的配制:将RNaseA溶解在0.0lM的醋酸钠缓冲液中(pH5.2)，使终浓度为1mol.ml/1，沸水煮15min，放在室温下，缓慢冷却，用0.1体积的IMTris-HCl(pH8.0)调整pH至7.4左右，分装小管保存在-20°(:备用，使用时稀释至2(^/1^。
[0044]所述CTAB/NaCl溶液(0.7mol/L NaCl，10%CTAB)的配制:称取4.1g NaCl，溶于80mL ddH20，磁力搅拌器搅拌的同时，缓慢加入1g CTAB，必要时可以65 °C加热促溶，冷却至室温后，加水定容至10mL，高压灭菌15min，室温保存。
[0045]所述氯仿:异戊醇(24:1)的配制:961^氯仿与41^异戊醇混合，4°(:保存。
[0046]所述Tris饱和酸:氯仿:异戊醇(25: 24:1)的配制;将Tris饱和酸、氯仿和异戊醇按体积比25:24:1混合，40C保存。
[0047]所述20%SDS(十二烷基硫酸钠)的配制:称取200g的SDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解；用水定容至1L;所述5mol/L氯化钠(NaCl)的配制:溶解29.2g氯化钠于足量的水中，用水定容至10ml。
[0048]所述pH 7.0PBS 缓冲液的配制(IL):称取 0.24g KH2P04、1.44g Na2HP04、8.0gNaCK0.2g KCl溶于700mL无菌水中，待完全溶解后，加HCl调节pH至7.0，加无菌水定容至1L，高压灭菌15min，室温保存。
[0049]其他试剂可通过试剂公司购买。
[0050](2)烟叶样品的前处理
[0051 ]每份加入100mL的pH 7.0PBS缓冲液，充分震荡I?2小时。用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000 X g，4°C ) 15?20min，弃上清，加入80mL的pH 7.0PBS缓冲液，将沉淀充分重悬，不超过80g离心(4°C )3min，弃沉淀，收集液体，再将液体离心(10000 Xg,40C) 15?20min，弃上清，沉淀即为细菌富集物。
[0052](3)CTAB/NaCl 法提取 DNA
[0053]往盛有Ig沉淀的离心管加入300μ1 20%的SDS溶液、1.2ml 5mol/L的NaCl溶液、0.9ml的CTAB/NaCl溶液，震荡混匀后加入25μ1 20mg/ml的蛋白酶K溶液，70 °(:水浴放置10分钟，将离心管取出，置于室温冷却，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1 )，混匀后1000rpm离心10分钟，小心将上清液吸出，注意不要吸到下层物质。
[0054]在吸出的上清中加入等体积的Tr i s饱和酚/氯仿/异戊醇混合液(Tr i s饱和酚:氯仿:异戊醇= 25:24:1)，混勾后1000rpm离心10分钟，小心将上清液吸出，注意不要吸到下层物质;在上一步吸出的上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，100rpm离心1min，放于4°C沉淀I小时，此步骤可能会出现沉淀;如出现沉淀，收集沉淀，用70 %乙醇离心洗涤沉淀；用lmLpH8.0的TE缓冲液溶解DNA，加入终浓度为20yg/mL的RNaseA，- 20 °C长期保存。
[0055](4)16S rRNA基因扩增检测提取的DNA基因组
[0056]利用16SrRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在57°C退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出细菌的16S rRNA基因，证明成功提取了基因组。
[0057]由电泳图谱I我们可以发现:2、3、4泳道没有明显的DNA目的条带，其中2、3、4泳道为三个样品的重复实验，表明本实验的DNA提取是失败的。
[0058]实施例2:利用DNA提取试剂盒提取K326品种陈化中的烟叶表面细菌基因组
[0059](I)样品前处理试剂的配制
[0060]样品前处理试剂有P H 7.0 P B S缓冲液，其配制方法见案例一。D N A试剂盒采用Simgen 土壤DNA纯化试剂盒，其中所用试剂的使用及实验操作过程均按试剂盒操作说明操作。(2)叶样品的前处理
[0061 ]每份加入100mL的pH 7.0PBS缓冲液，充分震荡I?2小时。用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000 X g，4°C ) 15?20min，弃上清，加入80mL的pH 7.0PBS缓冲液，将沉淀充分重悬，不超过80g离心(4°C )3min，弃沉淀，收集液体，再将液体离心(10000 Xg,40C) 15?20min，弃上清，沉淀即为细菌富集物。
[0062 ] (3)利用试剂盒提取细菌基因组
[0063] 利用Simgen土壤DNA纯化试剂盒提取细菌总DNA，操作步骤:用2mL样品管称取少于500mg 土壤，加入600yL去离子纯水，旋紧管盖。放在漩涡振荡器上以最高速处理3分钟。加入600yL Buffer ST，再加入20yL蛋白酶K贮存液，盖上管盖混匀，70 °C水浴15分钟。水浴期间每隔5分钟剧烈旋涡振荡30秒。13000rpm离心10分钟，吸取少于SOOyL上清并转移到另一个洁净的2mL离心管中。加入1.25倍体积已加入异丙醇的Buffer IS，温和地翻转4?6次混合均匀。13000rpm离心2分钟。弃上清，3000rpm离心5?10秒使残留的上清液聚集到管底，用移液器吸尽上清液，保留管底沉淀。加入10yL 70°C温育的Buffer TE，旋涡振荡直至沉淀全部溶解。加入500yL Buffer SL，温和地翻转4?6次混合均匀。吸取混合液加入到核酸纯化柱中，置于2mL收集管内，盖上管盖，12000rpm离心30秒。弃滤液，将核酸纯化柱放回收集管，在纯化柱中加入500yL Buffer SL，盖上管盖，12000rpm离心30秒。弃滤液，将核酸纯化柱放回收集管内，在纯化柱中加入600yL Buffer WB，盖上管盖，12000rpm离心30秒。弃滤液，将核酸纯化柱放回收集管，HOOOrpm离心I分钟。弃收集管，将核酸纯化柱放入一个洁净的1.5mL离心管内，在纯化柱膜中央加入100?200yL 70°C温育的Buffer TE，盖上管盖，室温静置I分钟，12000rpm离心30秒。弃纯化柱，洗脱的DNA可立即用于各种分子生物学实验;或者将DNA储存于-20 °C备用。
[0064](4)16S rRNA基因扩增检测提取的DNA基因组
[0065]利用16SrRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在57°C退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出细菌的16S rRNA基因，证明成功提取了基因组。
[0066]由电泳图谱2我们可以发现:2、3、4泳道没有明显的DNA目的条带，其中2、3、4泳道为三个样品的重复实验，表明本实验的DNA提取是失败的。
[0067]实施例3:利用Trizol试剂与试剂盒结合的方法提取K326品种陈化中的烟叶表面细菌基因组
[0068](I)样品前处理试剂的配制
[0069]样品前处理试剂有pH 7.0PBS缓冲液，其配制方法见案例一。DNA试剂盒采用Simgen 土壤DNA纯化试剂盒，trizol试剂市场上购买。
[0070](2)叶样品的前处理
[0071]每份加入100mL的pH7.0PBS缓冲液，充分震荡I?2小时。用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000 X g，4°C ) 15?20min，弃上清，加入80mL的pH 7.0PBS缓冲液，将沉淀充分重悬，不超过80g离心(4°C )3min，弃沉淀，收集液体，再将液体离心(10000 Xg,40C) 15?20min，弃上清，沉淀即为细菌富集物。
[0072](3)利用Trizol试剂与试剂盒结合的方法提取细菌基因组
[0073]称取Ig沉淀物置于一洁净的2mL离心管内，在沉淀中加入ImL trizol试剂，用加样器反复吹打均匀，室温静置5min，加入0.2mL氯仿到上部液体中，轻微震荡15s，冰上静置
) 15min，弃上层水相，将中间相转移到一个新的离心管内。加入
0.3mL无水乙醇，混匀，静置3min，离心(2_8°C，不超过2000Xg)5min，沉淀DNA。充分移去苯酚-乙醇上清液，保留沉淀。在沉淀中加入10yL 700C温育的缓冲液TE，涡旋震荡直至沉淀全部溶解。加入500yL调节DNA环境条件的缓冲液(以各试剂盒自带缓冲液为准)。温和翻转4?6次混合均匀。吸取混合液加入到基因组提取试剂盒的离心吸附柱中，盖上管盖，12000rpm离心30?60秒，直至全部的混合液通过吸附柱。弃滤液，将吸附柱放回收集管中，再在吸附柱中加入500yL调节DNA环境条件的缓冲液。盖上管盖，12000rpm离心30?60秒。弃滤液，将吸附柱放回一个新的2mL收集管中，在吸附柱中加入600?SOOyL漂洗液(以各试剂盒自带漂洗液为准)，盖上管盖，12000rpm离心30?60秒。弃滤液，将吸附柱放回2mL收集管中，14000rpm离心I?2分钟。弃收集管，将吸附柱置于一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附柱中央加入100?150yL 70°C温育的缓冲液TE，盖上管盖，室温静置I分钟，12000rpm离心30?60秒。再将滤液重新加入到吸附柱内，12000rpm离心30?60秒。弃纯化柱，将提取成功的基因组-20°C保存，用于后续实验。
[0074](4)16S rRNA基因扩增检测提取的DNA基因组
[0075]利用16SrRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在57°C退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出细菌的16S rRNA基因，证明成功提取了基因组。
[0076]由电泳图谱3我们可以发现:2、3、4泳道有明显的DNA目的条带，大小约为1600bp，
2、3、4泳道为三个样品的重复实验，表明本实验的DNA提取是成功的。
[0077]本发明方法提供的方法应用于云南省K326、红大等品种的陈化烤烟烟叶细菌基因组的提取，都达到良好的提取效果，提取的基因组均可用于各类分子学实验。
【主权项】
1.一种提取陈化烟叶表面细菌基因组DNA的方法，其特征在于按如下步骤进行: (1)陈化烟叶表面细菌的富集 称取250g?300g的烟叶样品，剪碎，平均分装成4份，每份加入100mL的pH 7.0PBS缓冲液，充分震荡I?2小时；用双层纱布过滤收集浸泡液，将过滤液离心(10000 X g，4°C ) 15?20min，弃上清，加入80mL的pH 7.0PBS缓冲液，将沉淀充分重悬，不超过80g离心(4°C)3min，弃沉淀，收集液体，再将液体离心(10000 X g，4°C ) 15?20min，弃上清，沉淀即为细菌富集物； (2)使用1:1^201试剂处理细菌富集物 在细菌富集物中加入对应量的tri Z01试剂，反复吹打均匀，室温静置5min，离心(12000g，4°C ) 1min，吸取上部液转移至一新的离心管内；加入对应量的氯仿，轻微震荡15s，冰上静置2min;离心(12000rpm，4°C)15min，弃上层水相，将中间相转移到一个新的离心管内，加入对应量的无水乙醇，混匀静置3min，2-8°C，不超过2000 X g离心5min，沉淀DNA；移去苯酚-乙醇上清液，沉淀既为基因组初提物； (3)使用试剂盒提取样品基因组 在沉淀中加入10yL 70°C温育的缓冲液TE，涡旋震荡直至沉淀全部溶解;加入500yL试剂盒自带的调节DNA存在环境条件的缓冲液;温和翻转4?6次混合均匀;吸取混合液加入到基因组提取试剂盒的离心吸附柱中，盖上管盖，12000rpm离心30?60秒，直至全部的混合液通过吸附柱;弃滤液，将吸附柱放回收集管中，再在吸附柱中加入500yL调节DNA环境条件的缓冲液;盖上管盖，12000rpm离心30?60秒;弃滤液，将吸附柱放回一个新的2mL收集管中，在吸附柱中加入600?800yL漂洗液，盖上管盖，12000rpm离心30?60秒;弃滤液，将吸附柱放回2mL收集管中，14000rpm离心I?2分钟;弃收集管，将吸附柱置于一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附柱中央加入100?150yL 70 °C温育的缓冲液TE，盖上管盖，室温静置I分钟，12000rpm离心30?60秒;弃纯化柱，_20°C保存洗脱的DNA。
【文档编号】C12N15/10GK105950611SQ201610415231
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】王毅, 高锐, 宋鹏飞, 张光煦, 杨威, 魏云林, 浦绍占, 季秀玲
【申请人】云南中烟工业有限责任公司