一种抑制人AEBP1基因表达的shRNA分子的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制人AEBP1基因表达的shRNA分子，依据Genbank中人AEBP1基因(基因序列号：NM_001129.4)；设计4条shRNA分子，针对shRNA序列进行合成，将合成的两条互补单链shRNA分子经退火形成双链后，连接到慢病毒载体上，构建4个慢病毒干扰RNA质粒。将shRNA质粒转染含AEBP1的Huh7细胞系，通过实时定量PCR对AEBP1基因进行相对定量分析，评价对AEBP1基因表达的抑制效果。通过相对定量分析得出：AEBP1?shRNA1能够有效抑制82.3%的AEBP1的转录，AEBP1?shRNA2能够抑制75.7%的AEBP1的转录。
【专利说明】
一种抑制人AEBP1基因表达的shRNA分子
技术领域
[0001]本发明涉及能够对脂肪细胞增强结合蛋白l(Adipocyte Enhancer-bindingProtein I，AEBP1)基因产生显著抑制作用的shRNA分子的设计、合成和抑制作用在肝细胞上的评价方法。
【背景技术】
[0002]脂肪细胞增强结合蛋白l(Adipocyte enhancer-binding protein I，AEBPl)是一种转录抑制因子，分子量82kDa，在脂肪组织中高表达，参与前脂细胞中的脂肪形成。另外AEBPl肝脏、肺、脾、脑及原代巨噬细胞中表达水平也较高。
[0003]已有研究证明AEBPl参与小鼠巨噬细胞的胆固醇平衡、泡沫细胞形成及巨噬细胞、肝细胞炎症反应。AEBPI高表达促进小鼠体内炎性因子的释放。其具体机制是AEBPI通过激活NF-κΒ通路，促进炎性因子IL-6、TNF-α、MCP-1和iNOS等的释放。这一过程主要依赖于AEBPl与ΙκΒα的蛋白-蛋白相互作用，AEBPl与ΙκΒα结合后，促进ΙκΒα的Ser32/Ser36磷酸化，导致IicBa的磷酸化降解，从而使NF-κΒ磷酸化并转入细胞核，启动靶基因(如炎性因子)的转录。
[0004]另外实验还发现AEBPl介导LPS诱导的巨噬细胞向泡沫细胞的分化，AEBPl过表达的小鼠更易产生肥胖。进一步研究发现，AEBPl的过表达能够抑制巨噬细胞PPARy I(peroxisome proliferator-activated receptor γ?)和 LXRa(liver X receptor a)，以及二者的革巴基因ABCAl (ATP-binding cassette Al)、ABCG1 (ATP-binding cassetteGl),ApoE (apolipoprotein E)和CD36的表达，这些蛋白是胆固醇向高密度脂蛋白转移的重要参与者。在小鼠体内敲除AEBPl的表达，有助于降低体重。LPS刺激巨噬细胞，诱导细胞内AEBPl表达上调。抑制AEBPl的表达能够抵抗LPS导致的感染性休克和革兰氏阴性菌感染引起的动脉粥样硬化。
[0005]因此可以看出AEBPl参与炎症和脂代谢相关的疾病病理反应，干扰AEBPl的表达有助于疾病的预防和治疗。然而目前尚没有抑制人AEBPl表达的shRNA分子。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种抑制人AEBPl基因表达的shRNA分子，对人AEBPl基因表达有显著抑制作用，为AEBPl过表达相关疾病的治疗提供了应用基础。
[0007]本发明是采用如下技术方案实现的:
一种抑制人AEBPl基因表达的shRNA分子，所述AEBPl基因在GenBank中序列号为NM_001129.4。所述shRNA分子包括shRNAl和shRNA2两种;其中，shRNAl分子的正义链模板序列为:
5’-GATCCGCTATGAGGAAATGACCTTTCTTCAAGAGAGAAAGGTCATTTCCTCATAGCTTTTTTG-3’，反义链模板序列为:
5’-AATTCAAAAAAGCTATGAGGAAATGACCTTTCTCTCTTGAAGAAAGGTCATTTCCTCATAGCG-3’；shRNA2分子的正义链模板序列为:5 ’-GATCCGGTGGTGATTACTGGCGAATCTTCAAGAGAGATTCGCCAGTAATCACCACCTTTTTTG-3 ’， 反义链模板序列为:AATTCAAAAAAGGTGGTGATTACTGGCGAATCTCTCTTGAAGATTCGCCAGTAATCACCACCG。
[0008] 本发明针对人的AEBP1基因序列合成一组shRNA分子，筛选出两个shRNAl和 shRNA2，经qRT-PCR法检测，可以有效降低AEBP1基因的表达，从而显著降低AEBP1蛋白水平的表达，并在人肝癌细胞株Huh7上进行了验证。通过定量分析得出，AEBPl-shRNAl能够有效抑制82.3%的AEBP1的转录，AEBPl-shRNA2能够抑制75.7%的AEBP1的转录。
[0009]本发明具有如下应用意义:一些感染性疾病如革兰氏阴性菌感染、病毒感染(乙肝病毒、丙肝病毒)等通过引起细胞内AEBP1表达升高，引起持续的炎症反应和脂代谢紊乱，促进病毒性肝炎、感染性休克及动脉粥样硬化等疾病的发展进程。抑制AEBP1的表达能够减弱上述疾病的发展进程。本发明筛选出的shRNA分子能够显著降低AEBP1的表达。【附图说明】
[0010]附图1是本发明实施例中采用实时定量PCR法检测本发明的shRNA转染对AEBP1表达的抑制效果的结果图。【具体实施方式】
[0011]下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。[0〇12]本发明中抑制人AEBP1基因的shRNA分子合成方法如下:依据Genbank中人AEBP 1基因，基因序列号:匪_001129.4;设计4条shRNA分子，针对 shRNA序列进行合成得到两条互补单链shRNA分子，即shRNAl和shRNA2,此两个shRNA分子经退火形成双链后，连接到慢病毒载体上，构建4个慢病毒干扰RNA质粒。[0〇13]为了测试合成的shRNA分子对人AEBP1基因表达的抑制效果，采用如下方法将 shRNA质粒转染含AEBP1的Huh7细胞系:将表达AEBP1的Huh7细胞接种24孔板，1.5 X 105个/ 孔的密度，用500ul含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，24h后细胞达到约75%的汇合度，取100ul opt1-MEM，将2ul脂质体1 ipofectamin2000与0 ? 8ug质粒预混，室温静置20min 后，加到培养的Huh7细胞上清中。6h后更换为含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，再培养 48h后，用Trizol法抽提总RNA。
[0014] 上述转染细胞的总RNA，通过实时定量PCR对AEBP1基因进行相对定量分析，评价对 AEBP1基因表达的抑制效果；定量分析方法如下:一步法Real time PCR检测试剂盒购自 TAKARA公司，进行Real Time PCR反应体系为:2X0ne Step RT-PCR Buffer III 12.5ul， Takara Ex Taq HS 0.5ul，PrimerScript RT enzyme Mix II 0.5ul，上下游引物(lOuM)各 0.5ul，TaqMan probe lul，total RNA 2ul，RNase free dH20 7.5111。卩0?反应条件为:hold 42°C 5min，hold 95°C 10s，cycle 95°C 5s、60°C 20s，40个循环。通过相对定量分析得出:六￡8?1-8111?财1能够有效抑制82.3%的4￡8?1的转录4￡8?1-8111?财2能够抑制75.7%的 AEBP1的转录，如附图1所示。
[0015]上述实施例中选用的〇pt1-MEM培养液、DMEM培养液、购自美国Gibco公司，脂质体 lipofectamin2000购自美国Invitrogen公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA抽提试剂Trizol、定量PCR试剂盒购自TAKARA公司；shRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成。
[0016]
以上实施例仅仅是本发明的优选实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。同时，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
【主权项】
1.一种抑制人AEBP1基因表达的shRNA分子，所述AEBP1基因在GenBank中序列号为NM_ 001129.4，其特征在于，所述shRNA分子包括shRNAl和shRNA2两种;其中， shRNAl分子的正义链模板序列为.5 ’-GATCCGCTATGAGGAAATGACCTTTCTTCAAGAGAGAAAGGTCATTTCCTCATAGCTTTTTTG-3 ’，反义链模板序列为.5 ’-AATTCAAAAAAGCTATGAGGAAATGACCTTTCTCTCTTGAAGAAAGGTCATTTCCTCATAGCG-3 ’； shRNA2分子的正义链模板序列为.5 ’-GATCCGGTGGTGATTACTGGCGAATCTTCAAGAGAGATTCGCCAGTAATCACCACCTTTTTTG-3 ’，反义链模板序列为AATTCAAAAAAGGTGGTGATTACTGGCGAATCTCTCTTGAAGATTCGCCAGTAATCACCACCG。
【文档编号】C12N15/113GK105950619SQ201610246220
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】刘媛
【申请人】刘媛