基于铁蛋白纳米结构的新型her2靶向治疗性抗体的制备方法及应用
【专利摘要】本发明涉及一种基于铁蛋白纳米结构的新型HER2靶向治疗性抗体的制备方法，构建鸡卵清白蛋白OVA启动子纳米铁蛋白笼Ferritin的慢病毒表达载体，并通过脂质体转染在293T细胞内进行包装产毒，将病毒液进行浓缩及滴度测定；然后将病毒液于新鲜受精胚进行胚盘下腔注射，继续孵化至出壳；待鸡性成熟，对精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，筛出阳性鸡；以G0代阳性鸡与阴性异性鸡进行交配，对G1代鸡组织，精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，待性成熟，筛出阳性鸡，再与阴性异性鸡进行交配，同样方法筛出G2代阳性鸡，并对各代阳性母鸡的蛋清进行Western Blot及ELISA鉴定；即可得到能稳定遗传并在蛋清中稳定表达治疗恶性肿瘤的纳米铁蛋白与单克隆抗体融合蛋白的新品种鸡。具有制得的蛋白载量大，可以口服的优点。
【专利说明】
基于铁蛋白纳米结构的新型HER2靶向治疗性抗体的制备方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种靶向治疗性抗体的制备方法，特别是涉及一种基于铁蛋白纳米结构的新型HER2靶向治疗性抗体的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]基于铁蛋白纳米粒子具有耐高温、不易变性、自组装及比表面积大的生物化学特性。目前，用于治疗恶性肿瘤的注射剂型靶向治疗性抗体存在安全风险高的问题。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种制得的蛋白载量大，可以口服的基于铁蛋白纳米结构的新型HER2靶向治疗性抗体的制备方法，本发明目的还在于提供该方法的应用。
[0004]为实现上述目的，本发明基于铁蛋白纳米结构的新型HER2(或称为ErbB2)靶向治疗性抗体的制备方法依次包括如下步骤:
[0005]I)、构建鸡卵清白蛋白OVA启动子纳米铁蛋白笼Ferr itin的慢病毒表达载体，并通过脂质体转染在293T细胞内进行包装产毒，将病毒液进行浓缩及滴度测定；
[0006]2)、然后将病毒液于新鲜受精胚进行胚盘下腔注射，继续孵化至出壳;待鸡性成熟，对精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，筛出阳性鸡；
[0007]或然后将病毒液对育雏期末或育成期的公鸡进行病毒睾丸注射，公鸡饲养一个月后，取鸡精在荧光显微镜下进行观察，如果发现带有荧光的精子，用这种精子进行人工受精，生出的蛋进行孵化，孵出的小鸡部分带有靶向治疗性抗体的转基因阳性鸡；
[0008]3)、以GO代阳性鸡与阴性异性鸡进行交配，对Gl代鸡组织，精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，待性成熟，筛出阳性鸡，再与阴性异性鸡进行交配，同样方法筛出G2代阳性鸡，并对各代阳性母鸡的蛋清进行Western Blot及ELISA鉴定；S卩可得到能稳定遗传并在蛋清中稳定表达治疗恶性肿瘤的纳米铁蛋白与单克隆抗体融合蛋白的新品种鸡。具有制得的蛋白载量大，可以口服的优点。
[0009]作为优化，所述鸡卵清白蛋白OVA启动子为-HER2H-1RES-HER2L。
[0010]作为优化，所述鸡卵清白蛋白OVA启动子-HER2H-1RES-HER2L嵌合抗体的重链HER2H基因及轻链HER2L基因，IRES是个双向启动子序列，可以同时启动HER2H基因及HER2L基因的翻译。
[0011 ]作为优化，所述靶向治疗性抗体为带有HER2(ErbB2)的靶向治疗性抗体。
[0012]作为优化，所述将病毒液于新鲜受精胚进行胚盘下腔注射，继续孵化是:(I)、取受精种蛋用1%新洁而灭消毒，放置在蛋托上静置24小时，大头放上；(2)、在大头上用碘酊消毒，75%的酒精脱碘，在最顶端打一小孔，直径约2至3_大小，剥开鸡蛋内膜，看见浮在蛋清上面的鸡胚；(3)、用注射器向鸡胚注入10-50微升左右的慢病毒载体；(4)、用石腊封口后，放入孵化箱孵化。孵出的小鸡部分带有表达HER2 (ErbB2)靶向治疗性抗体的转基因鸡。
[0013]作为优化，所述对公鸡进行病毒睾丸注射是临注射前，病毒浓缩液加入Polybrene至最终浓度3ug/ml混均待用；取4-15周龄公鸡以速眠新II全身麻醉剂，按0.2mL/kg体重肌肉注射公鸡，麻醉后，右侧肋骨处开2-3cm切口，暴露两侧睾丸，分别随机点注射病毒浓缩液，每侧睾丸注射4-5点，注射约0.5mL，缝合创口，注射药物防感染。所述注射药物防感染是注射破伤风一次及青、链霉素一周，以防感染。
[0014]本发明方法的应用是用于在卵清中生产基于铁蛋白纳米结构的HER2(ErbB2)人鼠嵌合抗体。
[0015]作为优化，所述HER2(ErbB2)人鼠嵌合抗体是HER2靶向人鼠嵌合单克隆抗体。
[0016]作为优化，所述HER2靶向人鼠嵌合单克隆抗体是由鼠单抗的可变区基因与人IgG的恒定区基因嵌合而成，可以特异性的结合到细胞膜HER2(ErbB2)受体蛋白的胞外区的第IV结构域，一方面通过位阻效应，阻碍了 HER2(ErbB2) 二聚体的形成，使HER2(ErbB2)不能往下传递信号通路，一方面通过募集体内的免疫细胞与免疫因子系统，将HER2(ErbB2)阳性的癌细胞消灭，进而起到扼制HER2阳性恶性肿瘤的疗效。
[0017]本方法生产的蛋白载量大，可以口服，降低了注射剂引起的安全风险，且可以用于治疗HER2阳性的乳腺癌等恶性肿瘤。
[0018]即利用基因工程技术构建了鸡卵清白蛋白OVA启动子-HER2H-1RES-HER2L(嵌合抗体的重链HER2H基因及轻链HER2L基因，IRES是个双向启动子序列，可以同时启动HER2H基因及HER2L基因的翻译)-Ferritin(纳米铁蛋白笼)的慢病毒表达载体，并通过脂质体转染在293T细胞内进行包装产毒，将病毒液进行浓缩及滴度测定。然后将病毒液于新鲜受精胚进行胚盘下腔注射，继续孵化至出壳。待鸡性成熟，对精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，筛出阳性鸡。以GO代阳性鸡与阴性异性鸡进行交配，对Gl代鸡组织，精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，待性成熟，筛出阳性鸡，再与阴性异性鸡进行交配，同样方法筛出G2代阳性鸡，并对各代阳性母鸡的蛋清进行Western Blot及ELISA鉴定。即可得到能稳定遗传并在蛋清中稳定表达治疗恶性肿瘤的纳米铁蛋白与单克隆抗体融合蛋白的新品种鸡。本发明方法操作简单，可操作性强，可以有效得到稳定遗传并在蛋清中稳定表达药用蛋白的新品种鸡。本方法可用于在卵清中生产基于铁蛋白纳米结构的HER2人鼠嵌合抗体。基于铁蛋白纳米粒子耐高温、不易变性、自组装及比表面积大的生物化学特性，本方法生产的蛋白载量大，可以口服，降低了注射剂引起的安全风险，且可以用于治疗HER2阳性的乳腺癌等恶性肿瘤。HER2靶向人鼠嵌合单克隆抗体，由鼠单抗的可变区基因与人IgG的恒定区基因嵌合而成，可以特异性的结合到细胞膜HER2受体蛋白的胞外区的第IV结构域，一方面通过位阻效应，阻碍了 HER2 二聚体的形成，使HER2不能往下传递信号通路，一方面通过募集体内的免疫细胞与免疫因子系统，将HER2阳性的癌细胞消灭，进而起到扼制HER2阳性恶性肿瘤的疗效。
[0019]采用上述技术方案后，本发明基于铁蛋白纳米结构的新型HER2靶向治疗性抗体的制备方法及应用具有制得的蛋白载量大，可以口服的优点。
【具体实施方式】
[0020]本发明基于铁蛋白纳米结构的新型HER2(或ErbB2)靶向治疗性抗体的制备方法依次包括如下步骤:
[0021 ] I)、构建鸡卵清白蛋白OVA启动子纳米铁蛋白笼Ferritin的慢病毒表达载体，并通过脂质体转染在293T细胞内进行包装产毒，将病毒液进行浓缩及滴度测定；
[0022]2)、然后将病毒液于新鲜受精胚进行胚盘下腔注射，继续孵化至出壳;待鸡性成熟，对精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，筛出阳性鸡；
[0023]或然后将病毒液对育雏期末或育成期的公鸡进行病毒睾丸注射，公鸡饲养一个月后，取鸡精在荧光显微镜下进行观察，如果发现带有荧光的精子，用这种精子进行人工受精，生出的蛋进行孵化，孵出的小鸡部分带有靶向治疗性抗体的转基因阳性鸡；
[0024]3)、以GO代阳性鸡与阴性异性鸡进行交配，对Gl代鸡组织，精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，待性成熟，筛出阳性鸡，再与阴性异性鸡进行交配，同样方法筛出G2代阳性鸡，并对各代阳性母鸡的蛋清进行Western Blot及ELISA鉴定；S卩可得到能稳定遗传并在蛋清中稳定表达治疗恶性肿瘤的纳米铁蛋白与单克隆抗体融合蛋白的新品种鸡。具有制得的蛋白载量大，可以口服的优点。
[0025]优选所述鸡卵清白蛋白OVA启动子为-HER2H-1RES-HER2L。
[0026]更优选所述鸡卵清白蛋白OVA启动子-HER2H-1RES-HER2L嵌合抗体的重链HER2H基因及轻链HER2L基因，IRES是个双向启动子序列，可以同时启动HER2H基因及HER2L基因的翻译。
[0027]优选所述靶向治疗性抗体为带有HER2(ErbB2)的靶向治疗性抗体。
[0028]优选所述将病毒液于新鲜受精胚进行胚盘下腔注射，继续孵化是:(I)、取受精种蛋用I %新洁而灭消毒，放置在蛋托上静置24小时，大头放上；(2)、在大头上用碘酊消毒，75%的酒精脱碘，在最顶端打一小孔，直径约2至3_大小，剥开鸡蛋内膜，看见浮在蛋清上面的鸡胚；(3)、用注射器向鸡胚注入10-50微升左右的慢病毒载体；(4)、用石腊封口后，放入孵化箱孵化。孵出的小鸡部分带有表达HER2 (ErbB2)靶向治疗性抗体的转基因鸡。
[0029]优选所述对公鸡进行病毒睾丸注射是临注射前，病毒浓缩液加入Polybrene至最终浓度3ug/ml混均待用；取4-15周龄公鸡以速眠新II全身麻醉剂，按0.2mL/kg体重肌肉注射公鸡，麻醉后，右侧肋骨处开2_3cm切口，暴露两侧睾丸，分别随机点注射病毒浓缩液，每侧睾丸注射4-5点，注射约0.5mL，缝合创口，注射药物防感染。所述注射药物防感染是注射破伤风一次及青、链霉素一周，以防感染。
[0030]本发明方法的应用是用于在卵清中生产基于铁蛋白纳米结构的HER2(ErbB2)人鼠嵌合抗体。
[0031 ]优选所述HER2(ErbB2)人鼠嵌合抗体是HER2靶向人鼠嵌合单克隆抗体，由鼠单抗的可变区基因与人IgG的恒定区基因嵌合而成，可以特异性的结合到细胞膜HER2(ErbB2)受体蛋白的胞外区的第IV结构域，一方面通过位阻效应，阻碍了HER2(ErbB2)二聚体的形成，使HER2(ErbB2)不能往下传递信号通路，一方面通过募集体内的免疫细胞与免疫因子系统，将HER2(ErbB2)阳性的癌细胞消灭，进而起到扼制HER2阳性恶性肿瘤的疗效。
[0032]更优选所述HER2靶向人鼠嵌合单克隆抗体是由鼠单抗的可变区基因与人IgG的恒定区基因嵌合而成，可以特异性的结合到细胞膜HER2(ErbB2)受体蛋白的胞外区的第IV结构域，一方面通过位阻效应，阻碍了 HER2 (ErbB2) 二聚体的形成，使HER2 (ErbB2)不能往下传递信号通路，一方面通过募集体内的免疫细胞与免疫因子系统，将HER2(ErbB2)阳性的癌细胞消灭，进而起到扼制HER2阳性恶性肿瘤的疗效。
[0033]本方法生产的蛋白载量大，可以口服，降低了注射剂引起的安全风险，且可以用于治疗HER2阳性的乳腺癌等恶性肿瘤。
[0034]即利用基因工程技术构建了鸡卵清白蛋白OVA启动子-HER2H-1RES-HER2L(嵌合抗体的重链HER2H基因及轻链HER2L基因，IRES是个双向启动子序列，可以同时启动HER2H基因及HER2L基因的翻译)-Ferritin(纳米铁蛋白笼)的慢病毒表达载体，并通过脂质体转染在293T细胞内进行包装产毒，将病毒液进行浓缩及滴度测定。然后将病毒液于新鲜受精胚进行胚盘下腔注射，继续孵化至出壳。待鸡性成熟，对精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，筛出阳性鸡。以GO代阳性鸡与阴性异性鸡进行交配，对Gl代鸡组织，精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，待性成熟，筛出阳性鸡，再与阴性异性鸡进行交配，同样方法筛出G2代阳性鸡，并对各代阳性母鸡的蛋清进行Western Blot及ELISA鉴定。即可得到能稳定遗传并在蛋清中稳定表达治疗恶性肿瘤的纳米铁蛋白与单克隆抗体融合蛋白的新品种鸡。本发明方法操作简单，可操作性强，可以有效得到稳定遗传并在蛋清中稳定表达药用蛋白的新品种鸡。本方法可用于在卵清中生产基于铁蛋白纳米结构的HER2人鼠嵌合抗体。基于铁蛋白纳米粒子耐高温、不易变性、自组装及比表面积大的生物化学特性，本方法生产的蛋白载量大，可以口服，降低了注射剂引起的安全风险，且可以用于治疗HER2阳性的乳腺癌等恶性肿瘤。HER2靶向人鼠嵌合单克隆抗体，由鼠单抗的可变区基因与人IgG的恒定区基因嵌合而成，可以特异性的结合到细胞膜HER2受体蛋白的胞外区的第IV结构域，一方面通过位阻效应，阻碍了 HER2 二聚体的形成，使HER2不能往下传递信号通路，一方面通过募集体内的免疫细胞与免疫因子系统，将HER2阳性的癌细胞消灭，进而起到扼制HER2阳性恶性肿瘤的疗效。
[0035]具体如下:
[0036]一、慢病毒载体的构建:
[0037]1.构建鸡卵清白蛋白OVA启动子-HER2H-1RES-HER2L(嵌合抗体的重链HER2H基因及轻链HER2L基因，IRES是个双向启动子序列，可以同时启动HER2H基因及HER2L基因的翻译)-Ferritin(纳米铁蛋白笼)的慢病毒表达载体。
[0038]2.测序验证；
[0039]3.通过脂质体转染在293T细胞内进行包装产毒，将病毒液进行浓缩及滴度测定。
[0040]二、鸡胚注射实例:
[0041]1、取受精种蛋用1%新洁而灭消毒，放置在蛋托上静置24小时，大头放上。
[0042]2、在大头上用碘酊消毒，75%的酒精脱碘，在最顶端打一小孔，直径约2至3mm大小，剥开鸡蛋内膜，看见浮在蛋清上面的鸡胚。
[0043]3、用注射器向鸡胚注入10-50微升左右的慢病毒载体。
[0044]4、用石腊封口后，放入孵化箱孵化，孵出的小鸡部分带有表达HER2 (ErbB2)靶向治疗性抗体的转基因鸡。
[0045]三、病毒睾丸注射实例:
[0046]临注射前，病毒浓缩液加入Polybrene至最终浓度3ug/ml混均待用。取4-15周龄公鸡以速眠新II全身麻醉剂，按0.2mL/kg体重肌肉注射公鸡，麻醉后，右侧肋骨处开2-3cm切口，暴露两侧睾丸，分别随机点注射病毒浓缩液，每侧睾丸注射4-5点，注射约0.5mL，缝合创口，注射破伤风一次及青、链霉素一周，以防感染。
[0047]上述公鸡饲养一个月后，取鸡精在荧光显微镜下进行观察，如果发现带有荧光的精子，用这种精子进行人工受精，生出的蛋进行孵化，孵出的小鸡部分带有HER2 (ErbB2)靶向治疗性抗体的转基因鸡。
[0048]四、检测:
[0049]孵出的小鸡经PCR检测，确定带有HER2 (ErbB2)靶向治疗性抗体，这种鸡就是带有HER2 (ErbB2)靶向治疗性抗体的转基因鸡。
[0050]采用上述技术方案后，本发明基于铁蛋白纳米结构的新型HER2靶向治疗性抗体的制备方法及应用具有制得的蛋白载量大，可以口服的优点。
【主权项】
1.一种基于铁蛋白纳米结构的新型HER2革El向治疗性抗体的制备方法，其特征在于依次包括如下步骤: 1)、构建鸡卵清白蛋白OVA启动子纳米铁蛋白笼Ferrit in的慢病毒表达载体，并通过脂质体转染在293T细胞内进行包装产毒，将病毒液进行浓缩及滴度测定； 2)、然后将病毒液于新鲜受精胚进行胚盘下腔注射，继续孵化至出壳;待鸡性成熟，对精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，筛出阳性鸡； 或然后将病毒液对育雏期末或育成期的公鸡进行病毒睾丸注射，公鸡饲养一个月后，取鸡精在荧光显微镜下进行观察，如果发现带有荧光的精子，用这种精子进行人工受精，生出的蛋进行孵化，孵出的小鸡部分带有靶向治疗性抗体的转基因阳性鸡； 3)、以GO代阳性鸡与阴性异性鸡进行交配，对Gl代鸡组织，精浆及未受精蛋的胚珠进行基因组PCR鉴定，待性成熟，筛出阳性鸡，再与阴性异性鸡进行交配，同样方法筛出G2代阳性鸡，并对各代阳性母鸡的蛋清进行Western Blot及ELISA鉴定；S卩可得到能稳定遗传并在蛋清中稳定表达治疗恶性肿瘤的纳米铁蛋白与单克隆抗体融合蛋白的新品种鸡。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述鸡卵清白蛋白OVA启动子为-HER2H-1RES-HER2L。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于所述鸡卵清白蛋白OVA启动子-HER2H-1RES-HER2L嵌合抗体的重链HER2H基因及轻链HER2L基因，IRES是个双向启动子序列，可以同时启动HER2H基因及HER2L基因的翻译。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述靶向治疗性抗体为带有HER2(ErbB2)的靶向治疗性抗体。5.根据权利要求1-4任一所述方法，其特征在于所述将病毒液于新鲜受精胚进行胚盘下腔注射，继续孵化是:(I)、取受精种蛋用I %新洁而灭消毒，放置在蛋托上静置24小时，大头放上；(2)、在大头上用碘酊消毒，75%的酒精脱碘，在最顶端打一小孔，直径约2至3mm大小，剥开鸡蛋内膜，看见浮在蛋清上面的鸡胚；(3)、用注射器向鸡胚注入10-50微升左右的慢病毒载体；(4)、用石腊封口后，放入孵化箱孵化。孵出的小鸡部分带有表达HER2靶向治疗性抗体的转基因鸡。6.根据权利要求1-4任一所述方法，其特征在于所述对公鸡进行病毒睾丸注射是临注射前，病毒浓缩液加入Polybrene至最终浓度3ug/ml混均待用;取4-15周龄公鸡以速眠新II全身麻醉剂，按0.2mL/kg体重肌肉注射公鸡，麻醉后，右侧肋骨处开2-3cm切口，暴露两侧睾丸，分别随机点注射病毒浓缩液，每侧睾丸注射4-5点，注射约0.5mL，缝合创口，注射药物防感染。7.权利要求1所述方法的应用，其特征在于用于在卵清中生产基于铁蛋白纳米结构的HER2人鼠嵌合抗体。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于所述HER2人鼠嵌合抗体是HER2靶向人鼠嵌合单克隆抗体。9.根据权利要求8所述应用，其特征在于所述HER2靶向人鼠嵌合单克隆抗体是由鼠单抗的可变区基因与人IgG的恒定区基因嵌合而成，可以特异性的结合到细胞膜HER2受体蛋白的胞外区的第IV结构域，一方面通过位阻效应，阻碍了HER2二聚体的形成，使HER2不能往下传递信号通路，一方面通过募集体内的免疫细胞与免疫因子系统，将HER2阳性的癌细胞消灭，进而起到扼制HER2阳性恶性肿瘤的疗效。
【文档编号】A61K39/395GK105950665SQ201610357546
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】刘庆友, 李力, 石德顺, 张海航, 李志鹏, 陈忠毅, 温凯婷
【申请人】刘庆友, 李力, 石德顺, 陈忠毅, 张海航, 李志鹏, 温凯婷