一种以银耳子实体制备植物基透明质酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种以银耳子实体制备植物基透明质酸的方法，属于透明质酸制备技术领域。本发明取银耳子实体洗涤后，用去离子水浸泡，碾磨、微波加热得预处理浆料，再取葡萄皮粉碎后，放入马铃薯蔗糖培养基培养，用去离子水淋洗，得混合微生物淋洗液，与预处理浆料、蔗糖混合发酵后，加入纤维素酶、磷酸二氢钾溶液等混合，加热反应过滤得滤液，浓缩得浓缩液，与无水乙醇混合，经冷藏、离心得沉淀物，将其真空冷冻干燥碾磨制得植物基透明质酸。本发明的有益效果是：本发明制备步骤简单，提取率高于其他方法31.2%以上，制备周期短；产品易存放、透光率好，相对分子量提高了25～31%。
【专利说明】
一种以银耳子实体制备植物基透明质酸的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种以银耳子实体制备植物基透明质酸的方法，属于透明质酸制备技术领域。【背景技术】
[0002]透明质酸是一种酸性粘多糖，首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。动物组织提取主要原料是鸡冠和牛眼玻璃体等，用丙酮或乙醇将原料脱脂、脱水，用蒸馏水浸泡、过滤，然后以氯化钠水溶液和氯仿溶液处理，之后加入胰蛋白酶保温后得到混合液，最后用离子交换剂进行处理、纯化得到精制的透明质酸。这种方法提取率极低，仅1% 左右，分离过程复杂，致使透明质酸价格昂贵。微生物发酵提取以葡萄糖作为碳源发酵液， 在培养基中发酵48小时，发酵结束后，过滤除去菌丝体和杂质，然后用醇沉淀法等简单操作即得到高纯度的产物。采用发酵法制造的透明质酸，优点是能按商品设计来设定分子量大小。发酵法的关键在于菌种的选择，多选用链球菌、乳酸球菌类等。虽纯度高，但发酵周期长、产物相对分子量低、产物透光率差、蛋白质含量高、葡萄糖醛酸含量低。化学合成提取采用天然酶聚合反应，首先使用多糖类聚合物合成“透明质酸氧氮杂环戊烯衍生物”，然后添加水分解酶，制造出衍生物和酶的复合体，最后在90度摄氏反应液中清除其中的酶，就合成了透明质酸。采用人工合成法可大大降低透明质酸的制造成本，但结构纯度低。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题:针对以动物组织提取透明质酸，原料存放时间较短， 提取率低，导致透明质酸成本高，而微生物发酵法提取发酵周期长，产物相对分子量低，导致其透光率差的弊端，提供了一种取银耳子实体洗涤后，用去离子水浸泡，碾磨、微波加热得预处理浆料，再取葡萄皮粉碎后，放入马铃薯蔗糖培养基培养，用去离子水淋洗，得混合微生物淋洗液，与预处理浆料、蔗糖混合发酵后，加入纤维素酶、磷酸二氢钾溶液等混合，加热反应过滤得滤液，浓缩得浓缩液，与无水乙醇混合，经冷藏、离心得沉淀物，将其真空冷冻干燥碾磨制得植物基透明质酸的方法。本发明制备步骤简单，提取率高，制备周期短，相对分子量高，有效解决了产品原料不易存放、提取率低，所得产品透光率差问题。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是:(1)称取80?100g银耳子实体，用去离子水洗涤3?5次后，放入盛有500?600mL去离子水的烧杯中，浸泡1?2h后，置于石磨磨盘上研磨，研磨过程中混入120?180mL去离子水，得银耳浆料，再将其转入微波加热器中，以500?600W功率，微波加热15?25min，移出，静置， 使其自然冷却至室温，得预处理浆料；(2)称取10?20g葡萄皮，放入组织粉碎机中粉碎，将粉碎后的葡萄皮置于马铃薯蔗糖培养基中，再移入35?45°0〖旦温培养箱中，培养2?3天，用60?80mL去离子水淋洗培养基表面，得混合微生物淋洗液，随后量取10?20mL所得混合微生物淋洗液，将其转入盛有100? 150mL上述所得预处理楽;料的发酵罐中，再加入6?8g鹿糖，用灭菌木棍搅拌10?15min后， 发酵处理6?8h，得发酵浆料；(3)向反应釜中依次加入20?30mL上述所得发酵浆料，100?200mL质量浓度为8?10% 磷酸二氢钾溶液，2?4g纤维素酶，1?3g果胶酶和1?3g中性蛋白酶，启动搅拌器，设定转速为400?600r/min，加热升温至45?50°C，恒温搅拌反应60?80min，随后以80?85°C加热处理5?lOmin，静置，自然冷却至室温后，过滤除去滤渣，得滤液；(4)将上述所得滤液转入旋转蒸发器中，在70?80°C条件下旋蒸浓缩至原体积的1/3， 再将浓缩液转入盛有200?300mL无水乙醇的烧杯中，用玻璃棒搅拌3?5min，搅拌后再将其转入2?4°C冰箱中冷藏10?15h，离心除去上清液，将所得沉淀物转入-35?-25°C真空冷冻干燥机中，干燥2?4h后，用研钵研磨成粉，即得植物基透明质酸。
[0005]本发明的应用方法:称取20?30g本发明制备的植物基透明质酸放入玻璃器皿中， 同时向其中加入25?28mL柠檬汁、8?10mL蜂蜜和160?200mL纯净水，搅拌使其充分混合均匀后，装瓶即可制得化妆水。该植物基透明质酸可改善皮肤营养代谢，使皮肤光滑湿润，所得化妆水可以紧致肌肤，长久保湿，并可阻隔外来细菌、灰尘、紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害，防止衰老，且在保湿的同时又是良好的透皮吸收向，值得推广与使用。
[0006]本发明与其他方法相比，有益技术效果是:(1)本发明制备步骤简单，提取率高于其他方法31.2%以上，制备周期短；(2 )产品易存放、透光率好，相对分子量提高了 25?31%。【具体实施方式】
[0007] 首先称取80?100g银耳子实体，用去离子水洗涤3?5次后，放入盛有500?600mL 去离子水的烧杯中，浸泡1?2h后，置于石磨磨盘上研磨，研磨过程中混入120?180mL去离子水，得银耳浆料，再将其转入微波加热器中，以500?600W功率，微波加热15?25min，移出，静置，使其自然冷却至室温，得预处理浆料;然后称取10?20g葡萄皮，放入组织粉碎机中粉碎，将粉碎后的葡萄皮置于马铃薯蔗糖培养基中，再移入35?45°C恒温培养箱中，培养 2?3天，用60?80mL去离子水淋洗培养基表面，得混合微生物淋洗液，随后量取10?20mL所得混合微生物淋洗液，将其转入盛有100?150mL上述所得预处理浆料的发酵罐中，再加入6 ?8g蔗糖，用灭菌木棍搅拌10?15min后，发酵处理6?8h，得发酵浆料;再向反应釜中依次加入20?30mL上述所得发酵浆料，100?200mL质量浓度为8?10%磷酸二氢钾溶液，2?4g纤维素酶，1?3g果胶酶和1?3g中性蛋白酶，启动搅拌器，设定转速为400?600r/min，加热升温至45?50°C，恒温搅拌反应60?80min，随后以80?85°C加热处理5?lOmin，静置，自然冷却至室温后，过滤除去滤渣，得滤液;最后将上述所得滤液转入旋转蒸发器中，在70?80°C 条件下旋蒸浓缩至原体积的1/3，再将浓缩液转入盛有200?300mL无水乙醇的烧杯中，用玻璃棒搅拌3?5min，搅拌后再将其转入2?4°C冰箱中冷藏10?15h，离心除去上清液，将所得沉淀物转入-35?-25°C真空冷冻干燥机中，干燥2?4h后，用研钵研磨成粉，即得植物基透明质酸。
[0008]实例 1首先称取80g银耳子实体，用去离子水洗涤3次后，放入盛有500mL去离子水的烧杯中， 浸泡lh后，置于石磨磨盘上研磨，研磨过程中混入120mL去离子水，得银耳浆料，再将其转入微波加热器中，以500W功率，微波加热15min，移出，静置，使其自然冷却至室温，得预处理浆料;然后称取l〇g葡萄皮，放入组织粉碎机中粉碎，将粉碎后的葡萄皮置于马铃薯蔗糖培养基中，再移入35°C恒温培养箱中，培养2天，用60mL去离子水淋洗培养基表面，得混合微生物淋洗液，随后量取10mL所得混合微生物淋洗液，将其转入盛有100mL上述所得预处理浆料的发酵罐中，再加入6g蔗糖，用灭菌木棍搅拌l〇min后，发酵处理6h，得发酵浆料;再向反应釜中依次加入20mL上述所得发酵浆料，100mL质量浓度为8%磷酸二氢钾溶液，2g纤维素酶，lg 果胶酶和lg中性蛋白酶，启动搅拌器，设定转速为400r/min，加热升温至45°C，恒温搅拌反应60min，随后以80°C加热处理5min，静置，自然冷却至室温后，过滤除去滤渣，得滤液;最后将上述所得滤液转入旋转蒸发器中，在70°C条件下旋蒸浓缩至原体积的1/3,再将浓缩液转入盛有200mL无水乙醇的烧杯中，用玻璃棒搅拌3min，搅拌后再将其转入2°C冰箱中冷藏 10h，离心除去上清液，将所得沉淀物转入-35°C真空冷冻干燥机中，干燥2h后，用研钵研磨成粉，即得植物基透明质酸。
[0009]称取20g本发明制备的植物基透明质酸放入玻璃器皿中，同时向其中加入25mL柠檬汁、8mL蜂蜜和160mL纯净水，搅拌使其充分混合均匀后，装瓶即可制得化妆水。该植物基透明质酸可改善皮肤营养代谢，使皮肤光滑湿润，所得化妆水可以紧致肌肤，长久保湿，并可阻隔外来细菌、灰尘、紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害，防止衰老，且在保湿的同时又是良好的透皮吸收向，值得推广与使用。
[0010]实例2首先称取90g银耳子实体，用去离子水洗涤4次后，放入盛有550mL去离子水的烧杯中， 浸泡2h后，置于石磨磨盘上研磨，研磨过程中混入150mL去离子水，得银耳浆料，再将其转入微波加热器中，以550W功率，微波加热20min，移出，静置，使其自然冷却至室温，得预处理浆料;然后称取15g葡萄皮，放入组织粉碎机中粉碎，将粉碎后的葡萄皮置于马铃薯蔗糖培养基中，再移入40°C恒温培养箱中，培养3天，用70mL去离子水淋洗培养基表面，得混合微生物淋洗液，随后量取15mL所得混合微生物淋洗液，将其转入盛有125mL上述所得预处理浆料的发酵罐中，再加入7g蔗糖，用灭菌木棍搅拌13min后，发酵处理7h，得发酵浆料;再向反应釜中依次加入25mL上述所得发酵浆料，150mL质量浓度为9%磷酸二氢钾溶液，3g纤维素酶，2g 果胶酶和2g中性蛋白酶，启动搅拌器，设定转速为500r/min，加热升温至48°C，恒温搅拌反应70min，随后以83°C加热处理8min，静置，自然冷却至室温后，过滤除去滤渣，得滤液;最后将上述所得滤液转入旋转蒸发器中，在75°C条件下旋蒸浓缩至原体积的1/3,再将浓缩液转入盛有250mL无水乙醇的烧杯中，用玻璃棒搅拌4min，搅拌后再将其转入3°C冰箱中冷藏 13h，离心除去上清液，将所得沉淀物转入-30°C真空冷冻干燥机中，干燥3h后，用研钵研磨成粉，即得植物基透明质酸。
[0011]称取25g本发明制备的植物基透明质酸放入玻璃器皿中，同时向其中加入26mL柠檬汁、9mL蜂蜜和180mL纯净水，搅拌使其充分混合均匀后，装瓶即可制得化妆水。该植物基透明质酸可改善皮肤营养代谢，使皮肤光滑湿润，所得化妆水可以紧致肌肤，长久保湿，并可阻隔外来细菌、灰尘、紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害，防止衰老，且在保湿的同时又是良好的透皮吸收向，值得推广与使用。
[0012]实例3首先称取l〇〇g银耳子实体，用去离子水洗涤5次后，放入盛有600mL去离子水的烧杯中， 浸泡2h后，置于石磨磨盘上研磨，研磨过程中混入180mL去离子水，得银耳浆料，再将其转入微波加热器中，以600W功率，微波加热25min，移出，静置，使其自然冷却至室温，得预处理浆料;然后称取20g葡萄皮，放入组织粉碎机中粉碎，将粉碎后的葡萄皮置于马铃薯蔗糖培养基中，再移入45°C恒温培养箱中，培养3天，用80mL去离子水淋洗培养基表面，得混合微生物淋洗液，随后量取20mL所得混合微生物淋洗液，将其转入盛有150mL上述所得预处理浆料的发酵罐中，再加入8g蔗糖，用灭菌木棍搅拌15min后，发酵处理8h，得发酵浆料;再向反应釜中依次加入30mL上述所得发酵浆料，200mL质量浓度为10%磷酸二氢钾溶液，4g纤维素酶，3g 果胶酶和3g中性蛋白酶，启动搅拌器，设定转速为600r/min，加热升温至50°C，恒温搅拌反应80min，随后以85°C加热处理lOmin，静置，自然冷却至室温后，过滤除去滤渣，得滤液;最后将上述所得滤液转入旋转蒸发器中，在80°C条件下旋蒸浓缩至原体积的1/3,再将浓缩液转入盛有300mL无水乙醇的烧杯中，用玻璃棒搅拌5min，搅拌后再将其转入4 °C冰箱中冷藏 15h，离心除去上清液，将所得沉淀物转入-25°C真空冷冻干燥机中，干燥4h后，用研钵研磨成粉，即得植物基透明质酸。[〇〇13]称取30g本发明制备的植物基透明质酸放入玻璃器皿中，同时向其中加入28mL柠檬汁、10mL蜂蜜和200mL纯净水，搅拌使其充分混合均匀后，装瓶即可制得化妆水。该植物基透明质酸可改善皮肤营养代谢，使皮肤光滑湿润，所得化妆水可以紧致肌肤，长久保湿，并可阻隔外来细菌、灰尘、紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害，防止衰老，且在保湿的同时又是良好的透皮吸收向，值得推广与使用。
【主权项】
1.一种以银耳子实体制备植物基透明质酸的方法，其特征在于具体制备步骤为:(1)称取80?100g银耳子实体，用去离子水洗涤3?5次后，放入盛有500?600mL去离子 水的烧杯中，浸泡1?2h后，置于石磨磨盘上研磨，研磨过程中混入120?180mL去离子水，得 银耳浆料，再将其转入微波加热器中，以500?600W功率，微波加热15?25min，移出，静置， 使其自然冷却至室温，得预处理浆料；(2)称取10?20g葡萄皮，放入组织粉碎机中粉碎，将粉碎后的葡萄皮置于马铃薯蔗糖 培养基中，再移入35?45°0〖旦温培养箱中，培养2?3天，用60?80mL去离子水淋洗培养基表 面，得混合微生物淋洗液，随后量取10?20mL所得混合微生物淋洗液，将其转入盛有100? 150mL上述所得预处理楽;料的发酵罐中，再加入6?8g鹿糖，用灭菌木棍搅拌10?15min后， 发酵处理6?8h，得发酵浆料；(3)向反应釜中依次加入20?30mL上述所得发酵浆料，100?200mL质量浓度为8?10% 磷酸二氢钾溶液，2?4g纤维素酶，1?3g果胶酶和1?3g中性蛋白酶，启动搅拌器，设定转速 为400?600r/min，加热升温至45?50°C，恒温搅拌反应60?80min，随后以80?85°C加热处 理5?lOmin，静置，自然冷却至室温后，过滤除去滤渣，得滤液；(4)将上述所得滤液转入旋转蒸发器中，在70?80°C条件下旋蒸浓缩至原体积的1/3， 再将浓缩液转入盛有200?300mL无水乙醇的烧杯中，用玻璃棒搅拌3?5min，搅拌后再将其 转入2?4°C冰箱中冷藏10?15h，离心除去上清液，将所得沉淀物转入-35?-25°C真空冷冻 干燥机中，干燥2?4h后，用研钵研磨成粉，即得植物基透明质酸。
【文档编号】C12P19/26GK105950688SQ201610469302
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月25日
【发明人】仇颖超, 盛海丰, 许博伟
【申请人】仇颖超