一种香蕉枯萎病病原菌致病性鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种香蕉枯萎病病原菌致病性鉴定方法，该方法包括以下步骤：（1）致病菌的培养及孢子悬浮液的制备；（2）用具的消毒及灭菌；（3）香蕉假茎切段；（4）接种；（5）培养；（6）致病性观察。本发明方法能对病原菌致病性实现简易、快速、直观的快速鉴定，可大幅度地提高工作效率，为植物病害的防治做出重要作用。此外还具有以下优点：香蕉维管束变褐症状明显，直观性强，易判断；保湿性好，发病快，1周左右可知结果；接种量均匀，发病一致性强；简单易操作，无需额外增添贵重仪器或材料；数据稳定好，重复性强；同期可进行大批量病原菌致病性的鉴定；对类似的维管束性病原菌的致病性鉴定也有重要的参考作用。
【专利说明】
一种香蕉枯萎病病原菌致病性鉴定方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种植物病原菌致病性的方法，具体是涉及香蕉枯萎病病原菌致病性鉴定方法，属于植物病理学技术领域。
【背景技术】
[0002]香蕉是世界贸易量及消费量最大宗的鲜果，许多国家和地区将香蕉作为主要出口商品和国家经济的基本收入来源。然而香蕉产业迅猛发展的同时，也遭遇着有史以来香蕉枯萎病最严重的威胁和挑战。
[0003]香蕉枯萎病，又称黄叶病，香蕉巴拿马病，“蕉癌”，是典型维管束性病害，该病害由是由尖孢镰刀菌古巴专化型(/7Usariuffi oxysporium f.sp.cubense Race 4)侵染引起的一种毁灭性病害。为了有效地防控该病害，对该病原菌的研究及对香蕉不同品种的抗病性评价成为这项工作的重要内容，而要完成这项工作，致病性鉴定是必须通过的路径。
[0004]据报道，有研究以香蕉巴西蕉和粉蕉叶片为材料，采用香蕉离体叶片接种香蕉枯萎病菌，鉴定病斑大小来建立了一种简便快速的香蕉枯萎病突变体致病性鉴定方法(符冬妹等，2015)。该方法得到了同行的认可。但是，众所周知，香蕉叶片的主要结构为叶肉组织而非维管组织，这两种组织受到病原菌的破坏所表现的症状是不同的，特别是对于典型维管束为害的香蕉枯萎病菌来说，其代表性是不充分的。有报道在三角瓶中以改良培养基培养生长的香蕉苗，并将病原菌接种于根外，然后观察香蕉苗的发病情况24天(Wu et al,2010)。我们采用该方法进行致病性鉴定，结果发现香蕉苗还没有表现症状，病原菌就长满了三角瓶，菌丝布满整个瓶壁直至瓶口，严重影响了病害观察。盆栽法是比较传统的方法，从接种到症状表现大约需要40天，耗时过长，且工作量较大(胡适连等，1988 ;Matsumoto etal, 1995；Subramaniam et al，2006)o
[0005]目前较为常用的鉴定方法是水培系统的鉴定法(DeAscensao and Dubery，2000;Groenewald et al,2006 ; Van den Berg et a_/，2007)，但是一般需要超过40天才能有结果，该方法耗时较长，工作效率较低。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种香蕉枯萎病病原菌致病性鉴定方法，该方法能对枯萎病病原菌致病性实现简易、快速、直观的快速鉴定，可大幅度地提高工作效率，为植物病害的防治做出重要作用。
[0007]本发明的技术方案如下:一种香蕉枯萎病病原菌致病性鉴定方法，包括如下步骤:
(1)致病菌的培养及孢子悬浮液的制备:将待测病菌接种在PDA培养基上，28°C恒温箱中培养6天;刮取培养物，用无菌水配制成浓度I X 105CFU/mL孢子悬浮液，备用；
(2)用具的消毒及灭菌:取厚度2mm的PU海绵，剪成A4纸规格的长方形，灭菌，获得无菌海绵;准备规格为16 X 40cm的带盖塑料箱，表面消毒，备用；
(3)香蕉假茎切段:将新鲜香蕉假茎表面消毒，然后用无菌刀切成长度5cm的香蕉假茎段；
(4)接种:将无菌海绵浸入步骤(I)制备的孢子悬浮液中，使得海绵充分吸收孢子悬浮液，然后取出海绵，将海绵平铺在步骤(2)经消毒的塑料箱底部，然后将步骤(3)的香蕉假茎段底部切面朝下至于塑料箱中的海绵上;再取另一张吸收了孢子悬浮液的无菌海绵覆盖在香蕉假茎段的顶部；
(5 )培养:合上塑料箱盖，将塑料箱放置在28-30 °C的室内环境中培养6天；
(6 )致病性观察:培养结束后，打开塑料箱盖，移开覆盖在香蕉假茎段顶部的海绵，观察香蕉假茎的维管束变褐，则说明该待测病原菌具有致病性;对比香蕉假茎的维管束变褐程度来判断该待测病原菌致病性的强弱。
[0008]本发明所述的待测病菌可以是香蕉枯萎病病原菌，也可以是棉花枯萎病病菌、黄瓜枯萎病病原菌等引致维管束病害的病原菌。本发明的方法也可应用于棉花枯萎病病菌或黄瓜枯萎病病原菌等引致维管束病害的病原菌的致病性鉴定。
[0009]本发明方法可以实现对香蕉枯萎病病原菌致病性的快速鉴定，该方法步骤简单、结果直观，具有以下优点:
(1)培养结果直接反映的是病原菌对香蕉维管束的致病性，无需推断，结果直观；
(2)香蕉维管束变褐症状明显，直观性强，易判断；
(3)保湿性好，发病快，一般只需I周时间便有结果；
(4)接种量均勾，发病一致性强；
(5)整个过程简单易操作，无需额外增添贵重仪器或材料；
(6)数据稳定好，重复性强；
(7)同期可进行大批量病原菌致病性的鉴定；
(8)对类似的维管束性病原菌的致病性鉴定也有重要的参考作用。
【附图说明】
[0010]图1为实施例1所使用PU海棉；图2为实施例1所使用塑料箱；图3为切成5cm等段的香蕉假茎;图4为切好的香蕉假茎段平铺于放置在塑料箱中、预先吸收了孢子悬浮液的海绵上方状态图；图5为接种后，香蕉假茎上再覆盖另一张预先浸泡于孢子悬浮液的状态图；图6为将塑料箱盖合上，进行培养;图7为培养7天后的结果；图8为对照试验结果与致病性鉴定试验结果对比，其中A1-A3为对照试验鉴定结果，维管束无褐变，B1- B3为致病症状，维管束褐变腐烂；图9为致病性鉴定结果，其中A为香蕉假茎的外观，B为香蕉假茎纵切面;图10为致病性鉴定结果中不同维管束褐变的程度。
【具体实施方式】
[0011]下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0012]实施例1采用以下步骤实现本发明:
1、致病性鉴定试验:
(I)致病菌的培养及孢子悬浮液的制备:将香蕉枯萎病病原菌接种在I3DA培养基上，28°C恒温箱中培养6天;刮取培养物，用无菌水配制成浓度I X 105CFU/mL孢子悬浮液，备用； (2)用具的消毒及灭菌:取厚度2mm的PU海绵，剪成A4纸规格的长方形，如图1所示，将海绵灭菌，获得无菌海绵;准备规格为16X40cm的带盖塑料箱，表面消毒，备用，如图2所示；
(3)香蕉假茎切段:将新鲜香蕉假茎表面消毒，然后用无菌刀切成长度5cm的香蕉假茎段，如图3所示；
(4)接种:将无菌海绵浸入步骤(I)制备的孢子悬浮液中，使得海绵充分吸收孢子悬浮液，然后取出海绵，将海绵平铺在步骤(2)经消毒的塑料箱底部，然后将步骤(3)的香蕉假茎段底部切面朝下至于塑料箱中的海绵上，如图4所示;再取另一张吸收了孢子悬浮液的无菌海绵覆盖在香蕉假茎段的顶部，如图5所示；
(5)培养:合上塑料箱盖，，如图6所示，将塑料箱放置在30°C的室内环境中培养6天，培养结果如图7所不；
2、对照试验:按照步骤I中的步骤(I)-(5)的方法，以无菌水作为对照，将无菌海绵浸入等量无菌水中，进行对照试验；
3、致病性观察:培养结束后，打开塑料箱盖，移开覆盖在香蕉假茎段顶部的海绵，观察香蕉假茎的维管束变褐，则说明该待测病原菌具有致病性;对比香蕉假茎的维管束变褐程度来判断该待测病原菌致病性的强弱。
[0013]本实施例的致病性鉴定结果如图8-10所示。图8中A1-A3为对照试验鉴定结果，维管束无褐变，B1- B3为致病症状，维管束褐变腐烂；图9为致病性鉴定结果，其中A为香蕉假茎的外观，B为香蕉假茎纵切面；图10为不同维管束褐变的程度，通过观察褐变程度显示目标菌的致病程度。
[0014]经多次试验验证表明，本发明方法数据稳定好，重现性佳。
【主权项】
1.一种香蕉枯萎病病原菌致病性的鉴定方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)致病菌的培养及孢子悬浮液的制备:将待测病菌接种在PDA培养基上，28°C恒温箱中培养6天;刮取培养物，用无菌水配制成浓度I X 15CFlVmL孢子悬浮液，备用； (2)用具的消毒及灭菌:取厚度2mm的PU海绵，剪成A4纸规格的长方形，灭菌，获得无菌海绵;准备规格为16 X 40cm的带盖塑料箱，表面消毒，备用； (3)香蕉假茎切段:将新鲜香蕉假茎表面消毒，然后用无菌刀切成长度5cm的香蕉假茎段； (4)接种:将无菌海绵浸入步骤(I)制备的孢子悬浮液中，使得海绵充分吸收孢子悬浮液，然后取出海绵，将海绵平铺在步骤(2)经消毒的塑料箱底部，然后将步骤(3)的香蕉假茎段底部切面朝下至于塑料箱中的海绵上;再取另一张吸收了孢子悬浮液的无菌海绵覆盖在香蕉假茎段的顶部； (5)培养:合上塑料箱盖，将塑料箱放置在28-30°C的室内环境中培养6天； (6)致病性观察与测量:培养结束后，打开塑料箱盖，移开覆盖在香蕉假茎段顶部的海绵，观察到香蕉假茎的维管束变褐，则说明该待测病原菌具有致病性;对比香蕉假茎的维管束变褐程度来判断该待测病原菌致病性的强弱； 所述待测病原菌为香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporiumf.sp.cubense Race 4)。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于:所述待测病原菌为尖孢镰刀菌古巴专Vc型XFusarium oxysporium f.sp.cubense Race 4)时，所述步骤用于尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporium f.sp.cubense Race 4)病原菌致病性鉴定。
【文档编号】C12Q1/02GK105950699SQ201610522934
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】刘月廉, 吕庆芳, 林巧玲, 张德涛
【申请人】广东海洋大学