一种用于评估皮肤防御情况的引物和探针及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于评估皮肤防御情况的引物和探针及试剂盒。所述引物和探针的序列如SEQ ID NO:1?4，和SEQ ID NO:5?8；其中SEQ ID NO:3?4,7?8的5’端和3’端分别连接不同荧光标记。还公开了利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法。充分了解皮肤自我防御能力，为其提供个性化美容健康解决方案，使防御美容产品效果最大化。
【专利说明】
一种用于评估皮肤防御情况的引物和探针及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及美容领域，尤其涉及一种用于评估皮肤防御情况的引物和探针及试剂 盒。
【背景技术】
[0002] SNP(单核苷酸多态性)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失 和插入，是一种最常见的遗传标记，在人群中的携带频率大于1%，广泛应用于人类疾病诊 断、药物个体化使用、生物学基础研究等领域。随着对不同SNP位点研究的深入，通过多个 SNP位点的组合检测以及后续的数据分析，可以针对不同人群的基因信息制定个性化健康 解决方案。
[0003] 人体的皮肤外观受到内因和外因的影响，外因包括紫外线、环境污染、不当美容产 品使用等，内因则体现在与皮肤相关的生化变化，包括蛋白活性、荷尔蒙水平等，这些变化 大多是由遗传基因决定的。现阶段的皮肤保养方法多是根据外因采取的，如使用防晒霜、保 湿剂等，然而这些无针对性的保养方法大多效果甚微，治标不治本。随着生活水平的提高， 对于提高皮肤光滑和紧固度的需求越来越大，结合内外因进行针对性美容护肤将比传统方 法更具优势，因此准确了解内因显得至关重要。
[0004] 皮肤自我保护能力强弱受到多个基因影响，每个基因又存在多个SNP位点，这些位 点会影响相关基因的蛋白活性。通过相关基因的SNP位点检测可以评测不同个体的皮肤防 御能力，还可以评估相关美容产品是否适用于检测者，使产品效果达到最大化，在此基础上 结合日常生活习惯调整，使皮肤防御效果进一步提升。对于这种检测方法，选取准确的位点 组合以及后续数据分析尤为重要。国内外已有专利报道利用SNP位点基因型判断美容产品 适用皮肤类型，但仍存在着易感SNP位点选取不准确、检测结果未能量化综合分析问题。当 前未见结合基因 SNP位点组合检测和量化算法评估皮肤防御能力的报道。
[0005] 中国实用新型专利201320009798.7公开了一种基因芯片，利用该基因芯片检测美 白和老化相关基因 SNP位点，美白基因的SNP位点包括SLC45A2(re35391 )、KITLG (rs642742)、ASIP(rsl015362)、TYR(rsl042602)、0CA2(rsl800414)、DCT(rs2031526)、MClR (rs885479)，老化基因的SNP包括MMPl(rsl799750)、TIMPl(rs4898)、SIRT6(rsl07251)、 S0D2(rs4880)、NQ01(rsl800566)、TNFA(rsl800629)、EPHX(rsl051740)，但该专利采用的基 因芯片方法较繁琐，难以适用大量检测。中国发明专利申请201180056031.3筛选到了一组 与皮肤老化相关的基因（LPL、ADIP0Q、PLN等），并根据该组基因筛选到一种抗老化新材料， 该专利申请中未提及基因相关SNP位点。中国专利申请201080044917.1提供了一种利用天 然反义多核苷酸或化合物调控FLG基因表达，从而达到预防或治疗与FLG相关的疾病。
[0006] 美国专利US200812286033通过单萜类物质诱导相关基因表达以达到改善皱纹的 效果。美国专利US200912512368通过含有异戊烯异黄酮的化妆品诱导ELN和C0L3A1基因的 表达，达到了改善皮肤外观的效果。美国专利US201514618080和US201313932565通过在皮 肤防御位置使用朝鲜蓟提取物和橄榄油提取物，使包括ELN和C0L3A1在内的相关基因受到 调控上调表达，从而达到改善防御皮肤的功效。
[0007] 以上专利/专利申请均利用外来物质调控体内基因的表达，但每个个体的基因中 却存在差异SNP位点，这种方法难以达到个性化保养或治疗。英国专利GB20110021917检测 了与美容产品成分生物学途径相关的靶基因 SNP位点，进而判断该产品是否适用于使用者， 该专利涉及的 SNP 位点有 MMP-l(rsl799750)、NQ01(rsl800566)、GSTPl(rsl695)、hGPXl (rsl0504)〇
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种用于评估皮肤防御情况的引物和探针。
[0009] 为实现上述目的，本发明提供一种用于评估皮肤防御情况的引物和探针，其特征 在于，所述序列如SEQIDN0:l-4，和SEQIDN0:5-8 ;其中SEQIDN0:3-4,7-8的5'端和3' 端分别连接不同荧光标记。
[0010] 本发明提供一种用于评估皮肤防御情况的试剂盒，其特征在于，含有所述的引物 和探针。
[0011] 本发明提供一种利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于， 使用所述的引物和探针，或使用所述的试剂盒。
[0012] 进一步，步骤为：
[0013] 1)使用所述的引物和探针或所述的试剂盒对客户进行SNP位点检测；
[0014] 2)根据易感SNP位点组合计算出客户的皮肤防御能力值;所述易感SNP位点组合为 PPARG rs1801282^PPARG rs3856806；
[0015] 3)结合1)的SNP位点检测结果及2)的皮肤防御能力值，进行结果判断。
[0016]进一步，所述步骤1)为，
[0017] 提取客户的DNA样本；
[0018] 采用所述引物和探针或所述试剂盒进行PCR扩增;优选的，PCR扩增的反应程序为 50Γ2π?η，95Γ?0π?η，95Γ?58、60-(：1π?η 循环 40 次。
[0019]进一步，所述步骤2)为，
[0020]根据已知易感SNP位点组合的各个位点基因型的致病风险比值比计算出综合风险 比值比〇R(C)，计算方程式为：
[0021]通过已知中国人群不同年龄段皮肤致病平均风险比值odds(D)，计算出检测个体 的皮肤致病风险值比值〇dds(X)，计算式为odds(X) =0R(C) Xodds(D);
[0023]根据已知正常基因型人群风险值F(N)，计算出个体皮肤防御能力值。
[0025] 进一步，所述步骤3)的结果判断为，
[0026] 1)若个体皮肤防御能力值低于100%，则表示该个体的皮肤防御能力低于该年龄 段人群的正常值，防御能力差，属于不易防御的体质;值越低，防御能力越差；
[0027] 2)若个体皮肤防御能力值等于100%，则表示该个体的皮肤防御能力与该年龄段 人群的正常值一样，防御能力一般；
[0028] 3)若个体皮肤防御能力值高于100%，则表示该个体的皮肤防御能力高于该年龄 段人群的正常值，防御能力较好，属于易防御的体质;值越高，防御能力越好；
[0029]同时；
[0030] 若基因 PPARG的SNP位点rsl801282为C/G，表明携带杂合突变，皮肤油水不平衡，导 致皮肤缺水严重，进而刺激皮脂腺分泌更多的油脂，容易造成毛孔粗大，肤色暗沉以及长痘 痘;若为G/G，表明携带纯合突变，皮肤油水不平衡，导致皮肤缺水严重，进而刺激皮脂腺分 泌更多的油脂，容易造成毛孔粗大，肤色暗沉以及长痘痘;若为C/C，则为正常基因型；
[0031] 若基因 PPARG的SNP位点rs3856806为C/T，表明携带杂合突变，皮肤防御能力下降， 患黑素瘤的风险更高;若为T/T，表明携带纯合突变，皮肤防御能力下降，患黑素瘤的风险更 高;若为C/C，则为正常基因型。
[0032] 本发明（1)筛选出一组可经过多篇文献验证，且分子机制清晰，可用于全面准确评 估皮肤防御能力的SNP位点组合；（2)采用特异性强、灵敏度高的TaqMan-MGB探针检测方法 进行检测，可同时检测多个样本；（3)通过算法精确量化皮肤致病风险以评估皮肤防御能 力，为检测者提供个性化的皮肤保护方案。
[0033]本发明采用的技术方案为:结合分子机制研究、文献检索和临床数据筛选，得到一 组皮肤自我保护相关的易感SNP位点组合，所述组合位点为PPARG(rsl801282、rs3856806)， 所述组合的位点信息见表1，该组合位点可以准确评估不同个体的皮肤防御能力。
[0034] 表1易感SNP位点信息表
[0036]为了检测所述位点，
【申请人】设计了检测所需的引物和探针，所述引物及荧光探针 如下（下划线为SNP位点）：
[0037] PPARG(rsl801282)引物及荧光探针序列：
[0038] 正向引物TGTGAATTACAGCAAACCCCT SEQ ID N0:1；
[0039] 反向引物TCCCTCAGAATAGTGCAACTGG SEQ ID NO:2;
[0040] 荧光探针FAM-CTCCTATTGACpCAGAAAGC-MGB SEQ ID NO:3;
[0041] 荧光探针VIC-CTCCTATTGACgCAGAAAGC-MGB SEQ ID NO:4;
[0042] PPARG(rs3856806)引物及荧光探针序列：
[0043] 正向引物GTTGTGTTTTCCATATGTGCTT SEQ ID NO:5;
[0044] 反向引物GTCTCCGTCTTCTTGATCACC SEQ ID NO:6;
[0045] 荧光探针FAM-TCACGGAACApGTGCAGCTA-MGB SEQ ID NO:7;
[0046] 荧光探针VIC-TCACGGAACAIGTGCAGCTA-MGB SEQ ID NO:8;
[0047] 所述位点检测方法具体步骤如下：
[0048] 1、人体唾液样本采集。采用无创唾液自动流出采集方式，在唾液采集前30min需用 饮用水清理口腔中杂物，采集2mL唾液存放于唾液保存液以供检测。
[0049] 2、人体全基因组DNA提取。采用碘化钾法，参考具体步骤为：取0 . lmL唾液于1.5mL 离心管中，加入500yL 0.01mol/L PBS溶液反复吹打，lOOOOrpm离心5min;去上清，沉淀加入 50yL 5mol/LKI溶液，震荡混匀，再加入 100yL 0.9%NaCl溶液、150yL酚/氯仿（25:24，V/V) 混合液，震荡30s，lOOOOrpm离心5min;取200yL上清，加入200yL异丙醇，混勾，lOOOOrpm离心 5min;去上清，沉淀加入lmL无水乙醇洗涤，lOOOOrpm离心5min;弃无水乙醇，沉淀在超净台 中吹干，加50yL TE缓冲液溶解，-20°C保存备用。
[0050] 3、PCR反应体系及反应程序。10yL反应体系含Ta_an?Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，美国应用生物技术有限公司）5yL、DNA模板lyL、荧光探针(每个SNP 位点的检测对应探针混合在一起）（2.5μΜ)和引物混合液(每个SNP位点的检测对应引物混 合在一起）1.5yL、ddH 20 2.5yL。反应程序为501€2111丨11，95°(：10111丨11，95°(：158、60°(：1111丨11循环 40次。检测仪器为StepOnePlus实时焚光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国应用生物技 术有限公司）。
[0051 ] 4、实验结果分析。米用StepOnePlus?Software v2.3(Applied Biosystems，美国 应用生物技术有限公司)进行分析，根据不同的荧光信号，得出对应SNP位点的基因型。 [0052]皮肤防御能力量化方法如下：
[0053] 1、致病风险比值比计算。已知检测所得的各个位点基因型的致病风险值比值比为 分别为〇Ri、〇Rr"〇Rm(文献查询得知，结果见表3)，可以计算出个体致病风险比值比0R(C)， 计算方程式如下：
[0055] 2、通过步骤1计算出的个体致病风险比值比0R(C)，通过文献或其它统计途径可以 获得中国人群不同年龄段致病风险比值odds(D)(已知中国人群不同年龄段皮肤致病平均 风险比值〇dds(D)分别为：20-35岁：0.12，36-45岁：0.25，46-55岁：0.40)，通过比值比计算 公式可以计算出检测个体的致病风险比值odds(X)，计算方程式如下：
[0057] 3、通过步骤2计算出的致病风险比值odds(X)，即可以通过风险值推算公式可以计 算出致病风险值F(X)，计算方程式如下：
[0059] 4、通过步骤3计算得到的综合风险值可以评估不同个体的皮肤防御能力，已知正 常基因型人群风险值F(N)(已知正常基因型人群风险值F(N)分别为:20-35岁：10.71%，36_ 45岁：20%，46-55岁：28.57%)，可以计算出个体皮肤防御能力值V，计算方程式如下：
[0061 ]检测结果个性化分析及解决方案：
[0062]根据皮肤防御能力量化计算结果，结合相关位点的功能及分子机制，判断皮肤遭 受损害的可能性，评估检测者可以使用含有何种成分的美容产品，并为其调整有利于护肤 的日常生活饮食习惯。相关基因的分子机制如下:如果PPARG携带突变，则皮肤代谢异常，容 易生成痔疮，皮肤易褶皱。
[0063] 有益效果：
[0064] 可以充分了解皮肤自我防御能力，为用户提供个性化美容健康解决方案，使相关 美容产品使用效果最大化。此外，还可以为检测者调整有利于护肤的日常生活饮食习惯。
【具体实施方式】
[0065] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在旨在用于解释本发明，而不 能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描 述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以 通过市购获得的常规产品。
[0066]实施例1:引物和探针设计
[0067] 1、设计并合成以下引物和探针，合成单位:Applied Biosystems，美国应用生物技 术有限公司。
[0068] PPARG(rsl801282)引物及荧光探针序列：
[0069] 正向引物TGTGAATTACAGCAAACCCCT SEQ ID N0:1；
[0070] 反向引物TCCCTCAGAATAGTGCAACTGG SEQ ID NO:2;
[0071] 荧光探针FAM-CTCCTATTGACgCAGAAAGC-MGB SEQ ID NO:3;
[0072] 荧光探针VIC-CTCCTATTGACgCAGAAAGC-MGB SEQ ID NO:4;
[0073] PPARG(rs3856806)引物及荧光探针序列：
[0074] 正向引物GTTGTGTTTTCCATATGTGCTT SEQ ID NO:5;
[0075] 反向引物GTCTCCGTCTTCTTGATCACC SEQ ID NO:6;
[0076] 荧光探针FAM-TCACGGAACAgGTGCAGCTA-MGB SEQ ID NO:7;
[0077] 荧光探针VIC-TCACGGAACAIGTGCAGCTA-MGB SEQ ID NO:8;
[0078] 2、SNP位点检测
[0079] 1)、人体唾液样本采集。采用无创唾液自动流出采集方式，在唾液采集前30min需 用饮用水清理口腔中杂物，采集2mL唾液存放于唾液保存液以供检测。
[0080] 2)、人体全基因组DNA提取。采用碘化钾法，参考具体步骤为:取0. lmL唾液于1.5mL 离心管中，加入500yL 0.01mol/L PBS溶液反复吹打，lOOOOrpm离心5min;去上清，沉淀加入 50yL 5mol/LKI溶液，震荡混匀，再加入 100yL 0.9%NaCl溶液、150yL酚/氯仿（25:24，V/V) 混合液，震荡30s，lOOOOrpm离心5min;取200yL上清，加入200yL异丙醇，混勾，lOOOOrpm离心 5min;去上清，沉淀加入lmL无水乙醇洗涤，lOOOOrpm离心5min;弃无水乙醇，沉淀在超净台 中吹干，加50yL TE缓冲液溶解，-20°C保存备用。
[0081 ] 3)、PCR反应体系及反应程序。10yL反应体系含TaqMan?Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，美国应用生物技术有限公司）5yL、DNA模板lyL、荧光探针(每个 SNP位点的检测对应探针混合在一起）（2.5μΜ)和引物混合液(每个SNP位点的检测对应引物 混合在一起）1.5yL、ddH 20 2.5yL。反应程序为50°C2min，95°C10min，95°C15s、60°Clmin循 环40次。检测仪器为StepOnePlus实时焚光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国应用生物 技术有限公司）。
[0082] 4)、检测程序运行结束后，米用Step0nePlus?Softwarev2 · 3(AppliedBiosystems， 美国应用生物技术有限公司)对检测结果进行分析，得出对应SNP的基因型(见表2)。
[0083] 表2SNP位点检测结果表
[0085] 3、防御能力量化评估及个性化解决方案
[0086] 1)、皮肤病综合风险值计算。通过文献查询得知，不同位点的比值比如表3所示。
[0087] 表3相关位点基因型的风险比值比(0R)表
[0089] ( 1 )个体综合风险比值比计算。不同位点的〇 R值如表3所示，则
[0090] (2)通过步骤（1)计算个体综合风险比值比0R(C)，综合文献和调查数据得知中国 人群20-35年龄段皮肤致病风险的比值odds (D)约为0.12 (本实施例的检测样本属于该年龄 段，故选择该年龄段的数据），通过比值比计算公式可以计算出检测个体的皮肤致病风险比 值odds(X)=0R(C) Xodds(D) = lX0.12 = 0.12。
[0091] (3)通过步骤(2)计算出的检测个体皮肤致病风险比值odds(X)，综合致病风险值
[0092] (4)已知正常基因型人群风险值F(N)为10.71%，可以计算出皮肤防御能力值
[0093] 2)、检测结果综合分析。该个体皮肤防御能力值为100%，皮肤遗传防御能力正常。 同时结合相关基因的分子机制，由表2可知该检测个体中的PPARG基因型正常，未携带突变， 皮肤防御能力正常。
[0094] 3)、个性化解决方案:该个体防御能力正常，PPARG参与合成的覆盖在皮肤表面的 水脂膜是皮肤屏障结构的最外层防线，其中的脂质可以润滑皮肤，减少皮肤表面的水分蒸 发。应选择温和、不含皂基的清洁产品，避免过度清洁对皮肤水脂膜的进一步破坏;尽量避 免选择添加较多乳化剂的卸妆油类的产品。日常生活中多食用含钙量多的食物（牛奶、大 豆），能提升皮肤屏障功能，抵御病原体入侵。
[0095] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨 的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种用于评估皮肤防御情况的引物和探针，其特征在于，所述序列如SEQ ID N0:1-4,和SEQ ID NO:5-8;其中SEQ ID NO:3-4,7-8的5'端和3'端分别连接不同荧光标记。2. -种用于评估皮肤防御情况的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物和探 针。3. -种利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，使用权利要求1 的引物和探针，或使用权利要求2的试剂盒。4. 权利要求3所述利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，步骤 为： 1) 使用权利要求1的引物和探针或权利要求2的试剂盒对客户进行SNP位点检测； 2) 根据易感SNP位点组合计算出客户的皮肤防御能力值；所述易感SNP位点组合为 PPARG rs1801282^PPARG rs3856806； 3) 结合1)的SNP位点检测结果及2)的皮肤防御能力值，进行结果判断。5. 权利要求4所述利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，所述 步骤1)为， 提取客户体的DNA样本； 采用权利要求1所述引物和探针或权利要求2所述试剂盒进行PCR扩增;优选的，PCR扩 增的反应程序为 50°C2min，95°C10min，95°C15s、60°Clmin 循环 40 次。6. 权利要求4所述利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，所述 步骤2)为， 根据已知易感SNP位点组合的各个位点基因型的致病风险比值比计算出综合风险比值 比〇R(C)，计算方程式为：通过已知中国人群不同年龄段皮肤致病平均风险比值odds(D)，计算出检测个体的皮 肤致病风险值比值〇dds(X)，计算式为odds(X) =0R(C) Xodds(D); 计算出综合风险值：根据已知正常基因型人群风险值F(N)，计算出个体皮肤防御能力值：7. 权利要求4所述利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，所述 步骤3)的结果判断为， 1) 若个体皮肤防御能力值低于100%，则表示该个体的皮肤防御能力低于该年龄段人 群的正常值，防御能力差，属于不易防御的体质;值越低，防御能力越差； 2) 若个体皮肤防御能力值等于100%，则表示该个体的皮肤防御能力与该年龄段人群 的正常值一样，防御能力一般； 3) 若个体皮肤防御能力值高于100%，则表示该个体的皮肤防御能力高于该年龄段人 群的正常值，防御能力较好，属于易防御的体质;值越高，防御能力越好； 同时； 若基因 PPARG的SNP位点rsl801282为C/G，表明携带杂合突变，皮肤油水不平衡，导致皮 肤缺水严重，进而刺激皮脂腺分泌更多的油脂，容易造成毛孔粗大，肤色暗沉以及长痘痘； 若为G/G，表明携带纯合突变，皮肤油水不平衡，导致皮肤缺水严重，进而刺激皮脂腺分泌更 多的油脂，容易造成毛孔粗大，肤色暗沉以及长痘痘;若为C/C，则为正常基因型； 若基因 PPARG的SNP位点rs3856806为C/T，表明携带杂合突变，皮肤防御能力下降，患黑 素瘤的风险更高;若为T/T，表明携带纯合突变，皮肤防御能力下降，患黑素瘤的风险更高； 若为C/C，则为正常基因型。
【文档编号】C12N15/11GK105950737SQ201610365330
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】纪志梁, 王毛阳, 杨志云, 刘晓瑜
【申请人】福建爱我健康生物科技有限公司