以pex13作为诊断胆管癌的基因标志物的制作方法

以pex13作为诊断胆管癌的基因标志物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于胆管癌早期诊断的分子标志物?PEX13基因及其表达产物。本发明利用QPCR和Western blot方法证明PEX13基因在胆管癌组织和正常胆管组织中存在差异表达，可以作为早期诊断胆管癌的指标。另外，本发明还公开了PEX13基因及其表达产物可以作为胆管癌治疗的靶标，用于指导新药的研发。
【专利说明】
以PEX13作为诊断胆管癌的基因标志物
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人PEX13基因在胆管癌诊断、治疗中的用 途。
【背景技术】
[0002] 基因表达谱（expression profile)指的是生物体在某一状态下相对于一个参照 物的基因表达的整体状况，即生物整体性基因表达差异，具有一定的特征性和代表性。其主 要目的是通过这种表型数据来揭示基因在某一特定生物学状态下的结构与功能关系进而 揭示某些生命现象的本质。
[0003] 胆管癌恶性程度高，预后极差。手术是胆管癌的有效治疗手段，但术后5年生存率 不高。胆管癌约占胃肠道恶性肿瘤的3%，在全球范围内发生率呈逐年上升趋势。胆管癌发 病的平均年龄约为50岁，男性发病率约为女性的1.5倍。早期预防、早期发现、早期治疗是提 高人胆管癌手术根治率和5年生存率的关键。
[0004] 胆管癌的诊断依赖于临床表现、实验室检查和影像学检查的结合，最终确诊以病 理学或细胞学为"金标准"。但当患者出现临床症状，或影像学检查发现肿瘤时，患者大多已 是进展期肿瘤，手术切除率和根治率低，目前针对人胆管癌，仍然缺乏一种特异的和敏感的 诊断方法。
[0005] 本申请从转录组水平寻找肿瘤组织与正常组织之间的基因表达模式差异。希望通 过对差异基因表达的研究来推断基因与基因间的相互关系，细胞癌变过程中基因"开启"或 "关闭"的机制;揭示基因与胆管癌的发生和发展的内在联系。总之，本申请旨在为寻找癌变 过程中可能涉及的信号传导通路、阐明胆管癌癌变机理、发现用于预防和早期检测的候选 分子标志物以及基因治疗的可能靶点提供新的思路。

【发明内容】

[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于胆管癌早期诊断的 分子标志物。使用基因标志物来诊断胆管癌具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾 病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明提供了检测PEX13基因表达的产品在制备诊断胆管癌的工具中的应用。
[0009] 进一步，所述检测PEX13基因表达的产品包括检测PEX13基因 mRNA水平的产品、和/ 或检测PEX13蛋白水平的产品。
[0010] 进一步，所述检测PEX13基因表达的产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检 测、原位杂交或芯片检测PEX13基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的产品。
[0011] 进一步，所述用RT-PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增PEX13基因的引 物;所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增PEX13基因的引物;所述 用免疫检测诊断胆管癌的产品包括:与PEX13蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断 胆管癌的产品包括:与PEX13基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断胆管癌的产品包 括:蛋白芯片和基因芯片;其中，蛋白芯片包括与PEX13蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包 括与PEX13基因的核酸序列杂交的探针。
[0012]所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至少包括的一对特异扩增PEX13基因的引 物如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。
[0013]所述检测PEX13基因表达的产品可以是检测PEX13基因表达的试剂、也可以是包含 所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
[0014] 所述诊断胆管癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高 通量测序平台是一种特殊的诊断胆管癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的 基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱， 容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知PEX13基因的异常与胆 管癌相关也属于PEX13基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0015] 本发明还提供了一种诊断胆管癌的工具，所述工具包括检测PEX13基因表达的试 剂;所述试剂包括检测PEX13基因 mRNA的引物和/或探针、检测PEX13蛋白的抗体。
[0016] 所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
[0017] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述基因芯片包括固相载体以及固定 在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PEX13基因转录水平的针对 PEX13基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PEX13蛋 白的特异性抗体;所述基因芯片可用于检测包括PEX13基因在内的多个基因（例如，与胆管 癌相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括PEX13蛋白在内的多个蛋 白质(例如与胆管癌相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与胆管癌的标志物同时检 测，可大大提高胆管癌诊断的准确率。
[0018] 其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试 剂盒包括用于检测PEX13基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括PEX13蛋白的 特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片 方法检测PEX13基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对PEX13基因的 引物和/或探针。根据PEX13基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测PEX13基因表 达水平的引物和探针。
[0019] 所述试纸包括检测PEX13基因表达的试剂。
[0020] 所述高通量测序平台包括检测PEX13基因表达的试剂。
[0021] 与PEX13基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它 衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合， 任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的 长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂 交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超 过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序 列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
[0022]进一步，所述PEX 13蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PEX 13蛋 白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab'）2、FV等。只要所述片段能够保留与PEX13蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平 的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。 [0023]在本发明的具体实施方案中，所述检测PEX13基因 mRNA的引物包括SEQIDN0.3和 SEQ ID N0.4所示的引物对。
[0024]本发明还提供了 PEX13基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗胆管癌的药物 中的应用。
[0025] 所述促进剂包括促进PEX13基因表达的试剂和促进PEX13基因表达产物的试剂;所 述促进PEX13基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进PEX13 蛋白含量的试剂;所述促进PEX13基因表达产物的试剂包括促进PEX13基因表达产物稳定性 的试剂、促进PEX13基因表达产物活性的试剂、促进PEX13基因表达产物功能的试剂。
[0026] 具体地，所述促进PEX13基因表达的试剂包括:含有PEX13基因的试剂、携带PEX13 基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有PEX13蛋白质的试剂。
[0027]本发明的促进剂一方面可以用于补充内源性的PEX13蛋白的缺失或不足，通过提 高TOX13蛋白的表达，从而治疗因 TOX13蛋白缺乏导致的胆管癌。另一方面可以用于促进 PEX13蛋白的活性或者功能，从而治疗胆管癌。
[0028] 本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、 粘粒、噬菌体、病毒等。
[0029] 在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物 细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CH0细胞、C0S细胞等。
[0030] 本发明还提供了一种用于治疗胆管癌的药物组合物，所述药物组合物包括上面所 述的PEX13基因和/或其表达产物的促进剂。
[0031] 进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不 限于）：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等;粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明 胶和聚乙烯吡咯烷酮;湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠;吸收促进剂季铵 化合物;表面活性剂如十六烷醇;吸附载体如高岭土和皂粘土;润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙 和镁、聚乙二醇等。
[0032] 本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式 包括将含有PEX13基因的药物或者含有PEX13蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回 输到体内。体内方式包括直接将含有PEX13基因的药物或者含有PEX13蛋白质的药物注入体 内组织中。
[0033] 本发明的药物还可与其他治疗胆管癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提 到治疗的成功率。
[0034] 在本发明的上下文中，"PEX13基因"包括PEX13基因以及PEX13基因的任何功能等 同物的多核苷酸。PEX13基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PEX13基因 (NC_000002.12)DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0035] 优选地，PEX 13基因的编码序列包括以下任--种DNA分子：
[0036] (1)序列表中SEQ ID N0· 1所不的DNA序列；
[0037] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0038] (3)与（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、优选地，90%以上同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA分子。
[0039]在本发明的具体实施方案中，所述PEX13基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0040] 在本发明的上下文中，PEX13基因表达产物包括PEX13蛋白以及PEX13蛋白的部分 肽。所述PEX13蛋白的部分肽含有与胆管癌相关的功能域。
[0041 ] "PEX13蛋白"包括PEX13蛋白以及PEX13蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括PEX13蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变 体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与PEX13的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
[0042]优选地，PEX13蛋白是具有下列氣基酸序列的蛋白质：
[0043] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0044] (2)将SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30 个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
[0045] (3)与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又称为序列同一性）， 更优选地，与SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性，常为96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列构成的多肽。
[0046]在本发明的具体实施方案中，所述PEX13蛋白是具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序 列的蛋白质。
[0047]通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0048]通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是PEX13蛋白的融合 蛋白。对于与PEX13蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留PEX13蛋 白的生物学活性即可。
[0049]本发明的PEX13蛋白也包括对SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要 经过修饰的蛋白质仍然能够保留PEX13蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变 的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
[0050] 在本发明的上下文中，"诊断胆管癌"既包括判断受试者是否已经患有胆管癌、也 包括判断受试者是否存在患有胆管癌的风险。
[0051] 在本发明的上下文中，"治疗胆管癌"从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓 解、疾病的完全治愈，还包括对于疾病治疗效果的评价。
[0052]本发明的优点和有益效果：
[0053]本发明首次发现了 TOX13基因表达与胆管癌相关，通过检测受试者胆管组织中 PEX13的表达，可以判断受试者是否患有胆管癌、或者判断受试者是否存在患有胆管癌的风 险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0054]本发明发现了一种新的分子标记物-PEX13基因，相比传统的检测手段，基因诊断 更及时、更特异、更灵敏，能够实现胆管癌的早期诊断。
【附图说明】
[0055]图1显示利用QPCR检测PEX13基因在胆管癌组织中的表达情况；
[0056] 图2显示利用Western blot方法检测PEX13基因在胆管癌组织中的表达情况；
[0057]图3显示利用QPCR检测PEX13基因在胆管癌细胞中的过表达情况；
[0058]图4显示利用Western blot方法检测PEX13基因在胆管癌细胞中的过表达情况； [0059] 图5显示PEX13基因表达对胆管癌细胞生长的影响。
[0060]具体的实施方式
[0061]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0062]实施例1筛选与胆管癌相关的基因标志物 [0063] 1.1样品收集
[0064]各收集10例正常胆管组织和胆管癌组织样本。上述样本为胆管癌患者的手术切除 标本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
[0065] 1.2RNA样品的制备及质量分析
[0066] 1 · 2 · 1RNA样品的制备
[0067] ①先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药 匙取50~100mg组织粉末加入已盛有lml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超 过所用Trizol体积的10% )，充分混合均勾。
[0068]②室温放置5min，然后加入200μ1的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。
[0069] ③12000rpm离心10min，取上层水相于一新的ΕΡ管中（千万不要将中间的沉淀层和 下层液混入，否则重新离心分离），加入500μ1异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min， 12000rpm离心 1 Omin。
[0070] @小心地弃去上清液，加入11111的75%乙醇，祸旋混勾，4°〇下12000印1]1离心5111；[11。 重复操作一次。
[0071] ⑤弃去上清液(尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5~10min(注意不要干燥 过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μ1 DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55°C~60°C 水浴1 Omin ANA可进行mRNA分离，或贮存于70 %乙醇并保存于-70 °C。
[0072] 1.2.2RNA样品的质量分析(NanoDroplOOO分光光度计）
[0073] NanoDroplOOO分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求:0D260/0D280为 1·8_2·2 〇
[0074] 3、基因芯片杂交及扫描
[0075] 总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美 国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x44K基因），在芯片杂交炉中65°C杂交17h，然后洗 脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0076] 4、芯片数据处理与分析
[0077] 杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值 的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
[0078] 5、统计学处理
[0079]采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P〈 0.05差异有显著性意义。
[0080] 6、结果
[0081] 芯片结果显示，PEX13基因在胆管癌组织中的表达量显著低于正常的胆管组织。
[0082] 实施例2 QPCR测序验证PEX13基因的差异表达
[0083] 1、根据芯片的检测结果选择PEX13基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样 本收集方式选择胆管癌组织和正常胆管组织各50例。
[0084] 2、RNA提取步骤同实施例1。
[0085] 3、逆转录:使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
[0086] (1)取总RNA 2yg进行逆转录，加入01igo(dT)2yl，充分混匀。70°C水浴5分钟后立 即冰浴2-3分钟。
[0087] (2)构建25μ1反应体系，其中包括5X逆转录缓冲液5yl，dNTP(2.5mM)5yl，RNasin 4〇υ/μ1，M-MLV 20〇υ/μ1，补无核酶水至预期体积。
[0088] (3) 42 °C水浴60分钟后，95 °C水浴5分钟以灭活M-MLV。
[0089] (4)-2(TC 储存备用。
[0090] 4、QPCR 扩增
[0091] (1)引物设计
[0092] 根据Genbank中PEX13基因和GAroH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生 工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0093] PEX13 基因：
[0094] 正向引物为5'-GTTATCCTTGGTGGTCCTT-3'（SEQ ID N0.3);
[0095] 反向引物为5'-GTTGATGCTGTCTGTTACTTC-3'（SEQ ID N0.4)。
[0096] GAPDH 基因：
[0097] 正向引物为5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.5);
[0098] 反向引物为5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID N0.6)。
[0099] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0100] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0101] 表1 PCR反应体系
[0103] (3汗0?反应条件：951€511^11，（95°(：158,6〇1€6〇8)*45个循环。以5￥81?6代611作为荧 光标记物，在Light Cycler焚光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定 目的条带，△△ CT法进行相对定量。
[0104] 5、统计学方法
[0105]实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具 有统计学意义。
[0106] 6、结果
[0107]结果如图1所示，与正常胆管组织相比，PEX13基因在胆管癌组织中的表达下调，差 异具有统计学意义(P〈〇.05)，同芯片结果一致。
[0108]实施例3在蛋白水平上检测PEX13基因的差异表达 [0109] 1、提取组织总蛋白
[0110] 按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
[0111] 2、Western blot检测
[0112] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、 显色。
[0113] 3、统计学处理
[0114] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条 带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具有统 计学意义。
[0115] 4、结果
[0116]结果如图2所示，与正常胆管组织相比，胆管癌组织中PEX13蛋白含量降低，差异具 有统计学意义(P〈〇.〇5)。
[0117] 实施例4 PEX13基因表达质粒构建
[0118] UPEX13基因表达载体的构建
[0119] 根据PEX13基因的编码序列（如SEQ ID NO. 1所示）设计扩增引物。从成人胎脑的 cDNA文库（clontech公司，货号：638831)中扩增全长的PEX13基因的编码序列，将上述cDNA 序列插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-PEX13用于后续实 验。
[0120] 2、细胞培养:人胆管癌细胞株QBC939,以含10%小牛血清的DMEM(高糖)培养基在 37°C、5 % C02、相对湿度为90 %的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25 %胰蛋白酶常规 消化传代。
[0121] 3、细胞转染
[0122] 将胆管癌细胞按1 X 104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5%C02培养箱中细 胞培养24h，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司）的说明书转染，实验分 为对照组(转染pcDNA3.1)和实验组(转染pcDNA3.1-PEX13)，转染质粒的工作浓度是0.5yg/ ml 〇
[0123] 4、利用QPCR实验检测质粒转染的效果。
[0124] 4.1提取细胞总RNA
[0125]米用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No. 15596-018)总RNA提取试剂，按说明书 提供方法提取QBC939细胞的总RNA。具体方法为：取细胞，用浓度为0.01M的roS冲洗3次，加 入适量TRIzol试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以lmL/管分装至1.5mL Eppendorf 管中。每管加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2_3min，4°C、12000r/min离心15min，将 上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0.5mL异丙醇，轻轻混勾，室温放置lOmin，4°C、 750〇1'/111；[11离心10111；[11。弃上清，75%乙醇洗涤1?熟沉淀，75001'/111；[11离心5111；[11，室温干燥1?祖沉 淀，5-10min后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整 性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
[0126] 4.2逆转录
[0127] 步骤同实施例2。
[0128] 4.3QPCR
[0129] 步骤同实施例2。
[0130] 4.4统计学方法
[0131]实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具 有统计学意义。
[0132] 5、Western 检测
[0133] 具体步骤同实施例3。
[0134] 6、结果
[0135] 如图3所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-TOX13的细胞中 PEX13的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P〈0.05);如图4所示，与转染pcDNA3.1空 载体的细胞相比，转染PCDNA3.1-PEX13的细胞中PEX13的蛋白水平显著上调，差异具有统计 学意义(P〈〇.〇5)。
[0136] 实施例5 PEX13基因对胆管癌细胞增殖的影响
[0137] 1、细胞转染:按照实施例4的方法对胆管癌细胞进行转染。
[0138] 2、转染24小时后加入3H-TdR(lyCi/孔），再培养24小时，收集细胞，加液体闪烁液， β计数仪检测cpm值。
[0139] 3、统计学方法
[0140]实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，组间差异采用t检验，认为当P〈0.05时具有统计 学意义。
[0141] 4、结果
[0142] 结果如图5显示，与pcDNA3.1空载体组相比，转染pcDNA3.1-PEX13的细胞增殖变慢 了，差异具有统计学意义(P〈〇.05)。
[0143] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进 和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测PEXl3基因表达的产品在制备诊断胆管癌的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、 免疫检测、原位杂交芯片或高通量测序平台检测PEX13基因表达以诊断胆管癌的产品。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断胆管癌的产品至少包括 一对特异扩增PEX13基因的引物;所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异 扩增PEX13基因的引物;所述用免疫检测诊断胆管癌的产品包括:与PEX13蛋白特异性结合 的抗体;所述用原位杂交诊断胆管癌的产品包括:与PEX13基因的核酸序列杂交的探针;所 述用芯片诊断胆管癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PEX13蛋白 特异性结合的抗体，基因芯片包括与PEX13基因的核酸序列杂交的探针。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至 少包括的一对特异扩增PEX13基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。5. -种诊断胆管癌的工具，其特征在于，所述工具包括检测PEX13基因表达的试剂;所 述试剂包括检测PEX13基因 mRNA的引物和/或探针、检测PEX13蛋白的抗体。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述检测I3EXl3基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。 7. PEX13基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗胆管癌的药物中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进PEX13基因表达的试剂、促进 PEXl 3基因表达产物稳定性的试剂、促进PEXl 3基因表达产物活性的试剂、促进PEXl 3基因表 达产物功能的试剂。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，促进PEX13基因表达的试剂包括含有PEX13 基因的试剂、携带PEXl 3基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有PEXl 3蛋白质的试剂。10. -种用于治疗胆管癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括7-9中任一 项所述的促进剂。
【文档编号】G01N33/574GK105950752SQ201610416482
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】邓放
【申请人】北华大学