一种成骨细胞分化基因检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种成骨细胞分化基因检测试剂盒，所述试剂盒含有Atg5、Atg7、BECN1、LC3、ALP、OC、CollengeΙ和OPG的引物对。本发明检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，验证在成骨分化过程中自噬水平的变化，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
【专利说明】
一种成骨细胞分化基因检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于骨质疏松症领域，特别涉及一种成骨细胞分化基因检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 骨的生长和发育与成骨细胞的功能密切相关。成骨细胞通过分泌大量的骨胶原和 骨基质，以及一些重要的细胞因子和酶类启动骨形成过程，并通过这一系列因素与破骨细 胞调节相偶联，控制破骨细胞的生成、成熟和活化，使骨形成和骨吸收处于动态平衡中。骨 形成和骨吸收失偶联导致的骨量减少及骨微细结构退变是骨质疏松症的主要病理特征。骨 质疏松所引起的骨折，以及骨折相关并发症给社会和家庭造成极大的经济负担。目前对于 骨质疏松症的治疗药物种类繁多，但疗效不完全或存在难以克服的药物不良反应，国内外 学者都在不断努力寻找抗骨质疏松症治疗的新途径。
[0003] 细胞自噬是近年来研究的热点，早期研究认为自噬是细胞对应激环境的一种适应 性反应，随着对自噬研究的深入，自噬在很多方面的作用逐渐被认识，它可以通过及时清除 损伤的线粒体减少自由基的释放，减轻氧化应激反应损伤。有研究证实条件性敲除小鼠成 骨细胞自噬基因 Atg7，骨组织中的氧化应激水平升高，成骨细胞自噬的水平受到限制，成骨 细胞活力明显下降，呈现骨质疏松样的改变。除此之外，自噬还在许多疾病的发生发展过程 中发挥着重要的作用，自噬与肿瘤、免疫和衰老等密切相关。细胞自噬功能障碍与神经退行 性疾病包括阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病的发生密切相关。在骨髓间充质干细胞中， 自噬对其成骨或成脂分化似乎有一定的调节作用。然而，自噬在骨质疏松症中的具体作用 机制目前尚不清楚。
[0004] TFEB是自噬的关键转录调控因子，它能直接结合到目标自噬基因启动子区域的目 标位点并促进他们的表达，这些目标基因包括:UVRAGWIPI、MAP1LC3B、SQSTM1、VPS11、VPS18 和ATG9B。除此之外，TFEB还被证实是溶酶体产生最主要的调节因子，TFEB控制多种溶酶体 相关蛋白的表达，包括溶酶体水解酶、溶酶体膜蛋白，以及自噬相关基因。TFEB直接结合到 位于不同的溶酶体基因的启动子区域，协调溶酶体的表达，导致溶酶体蛋白表达的显著升 高。而自噬与溶酶体的功能密切相关。TFEB是MiTF/TFE家族成员，都有helix-loop-helix亮 氨酸拉链结构。MITF主要在生黑色素细胞、破骨细胞、肥大细胞、巨噬细胞、NK细胞、B细胞以 及心肌细胞中表达，TFEC的表达主要局限在骨髓起源细胞，而TFE3和TFEB则普遍存在于多 种细胞类型。既往的研究表明TFEB与破骨细胞的分化与功能密切相关，而在成骨细胞中的 作用尚无研究。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种成骨细胞分化基因检测试剂盒，该试剂盒 检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，验证在成骨分化过程中自噬水平的变化，为临床 上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
[0006] 本发明的一种成骨细胞分化基因检测试剂盒，所述试剂盒含有下列引物对：
[0023] 所述试剂盒还包括DNA提取试剂和PCR缓冲液。
[0024] 所述试剂盒的PCR反应条件为:95 °C 30s，95 °C 10s，60 °C 30s，共40个循环。
[0025] 所述试剂盒的PCR反应结束后1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察 并确认条带位置。
[0026] 抽提组织总RNA后先进行逆转录再使用试剂盒。
[0027] 有益效果
[0028] 本发明检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，验证在成骨分化过程中自噬水 平的变化，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
【附图说明】
[0029] 图1A-D分别为成骨细胞早期分化过程中，成骨分化标志基因随诱导天数增加的变 化情况；
[0030] 图2A-D分别为自噬特异性的自噬相关基因在成骨诱导不同天数时的变化；
[0031 ] 实验数据用均数土标准误表示，*P〈0 · 05，**Ρ〈0 · 01，***P〈0 · 001。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0033] 实施例1
[0034] 1.总RNA的分离和提取
[0035] 1)弃去细胞培养液，用PBS(lx)冲洗三遍，六孔培养板每孔加入lml Trizol，裂解5 分钟左右之后，用lml的移液枪吹打板底，使贴壁细胞悬浮于Trizol中，收集Trizol细胞悬 液至1.5ml的EP管中，置于-80°C冰箱中保存或直接进行分离抽提；
[0036] 2)lml Trizol中加入200ul的氯仿，盖紧EP管的盖子，将EP管颠倒混匀15次，至液 体混浊后室温静置15分钟；
[0037] 3)随后将静置后的EP管放于低温离心机中，4°C，12000rpm，离心15分钟。小心取出 EP管，可见EP管中溶液出现分层，下层为红色苯酚-氯仿溶液中含有DNA;薄薄的中间白色层 含有蛋白质;上层是水溶液，RNA即溶解在上层水溶液中，约占整个溶液体积的60%。离心期 间，准备一套新的EP管，每管加入500ul异丙醇，标记好管子后，关闭超净台的前窗，打开紫 外灯；
[0038] 4)小心取出离心好的EP管，用小容量的移液枪小心吸取上清无色水相至刚才新标 记的EP管中，按0.5ml异丙醇/lml Trizol加入异丙醇，加完一个EP管要关好盖子，以免RNA 被外界的RNA酶降解，将EP管颠倒混匀15次，使RNA充分与异丙醇混匀；
[0039] 5)将混匀后的EP管放于低温离心机中，4°C，12000rpm，离心15分钟。小心取出EP 管，可见白色的RNA沉淀贴附在管壁一侧；
[0040] 6)去掉上清液，按lml/lmlTrizol加入由DEPC水新配制的75%酒精，轻轻震荡EP 管，尽量使RNA沉淀漂起，与酒精充分接触；
[0041 ] 7)再次离心，4°C，9000rpm，5分钟，使RNA白色沉淀沉于管底；
[0042] 8)去掉上清液，重复上面的步骤，再次用75%的酒精洗涤一次RNA;
[0043] 9)再次离心，4°C，9000rpm，5分钟，使RNA白色沉淀沉于管底；
[0044] 10)弃上清，室温干燥RNA沉淀，并根据沉淀的大小，用10_30ul RNase-free水溶解 RNA样品后，用RNA浓度测定仪测定提取的RNA的浓度，把提取好的RNA样品置于-80°C冰箱中 保存，或直接进行RT-PCR逆转录。本试验所用物品均需要经过DEPC水处理。
[0045] 2.用ΝΑΝΟ测定RNA浓度
[0046] 1)双击桌面Nano软件的图标打开软件；
[0047] 2)选择检测功能，选择Nuc 1 eic Acid，并对检测样品命名，以方便在电脑中查找和 储存；
[0048] 3)选择对应样品测试类型为:RNA，抬起仪器上臂，加样品缓冲液1.5ul到仪器的下 基座上，加样完毕后，放下仪器上臂，点击软件左上角的Blank图标，大约5秒后，开始测试；
[0049] 4)待样品缓冲液测试完毕后，抬起上臂，用无尘纸把上下基座擦拭干净，擦拭完 后，先把样品和缓冲液充分混匀，然后用移液枪分别取等量的上述提取好的RNA样品，并把 样品依次加到仪器的基座上，并且点击Measure键进行检测；
[0050] 5)待样品测试完后，抬起上臂，用无尘纸清洁上下基座，然后加纯水3ul至仪器的 下基座上并放下上臂，静止3分钟后用无尘纸擦去；
[0051 ] 6)把用仪器测出的RNA浓度值、260/280和260/230的值分别记录下来，以备后面实 验中使用。
[0052] 3.逆转录
[0053] 1)根据计算的RNA浓度，取lug RNA，用RNase-free水调节体积至5ul，其中含 lulPrimer，70°C预热10分钟使RNA链解聚后，迅速放于冰上；
[0054] 2)每 15ul反应体系中加入2ug RNA(5ul)，lul反转录酶，0.5ul RNasin，lul dNTP Mixture (lOmM)，4ul Reverse Transcription 5x buffer,4ul MgCl2(25mM)，最后用 Nuclease-free水补齐至15ul后，混勾；
[0055] 3)逆转录PCR，按如下条件设置操作程序:25°C，5分钟-42°C，60分钟-70°C，15分 钟-4°C，f orever，将逆转录所得到的cDNA放于-20°C冰箱中保存，或直接用于Real-time PCR检测。
[0056] 4.Real-time PCR
[0057]根据反转的cDNA的质量，将反转录得到的cDNA稀释合适的倍数，反应体系lOul为： (ddH2〇，lul) + (SYBR Green，5ul) + (primer F，lul，primer 1?，1111) + (〇0嫩，2111)。反应条件 为:95°C，30sec; (95°C，10sec;60°C，30sec) X40cycles，各检测基因引物序列如下所示：
[0074] 5.结果
[0075] (1)成骨细胞系MC3T3-E1成骨诱导分化的结果
[0076]取成骨细胞系MC3T3-E1细胞，以2X105/ml的密度接种于6孔板，待细胞生长融合 至约80%时加入成骨细胞诱导液进行成骨诱导培养。在诱导的0天、2天、5天和7天四个时间 点分别提取细胞的RNA，通过RT-PCR检测三个组别之间成骨分化标志基因的表达情况，并同 时在2天、5天、7天时进行碱性磷酸酶染色。RT-PCR的结果显示，在成骨细胞系MC3T3-E1细胞 诱导分化过程中，成骨分化标志基因0(：、〇)11^1^、(^6的表达水平随诱导天数增加呈增高 趋势(图1A-D)。
[0077] (2)成骨细胞分化过程中自噬相关基因的变化
[0078]自噬是一个复杂的生理过程，在自噬现象的背后涉及到约三十多个自噬相关的基 因，其中我们选择了4个特异性比较高的自噬相关基因做RT-PCR分析：LC3、Atg5、Atg7、 Beclin-1，他们均是参与自噬体形成和调控的重要基因，通过调控自噬使机体更好的适应 外界的应激变化。由图2可以看出在成骨细胞成骨分化的过程中，自噬的特异性基因 LC3、 Atg5和Atg7均表达出不同程度的上调趋势，而Beclin-Ι在成骨诱导第7天的时候出现下调 趋势，但是总体的趋势还是上调的。
[0079]本实施例在MC3T3-E1细胞成骨分化模型中发现成骨细胞分化和自噬的相关关系， 通过试剂盒分析了在成骨分化过程中自噬水平的变化，验证了这一结论并探讨自噬在骨质 疏松症发生中的可能的作用机制。
【主权项】
1. 一种成骨细胞分化基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有下列引物对： Atg5 F:5 '-TGTGCTTCGAGATGTGTGGTT-3 '； R:3 '-GTCAAATAGCTGACTCTTGGCAA-5 '； Atg7 F:5 '-CCTGCACAACACCAACACAC-3 '； R:3 '-CACCTGACTTTATGGCTTCCC-5 '； BECNl F:5 '-ACCGGGTCACCATCCAGGAA-3 '； R:3 '-GAAGCTATTAGCACTTTCTGT-5 '； LC3 F:5 '-CTTCTTCCTCCTGGTGAATGG-3 '； R:3 '-ATTGCTGTCCCGAATGTCTC-5 '； ALP F:5，-CCAAAAACTCAACACCAACG-3，； R:3 '-TCCATCTCCAGCCGTGTCT-5 '； OC F:5，-TGCAGACCTAGCAGACACCAT-3，； R:3，-ACTCAGAGTCGCTGGGCTTT-5，； Collenge I F:5'-TGTCCCAACCCCCAAAAA-3'； R:3 '-ATGACTTCTGCGTCTGGTGAT-5 '； OPG F:5 '-CTTCGTGCCTTGATGGA-3 '； R:3 '-TGTAGGGTGAAAGGGTT-5 '。2. 根据权利要求1所述的一种成骨细胞分化基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒 还包括DNA提取试剂和PCR缓冲液。3. 根据权利要求1所述的一种成骨细胞分化基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒 的 PCR 反应条件为:95 °C 30s，95 °C IOs，60 °C 30s，共 40 个循环。4. 根据权利要求3所述的一种成骨细胞分化基因检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒 的PCR反应结束后1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并确认条带位置。5. 根据权利要求1所述的一种成骨细胞分化基因检测试剂盒，其特征在于:抽提组织总 RNA后先进行逆转录再使用试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK105950769SQ201610527657
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】宁光, 赵红燕, 赵点点, 孙立昊, 陶蓓, 刘建民
【申请人】上海市内分泌代谢病研究所, 上海交通大学医学院附属瑞金医院