一种番鸭细小病毒lamp检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括：反应液甲：含有10×等温反应缓存液、dNTPs、硫酸镁、内引物1、内引物2、外引物1、外引物2及甜菜碱；反应液乙：Bst DNA 聚合酶，反应液丙：含双抗的灭菌PBS。本发明提供的试剂盒最低检测限为10fg，其灵敏性是RT?PCR的10倍。本发明试剂盒具有良好的特异性、灵敏性、快速高效、且结果判定简单等优点，能较好的满足最番鸭细小病毒的现场检测，为基层检测提供了新的技术平台，能较好的满足目前对养殖场现场检测的迫切需要。
【专利说明】
一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及病原微生物检测技术领域，具体说是涉及一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(Muscovy Duck Parvovirus，MDPV)引起的以腹泻和喘气为主要症状的急性或亚急性传染病。该病主要危害30日龄以内的雏番鸭，特别是1-3周龄的雏番鸭，因此俗称“三周病”。该病传播迅速，常造成整群发病并死亡，发病率和死亡率都很高。日龄较大的雏鸭一般症状较轻，病死率较低，但病愈后大部分生长发育受阻成为僵鸭，料肉比增大，已经成为危害我国养鸭业发展最为严重的传染病之一。
[0003]现阶段，该病的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验、ELISA等，但是这些检测方法存在灵敏性低、周期长、重复性差、不易标准化等缺点，在实际应用中不易大范围的推广使用。现有的PCR以及荧光定量PCR检测方法，一定程度上克服了上述的困难，但是往往需要使用昂贵的实验设备和试剂、经过专门培训的的操作人员等诸多弊端，不能适应基层兽医站或养殖场临床一线简便、快速检测的需要。
[0004]环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplificat1n，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的链置换DNA聚合酶(即Bst DNA聚合酶)，在等温条件下进行核酸的变形和自动循环的链置换核酸扩增反应，整个反应不需要特殊的仪器设备，一台能够控温的水浴锅就能完成。伴随LAMP反应的进行，产生的焦磷酸根离子能够与体系中添加的镁离子形成乳白色的焦磷酸镁沉淀，方便结果的判定，无须传统核酸电泳染色紫外观察的繁琐步骤，不仅节省了时间也保护了操作者和环境。LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适用于基层和现场一线对快速检测的需要。本发明采用环介导等温扩增技术研制一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒，具有十分重要的社会意义和经济意义。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供“一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒”，该试剂盒具有特异性强、灵敏性高、不易造成污染、操作简便、成本低廉、快速得出结果的番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒，以满足基层和现场对快速检测番鸭细小病毒的需要。
[0007]为了实现上述目的，本发明所采用的主要技术方案是，一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括:
反应液甲:含有10X等温反应缓存液、dNTPs、硫酸镁、内引物1、内引物2、外引物1、外引物2及甜菜碱；
反应液乙:Bst DNA聚合酶，
反应液丙:含双抗的灭菌I3BS。
[0008]进一步的技术方案是，所述10X等温反应缓存液含有pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁及I %曲拉通X-1OO。
[0009]进一步的技术方案是，试剂盒中包括:
反应液甲:含有10 X等温反应缓存液、1mM dNTPs、25mM硫酸镁、20μΜ的内引物1、20μΜ的内引物2、20μΜ的外引物1、20μΜ的外引物2及5Μ甜菜碱；
反应液乙:Bst DNA聚合酶8U/yL;
反应液丙:含双抗的灭菌I3BS;
所述内引物I序列为:
CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG所述内引物2序列为:CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT所述外引物 I 序列为:AGACTATTTGATTGGAAAAGACC所述外引物2序列为:GGTACAGCATGGGCAATA。
[0010]进一步的技术方案是，所述10X等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、20mM硫酸镁和及I %曲拉通X-100。
[0011]进一步的技术方案是，所述反应液甲每管23yL，其组成为:10XBstbuffer 2.5μL、10mM dNTPs4.5yL、5M Betainel.5yL、25mM MgS044.5yL^20yM FIP/BIP2.5μ?、20μΜ F3/B30.5yL、|—A4yL。
[0012]本发明还公开了采用上述试剂盒的检测方法，该检测方法包括如下步骤:
(1)DNA的提取:
1)、用灭菌棉拭子旋转插入鸭泄殖腔采集粪便残渣及分泌物；
2)、取出后投放于含双抗的灭菌PBS反应液丙所在离心管中，轻轻摇动使其溶解；
3)、4°C、12000rpm离心15min，取上清，再用0.22μηι微孔滤膜过滤；
4)、参照EasyPureviral DNA/RNA kit提取试剂盒说明书，对步骤3)中的病毒液进行核酸抽提，所得即为待检DNA样品；
(2)PCR扩增:
25yL体系:23yL反应液甲，Bst DNA聚合酶IyL及模板IyL混匀，短暂离心构成25yL反应体系；
PCR反应条件:将水浴锅预热至60°C，反应管半浸入水中，恒温反应60min，水浴锅加热至85°C灭活5min，取出反应管观察结果；
(3)判断结果:
肉眼观察反应管清晰度判定，如反应管浑浊呈淡乳白色，则说明待检样品中含有番鸭细小病毒;如果反应管保持澄清透明，说明待检样品不含番鸭细小病毒。
[0013]本发明与现有技术相比具有如下优点:
1、由于本发明所设计采用的两对特异性引物来自番鸭细小病毒基因中高度保守的区段，采用该引物对能准确、快速、方便的判别病料中是否含有番鸭细小病毒。
[0014]2、特异性强:所检测的阴性对照病毒均无阳性结果出现，与PCR结果相一致。
[0015]3、灵敏度高:普通PCR检测最低限度为10fg数量级，而采用本发明检测方法，检测限最低可达到I Ofg，是普通PCR的1倍。
[0016]4、时效性强:普通PCR检测整个过程在3-4 h左右才能得出判断结果，而采用本发明检测方法，只需1.5小时即可做出判断结果。
[0017]5、环保无污染:普通PCR结束后还要进行琼脂糖凝胶电泳，使用EB等对人和环境造成损害的染料，而采用本发明检测方法，无需昂贵的PCR仪，只需能够控温的普通水浴锅即可，反应结束后可直接通过肉眼观察溶液是否变浑浊而直接判定。同时有效地避免了因为开盖造成的气溶胶污染，确保了每次实验结果的准确性。
【附图说明】
[0018]图1是应用本发明番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒的检测方法特异性试验结果图。
[0019]其中:M、DL2000 DNA Marker，1、番鸭细小病毒，2、鸭瘟病毒，3、鸭肝炎病毒，4、新城疫病毒，5、小鹳痕病毒。
[0020]图2— I是应用本发明番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验结果图。
[0021]图2— 2是应用本发明番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验量化结果图。
其中:M、DL2000 DNA Marker，N、negative(阴性对照)，1、10ng/yL，2、lng/yL，3、10pg/yL，4、10pgAiL，5、lpgAiL，6、100fgAiL，7、10fgAiL，8、lfgAiL。
[0022]图3— I是PCR方法检测番鸭细小病毒敏感性试验结果图。
[0023]图3— 2是PCR方法检测番鸭细小病毒敏感性试验量化结果图。
其中:M、DL2000 DNA Marker，N、negative(阴性对照)，1、10ng/yL，2、lng/yL，3、10pg/yL，4、10pgAiL，5、lpgAiL，6、100fgAiL，7、10fgAiL，8，lfgAiL。
[0024]图4是番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒阴性及阳性结果判定标准。
[0025]图中:阳性结果对应管中液体呈现淡乳白色，阴性结果对应管中液体呈现原有的澄清透明状态。
【具体实施方式】
[0026]下面通过非限制性实施例，进一步阐述本发明，理解本发明。
[0027]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。
实施例
[0029]实施例1:番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒的配制
一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒包括:反应液甲:含有10 X等温反应缓存液、1mMdNTPs、25mM硫酸镁、20μΜ的内引物1、20μΜ的内引物2、20μΜ的外引物1、20μΜ的外引物2、
5Μ甜菜碱。
[0030]所述10 X等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、20mM硫酸镁和I %曲拉通X-100。
[0031]其中，反应液甲每管23yL，其组成为:10XBstbuffer 2.5yL、10mM dNTPs4.5yL、5M Betainel.5yL、25mM MgS(k4.5μ?、20μΜ FIP/BIP2.5μ?、20μΜ F3/B30.5yL、双蒸水4yL。
[0032]内引物I序列为:
CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG 内引物2序列为:
CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT外引物 I 序列为:AGACTATTTGATTGGAAAAGACC外引物2序列为:GGTACAGCATGGGCAATA反应液乙:Bst DNA聚合酶8U/yL，
反应液丙:含双抗的灭菌PBS。(直接购买即可)
实施例2:采用上述试剂盒的检测方法，该检测方法包括如下步骤:
(1)DNA的提取:
1)、用灭菌棉拭子旋转插入鸭泄殖腔采集粪便残渣及分泌物；
2)、取出后投放于含双抗的灭菌PBS反应液丙所在离心管中，轻轻摇动使其溶解；
3)、4°C、12000rpm离心15min，取上清，再用0.22μηι微孔滤膜过滤；
4)、参照EasyPureviral DNA/RNA kit提取试剂盒说明书，对步骤3)中的病毒液进行核酸抽提，所得即为待检DNA样品；
(2)PCR扩增:
25yL体系:23yL反应液甲，Bst DNA聚合酶IyL及模板IyL混匀，短暂离心构成25yL反应体系；
PCR反应条件:将水浴锅预热至60°C，反应管半浸入水中，恒温反应60min，水浴锅加热至85°C灭活5min，取出反应管观察结果；
(3)结果判断:
1)肉眼判断法:肉眼观察反应管清晰度判定，如反应管浑浊呈淡乳白色，则说明待检样品中含有番鸭细小病毒;如果反应管保持澄清透明，说明待检样品不含番鸭细小病毒。
[0033]
2)琼脂糖凝胶电泳判定法:琼脂糖凝胶电泳，如对应泳道出现特异性的梯形条带，则说明待检样品中含有番鸭细小病毒;如对应泳道未出现特异性的梯形条带，则说明待检样品不含番鸭细小病毒。
[0034]经多次重复，肉眼观察法不仅克服了琼脂糖凝胶电泳法在操作过程中存在的费事费力等诸多弊端，而且在结果判定上两种判定结果也完全一致。
[0035]实施例3:LAMP检测法的特异性试验
如图1所示:分别取IyL番鸭细小病毒、新城疫病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒的核酸为模板，按照实施例2中番鸭细小病毒LAMP反应程序进行反应并观察结果。
[0036]结果见图1，对番鸭细小病毒的检测为阳性结果(有特异性梯形条带)，而对新城疫病毒、鸭肝炎病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒的检测均为阴性(无特异性梯形条带)。
[0037]实施例4: LAMP检测法的灵敏性试验
将番鸭细小病毒DNA按 10 倍递增稀释成 10ng/yL、lngAiL、100pgAiL、10pgAiL、lpgAiL、100fg/yL、1fg/yL、Ifg/yL。
[0038]分别取IyL各稀释度数的番鸭细小病毒DNA为模板，按照前述番鸭细小病毒LAMP反应程序进行反应并观察结果。
[0039]结果见图2 — 1、图2 — 2，番鸭细小病毒LAMP检测方法的检测限为10fg。
[0040]实施例5:PCR扩增及结果对照番鸭细小病毒PCR反应组成如下:
50yL反应体系:含25mM MgSO4 2.5yL,10XPCR buffer 5yL,10mM dNTPs 2yL，Taq 聚合酶(51])0.541^，
上游引物:5- TATGGATCCATGGCAGAGGGAGGAAGC -3 IyL，
下游引物:5- TAAGAGCTCCAGATTCTGAGTCAAATACC -3 IyL，
不同浓度番鸭细小病毒0嫩模板(10呢/^、1即/^、10(^/4^、1(^/^、]^/^、100把/yL、10fgAiL、lfgAiL)lyL，35yL 双蒸水。
[0041 ] PCR反应条件:940C预变性2分钟，然后进入94 V变性I分钟，57 °C退火I分钟，72°C延伸I分钟的循环，共进行35个循环，最后再经72°C延伸10分钟。
[0042]结果见图3 — 1、图3 — 2，番鸭细小病毒PCR检测方法的检测限为lOOfg。
[0043]番鸭细小病毒LAMP结果见图3 — 1、图3 — 2，番鸭细小病毒PCR检测方法的检测限为10fg0
[0044]番鸭细小病毒LAMP检测可视化结果，番鸭细小病毒LAMP检测反应结束后，直接肉眼观察，结果见图4，阳性结果对应管中液体呈现淡乳白色，阴性结果对应管中液体呈现原有的澄清透明状态。
[0045]番鸭细小病毒LAMP检测法的检测限为1fg，而PCR检测法的检测限为lOOfg，可见本发明LAMP检测法比PCR检测法更为灵敏，完全可以替代传统的PCR检测方法。
[0046]实施例6:临床病料检测从2015年3月到2016年I月，共收集来自国家水禽基因库的50个样品，利用本发明的试剂盒对50份样品进行检测诊断，诊断结果显示，仅有6例为番鸭细小病毒，阳性率为12%ο同时分别采用RT-PCR法和ELISA法进行检测，结果阳性率与试剂盒检出阳性率一致。
[0047]综上所述，本发明所设计采用的两对特异性引物来自番鸭细小病毒基因中高度保守的区段，建立一种LAMP检测番鸭细小病毒的方法。通过上述实验实施例证明，该试剂盒及方法具有灵敏性高、其灵敏性是RT-PCR的10倍，特异性好的特点，是一种成本低、检测准确、操作快速、方便的番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒，为基层检测提供了新的技术平台，能较好的满足目前对养殖场现场检测的迫切需要。
[0048]
[
序列表
〈110〉江苏农牧科技职业学院
〈120〉一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒
〈160〉 6
〈210〉 I
〈211〉 50
〈212〉 DNA
〈213〉内引物I
〈400〉 CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG〈210〉 2〈211〉 42〈212〉DNA
〈213〉内引物2
〈400〉CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT
〈210〉3
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉外引物I
〈400〉AGACTATTTGATTGGAAAAGACC
〈210〉4
〈211〉18
〈212〉DNA
〈213〉外引物2
〈400〉GGTACAGCATGGGCAATA
〈210〉5
〈211〉27
〈212〉DNA
〈213〉PCR上游引物
〈400〉TATGGATCCATGGCAGAGGGAGGAAGC
〈210〉6
〈211〉29
〈212〉DNA
〈213〉PCR下游引物
〈400〉TAAGAGCTCCAGATTCTGAGTCAAATACC 。
【主权项】
1.一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括: 反应液甲:含有1X等温反应缓存液、dNTPs、硫酸镁、内引物1、内引物2、外引物1、外引物2及甜菜碱； 反应液乙:Bst DNA聚合酶， 反应液丙:含双抗的灭菌PBS。2.根据权利要求1所述的一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述1X等温反应缓存液含有PH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁及1 %曲拉通X-100。3.根据权利要求1所述的一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括: 反应液甲:含有10 X等温反应缓存液、1mM dNTPs、25mM硫酸镁、20μΜ的内引物1、20μΜ的内引物2、20μΜ的外引物1、20μΜ的外引物2及5Μ甜菜碱； 反应液乙:Bst DNA聚合酶8U/yL; 反应液丙:含双抗的灭菌PBS; 所述内引物I序列为: CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG 所述内引物2序列为: CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT 所述外引物I序列为: AGACTATTTGATTGGAAAAGACC 所述外引物2序列为: GGTACAGCATGGGCAATA 。4.根据权利要求3所述的一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述10X等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、20mM硫酸镁和及I %曲拉通X-100。5.根据权利要求3所述的一种番鸭细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述反应液甲每管23yL，其组成为:10XBst buffer 2.5yL、10mM dNTPs4.5yL、5M Betainel.5yL、25mMMgS044.5yL、20yM FIP/BIP2.5yL、20yM F3/B30.5yL、双蒸水4yL。
【文档编号】C12Q1/68GK105950786SQ201610347110
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】王永娟, 朱善元, 胡成, 左伟勇, 王安平, 洪伟鸣, 吴双, 秦枫
【申请人】江苏农牧科技职业学院