从人多能干细胞定向分化星形胶质细胞用于肌萎缩侧索硬化(als)的治疗和药物筛选的制作方法【专利摘要】本发明公开了使用离体分化的多能干细胞(PSC)鉴定影响人星形胶质细胞功能性的剂的方法。此外，亦公开了人祖星形胶质细胞或人星形胶质细胞用于在受试人中治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的用途。【专利说明】从人多能干细胞定向分化星形胶质细胞用于肌萎缩侧索硬化(ALS)的治疗和药物筛选[0001]发明领域及背景本发明在其一些实施方案中涉及使用离体分化的多能干细胞(PSC)鉴定影响人星形胶质细胞功能性的剂的方法。此外，亦提供人星形胶质细胞用于治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的用途。[0002]ALS为运动神经元（MN)疾病，以丧失上下MN为特征（Moloney等，FrontNeurosci2014，8:252)。其对美国约30,000个体，全球约150,000个患者以及以色列约400个体产生影响。5-10%的ALS病例为家族性ALS，但是大多数ALS病例为偶发性的，原因不明。携带ALS相关的突变型人S0D1基因的转基因小鼠和大鼠重现所述人类疾病的许多特征。重点注意的是，迄今为止，除了一种FDA获准的化合物，力如太(利鲁唑）之外，再无可用的有效治疗，所述化合物仅将寿命延长最多三个月。[0003]ALS在已发生显著细胞损失的时候被诊断出。MN轴突的长度长至一米。所述MN轴突将细胞体与其靶标(肌肉）连接。在MN替代疗法之后恰当地重建(rewire)并确保功能连接的能力，仍为具有不确定结果的令人畏缩的任务，并且迄今为止未证实这在人类中将是可能的。因此，在诊断之后尝试避免进一步的细胞损失，将对MN存活以及患者的生活质量和寿命具有显著影响。[0004]然而，ALS中的细胞异常不限于MN。在ALS患者(偶发性ALS(sALS)和家族性(fALS)二者）中有许多星形胶质细胞机能障碍的观察结果。来自ALS患者的星形胶质细胞与正常运动神经元的体外共培养似乎加速所述运动神经元的死亡。[0005]因此，对于产生解决这些缺损的人星形胶质细胞（自人PSC细胞中繁殖和扩展的），有广泛公认的需求。[0006]发明概述根据本发明的一方面，提供筛选用于预防或治疗运动神经元(MND)疾病(例如肌萎缩侧索硬化(ALS))的剂的方法，所述方法包括：(a)使星形胶质细胞群体与所述剂接触，所述星形胶质细胞离体分化自多能干细胞(PSC);(b)将步骤(a)的星形胶质细胞群体或其调节的（conditioned)培养基与神经元群体共培养;和(c)定量所述剂增强所述神经元群体的存活或神经功能的作用。[0007]根据本发明的一些实施方案，所述神经元群体为缺氧的、在氧化应激下的、在谷氨酸盐毒性下的或者谷氨酸盐/NMDA/AMPA/在红藻氨酸盐毒性下的。[0008]根据本发明的一些实施方案，星形胶质细胞与神经元的群体比率为大于1:1、10:1、100:1、1000:1或10,000:1〇[0009]根据本发明的一些实施方案，所述星形胶质细胞表达GFAP、GLAST、AQP4的每一个或其组合。[0010]根据本发明的一些实施方案，所述星形胶质细胞显示分泌神经营养因子，其选自BDNF、GDNF和VEGF。[0011]根据本发明的一些实施方案，所述氧化应激选自活性氧簇(ROS)、过氧化氢(H2〇2)及其任何衍生物。[0012]根据本发明的一些实施方案，所述定量通过计数处于凋亡下的神经元数量来进行。[0013]根据本发明的一些实施方案，所述神经元的凋亡通过半胱天冬酶-3a标记、膜联蛋白V、微管蛋白_B3、HB9或DAPI来检测。[0014]根据本发明的一些实施方案，所述剂为小分子。[0015]根据本发明的一些实施方案，正常的人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞应提供防止运动神经元死亡的环境。[0016]根据本发明的另一方面，提供用于在有需要的受试者中治疗或预防ALS进展的方法;所述方法包括将人祖星形胶质细胞(hAPC)或星形胶质细胞给予有需要的受试者，所述人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞离体分化自多能干细胞(PSC)。[0017]根据本发明的一些实施方案，所述给予涉及有需要的受试者的脑脊液、脑或脊髓实质。[0018]根据本发明的一些实施方案的一方面，提供一种药物组合物，其包含作为活性剂的本发明的细胞群体，以及药学上可接受的载体。[0019]根据本发明的一些实施方案，所述细胞群体为未经基因操作的。[0020]根据本发明的一些实施方案，所述人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞对于所述受试者而言为非自体同源的。[0021]根据本发明的一些实施方案，所述人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞对于所述受试者而言为同种异体的。[0022]根据本发明的一些实施方案，提供人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞用于制备经鉴定用于治疗ALS的药剂的用途，所述人星形胶质细胞或星形胶质细胞离体分化自多能干细胞(PSC)。[0023]除非另有规定，否则本文所用的所有技术和/或科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管可将与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料用于实施或检验本发明的实施方案，但仍在下文描述示例性的方法和/或材料。如有冲突，将以本专利说明书(包括定义）为准。此外，所述材料、方法和实施例仅为说明性的而不意图其为必要限制。[0024]附图简述本专利或申请文件含有至少一个以彩色实行的附图。经要求并支付必要费用之后，将由官方提供带有彩图的本专利或专利申请出版物的副本。[0025]参考随附图片和影像，在本文中描述本发明的一些实施方案(仅举例说明）。现在详细地具体参考附图，要强调的是所示详情为举例说明的并且以说明性论述本发明的实施方案为目的。在这点上，所述带有附图的说明，使得本发明的实施方案可如何实施，对于本领域技术人员而言为显而易见的。[0026]在附图中：图1阐述通过hESC源星形胶质细胞的星形胶质细胞系基因表达的动力学。显示了各基因在第0、7、14、21、28和35天的表达。将成人脑和人胎脑用作对照。以下颜色一一橙、蓝、绿、黄、红和浅蓝分别代表GFAP、BDNF、PDGFRa、GLAST、GDNF和ALDH1L1的基因表达动力学。对于各基因，胎脑表达用作内参基因（相对定量，RQ=1)。[0027]图2A-C阐述hESC源星形胶质细胞表达星形胶质细胞标志物。通过FACS测量0、7、14、21、28、35和43天的4.0044、8.0乂0?4和(：.61^51'。？06?和0犯^为已知促进4?(：定型和分化的因子。测试了未处理(NT)、PDGF、CNTF和TOGF+CNTF处理对hESC-APC分化的影响(标志物表达％)。蓝线:NT，红线：CNTF，绿线：CNTF+PDGF，浅蓝:PDGF。通过hPSC源星形胶质细胞方案获得的群体产生星形胶质细胞富化群体。[0028]图3A-E阐述hESC源星形胶质细胞表达成熟星形胶质细胞的标志物。A.GFAP阳性细胞的灰度。B.GLAST阳性细胞的灰度。C.A+B的重叠组合图像（overlaymontageimage)，红色为GFAP阳性细胞，绿色为GLAST阳性细胞以及蓝色为Dapi阳性细胞。黄色染色表示对GFAP和GLAST的共染色。D.C插入的放大(关于黄色染色的相同观察）』.绿色为水通道蛋白-4阳性细胞(AQP4)以及红色为GLAST阳性细胞。A-C和E比例尺：100μπι以及D比例尺：30融〇[0029]图4A-C阐述hPSC源星形胶质细胞产生和分泌神经营养因子，如分别在星形胶质细胞激活之后的细胞内容物和培养基中所测量。A.IFN-γ激活之后的GDNF细胞内容物及分泌物（红色）。1IFN-γ激活之后的BDNF细胞内容物及分泌物（橙色）<X.LPS激活之后的VEGF细胞内容物及VEGF分泌物(紫色）。[0030]图5Α-Β阐述通过hESC源星形胶质细胞的500μΜ和2mM谷氨酸盐摄取的动力学。Α.从左到右(绿色条）：在分化的第100天向hESC源星形胶质细胞中加入500μΜ谷氨酸盐之后的0'、10'、30'、60'、90'和120'。浅红色条:11月性对照，不含星形胶质细胞的含有500μΜ谷氨酸盐60'的培养基。深红色条-2nd阴性对照，120'之后与人成纤维细胞一起生长的培养基中的谷氨酸盐水平。右侧条(蓝色）：阳性对照，与人脊髓来源的星形胶质细胞一起生长的培养基中的谷氨酸盐水平。B.从左到右(浅绿色条）：在分化的第100天向hESC源星形胶质细胞中加入2mM谷氨酸盐之后〇'、1〇'、30'、60'、90'和120'。蓝色条：阴性对照，在没有星形胶质细胞的情况下60'之后含2mM谷氨酸盐的培养基。[0031]图6A-D阐述人PSC源星形胶质细胞对氧化应激下的运动神经元的神经保护作用。[0032]A.用Η202(50μΜ和150μΜ)补充MN达6小时或不进行处理。在此期间，不处理MN或者对其补充星形胶质细胞上清液(24小时调节的培养基)或星形胶质细胞。Α:不含Η2〇2的ΜΝ中的半胱天冬酶-3a%通过灰色条(右)表示。仅与Η2〇2-起孵育的ΜΝ中的半胱天冬酶-3a%通过红色条(50μΜH2〇2)和橄榄绿色条（150μΜH2〇2)表示，或者在加入星形胶质细胞调节的培养基之后通过橙色条和浅绿色条表示，以及在存在星形胶质细胞时通过粉红色条和浅绿色条表示。B和C中的半胱天冬酶-3激活(红色）。运动神经元用beta3微管蛋白（绿色)染色，细胞核用DAPI染色。D.用于图像定量和分析的高内涵分析装置的图像。[0033]图7A-C证实注射人祖星形胶质细胞(hAPC)增加hSODl小鼠的存活。A.以两个时间点（第130天和第140天）比较hSODl小鼠存活的表格。如在第140天所示，移植"第7天"细胞(在不含生长因子的条件下生长7天）的小鼠的存活增加。B.比较所有实验组的Kaplan-Meir生存曲线。C.比较所有实验组的对通过旋转〈106测量的针对疾病发作生成的Kaplan-Meir曲线。[0034]图8A-C证实早期的人来源的星形胶质细胞在hSODl小鼠中增加运动性能。A.比较所有组的通过BBB评分描述的疾病进展的动力学。0=正常小鼠，5=瘫痪小鼠。B.比较所有实验组的通过转棒(rotarod)评分描述的疾病进展的动力学，180秒=正常小鼠，0=不能握住转棒的小鼠。C.转棒仪上的小鼠。[0035]图9证实早期的人来源的星形胶质细胞维持移植hSODl体重。比较所有组的疾病进展全程的体重变化的动力学。[0036]图10阐述了KapalnMeierLogrank统计分析。对50%的所述群体进行LogRank生存分析。[0037]本发明具体实施方案的描述本发明在其一些实施方案中涉及使用离体分化的多能干细胞(PSC)鉴定影响人星形胶质细胞功能性的剂的方法。此外，亦公开了人星形胶质细胞或人祖星形胶质细胞用于治疗受试人中的肌萎缩侧索硬化(ALS)的用途。[0038]为了获得大量的人星形胶质细胞，本发明的发明人提出将其从人多能干细胞(PSC)中分化，所述人多能干细胞在分化之前能够无限繁殖。[0039]本发明进一步公开了用于从人多能干细胞(hPSC)中产生高同质性星形胶质细胞群体(>90%GFAP，S100b)的独特而强大的方案。所述分化方案连同可扩大培养技术，允许在体外产生大量的星形胶质细胞。这些hPSC源星形胶质细胞表现出与初级人星形胶质细胞相似的基因表达模式以及功能特性，包括：1)分泌保护运动神经元的神经营养因子(BDNF、GDNF和VEGF)。II)摄取谷氨酸盐的能力和III)在体外保护神经元免受氧化应激。这些hPSC源星形胶质细胞可冷冻保存并根据需要使用。[0040]在体内评价了所述人星形胶质细胞的治疗特性，对于所述目的，将所述细胞鞘内移植到G93A高拷贝数hSODl小鼠（用于ALS疾病的小鼠模型）中。人星形胶质细胞移植在所有功能测试中得到运动性能上的显著改善(P〈〇.05)。此外，在移植小鼠中观察到对存活和疾病期间的正效应。[0041]ALS以皮质、脑干和脊髓中的运动神经元死亡为特征。在所述病例的约5-10%中，ALS为家族性的，其余为偶发性的。在家族性和偶发性ALS之间，所述疾病的进程难以区分。所述疾病在平均56岁年龄的生命晚期显露自身，并且一旦被诊断便在2-5年内导致完全瘫痪和死亡。在所述家族性患者的亚群中，在编码铜-锌超氧化物歧化酶1(S0D1)的基因中发现了突变。S0D1为涉及自由基解毒的胞质酶。此外，编码致病性人S0D1蛋白的等位基因在运动神经元中的过度产生，导致晚发的进行性神经变性疾病。研究已导向鉴定ALS运动神经元的内在致病特征，包括蛋白质聚集物的形成、细胞骨架异常、蛋白体机能障碍以及对细胞死亡信号增加的敏感性。此外，在其它细胞中编码致病性人S0D1蛋白的等位基因的过度产生，可导致非细胞自发的运动神经元病理，所述细胞常被发现在体内与运动神经元相关，例如但不限于神经胶质细胞(例如星形胶质细胞、Schwann细胞等）。编码致病性S0D1蛋白的等位基因的实例包括但不限于S0D1G93A、S0D1G85R和S0D1G37R。[0042]诸如ALS、阿尔茨海默氏病和帕金森病等神经变性疾病，为共同表现为严重健康护理负担的无法治疗的病况。需要对这些疾病的生物学的增进理解，以便开发神经保护治疗以及最终的修复性治疗。直至最近，神经变性疾病在很大程度上被视为专门的神经元病症。然而，近期研究结果对此观念提出异议，其暗示急性和慢性病症中的由星形胶质细胞介导的神经变性的非细胞自发性机制。人干细胞生物学允许模拟生理和损伤范例下的人星形胶质细胞-神经元相互作用。尽管已有用于产生神经干细胞和功能性神经元的稳健平台，但是富化和功能性人星形胶质细胞的产生相对而言正在研究。假设人星形胶质细胞可能通过其保护患病神经元且增加其存活的机制包括：防止谷氨酸盐神经毒性、分泌神经营养因子(NTF)例如BDNF和⑶NF，以及通过VEGF分泌的神经血管修饰。[0043]本发明部分基于在体外产生富化和功能性的人多能干细胞来源的祖星形胶质细胞和星形胶质细胞群体，以及建立用于ALS的剂筛选平台，其中测试了人星形胶质细胞对氧化应激下的运动神经元的神经保护作用。[0044]在本发明的一些实施方案中，提供方法和组合物用于鉴定、表征和优化表现出神经保护作用且增强人星形胶质细胞功能性的先导化合物。[0045]可使用本发明的测定法测试的剂包括小分子剂、化学品、肽、蛋白质、多核苷酸剂(例如siRNA剂）。[0046]使所述细胞与所述剂接触，可通过本领域已知的任何体外方法进行，所述方法包括例如将所述剂加入所述细胞中，以使所述剂直接与所述细胞接触。根据本发明的一些实施方案，将所述细胞与所述剂一起孵育。针对时间周期/细胞浓度/剂浓度/细胞和剂之间的比率等，选择用于孵育所述细胞的条件，这使得所述剂能够诱导细胞变化，例如经分析的在特定基因的转录和/或翻译速率上的变化。根据一个具体的实施方案，使所述细胞与所述剂接触至少1天、3天、5天、7天、10天、14天或至少21天。[0047]可将候选的神经保护性先导化合物加入本发明细胞的培养基中，并测定所需特性。可挑选表现出所需特性的化合物，例如相对于不存在所述候选神经保护性先导化合物时的活运动神经元数量，增加培养基中活运动神经元数量的化合物，用于进一步的表征和优化。可针对其增加在与人星形胶质细胞的共培养物中或其调节的培养基中的运动神经元生存力的能力来挑选化合物。[0048]所述高通量筛选亦可用于鉴定能够校正任何疾病相关表型的化合物，所述表型例如存活、凋亡、坏死、轴突变性、轴突引导、轴突形态、树突形态、受体密度、突触发生、神经发生、突触密度、突触传递、突触信号转导、受体运输、蛋白质运输、蛋白质聚集、蛋白酶体活性、受体表达、氧化应激(R0S)、FGFR-信号转导和FGF信号转导。[0049]针对其调节细胞表型的能力（例如神经保护作用）挑选的候选先导化合物的表征和优化，包括但不限于进一步筛选，生成衍生物及类似物，分析吸收分布、代谢和排泄(ADME)特征，安全性试验和功效试验。具体而言，优化努力可包括开发设计成通过血脑屏障的化合物。[0050]药物候选化合物(或"测试剂"）可以是精选的独立小分子(例如来自先前药物筛选的先导化合物)或者在一些情况下，待筛选的药物候选化合物来自组合文库，即通过将许多化学"结构块"组合的化学合成或生物合成生成的多种化学化合物的集合。例如，诸如多肽文库等线性组合化学文库，是通过针对给定化合物长度（即多肽化合物中氨基酸的数量）以每种可能的方式将称为氨基酸的化学结构块的集合组合来形成。数百万的化学化合物可通过化学结构块的这类组合式混合来合成。甚至，在理论上，1〇〇种可交换化学结构块的系统的组合式混合，得到1亿个四聚体化合物或100亿个五聚体化合物的合成。[0051]本文所用的术语"存活"意指细胞通过其避免死亡的任何过程。本文所用的术语存活，亦指防止如通过坏死、凋亡所证实的细胞损失，或者防止其它机制的细胞损失。本文所用的增加存活，指示相对于未处理对照在细胞死亡率上至少10%、25%、50%、75%、100%或更多的降低。所述存活率可通过计数培养基中能够被对死细胞特异的染料(例如碘化丙啶)染色的细胞来测量。[0052]用于本发明测定的细胞包括离体分化自多能干细胞的星形胶质细胞。[0053]例如，可从人胚泡或延期的胚泡阶段分离人胚胎干细胞（如描述于W02006/040763)。人胚泡通常获自人体内植入前胚胎或来自体外受精（IVF)胚胎。或者，可将单细胞人类胚胎扩展至胚泡期。对于分离人ES细胞，将透明带从胚泡中取出并通过免疫外科分离内细胞团（ICM)，其中使滋养外胚层细胞裂解并通过轻轻吹吸从完整ICM中去除。然后将ICM接种到含有适当培养基的组织培养瓶中，所述培养基使其能够向外生长。9-15天之后，通过机械解离或通过酶促降解将来自ICM的生长物解离成团（clump)，然后将所述细胞重新接种到新鲜的组织培养基上。通过微量移液器单独挑选显示未分化形态的集落，机械解离成团并重新接种。然后每1-2周常规分裂所得ES细胞。对于制备人ES细胞的方法的进一步详情，参见Thomson等，[美国专利号5,843,780;5(^61^6282:1145，1998;(：11灯.1'(^.06￥·Biol.38:133，1998;Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844，1995];Bongso等，[Hum1^卩1'0(14:706，1989];6&『(11161'等，[卩61'1:;[1.3七61'；[1.69:84，1998]〇[0054]将理解的是，商购可得的干细胞亦可用于本发明的此方面。人ES细胞可购自NIH人类胚胎干细胞登记处(<http://escr.nih.gov>)。商购可得的胚胎干细胞系的非限制性实例为BG01、BG02、BG03、SA01、TE03(I3)、TE04、TE06(I6)、HES-1、HES-2、HES-3、UC01、UC06、WA0UWA07和WA09。[0055]本发明使用的干细胞亦可来源于诱导的多能干细胞（IPSc)。[0056]不论其来源，根据本发明使用的干细胞为至少50%纯化的、75%纯化的或至少90%纯化的。当使用人胚胎干细胞系时，例如通过机械和/或酶促手段从其滋养层(经X-射线辐照的成纤维细胞样细胞)中分离所述人ES细胞集落，以提供基本上纯的干细胞群体。[0057]一旦获得人干细胞，便可对其进行处理以分化成星形胶质细胞。一个示例性方法描述于下文材料和方法部分。然而将理解的是，本发明方法考虑用于生成星形胶质细胞的其它方法，其为本领域已知的。[0058]所用的培养基是根据所用的干细胞来选择。因此，例如，适于ES细胞生长的培养基可以是例如DMEM/F12(Sigma_Aldrich，St·Lewis，M0)或alphaMEM培养基（LifeTechnologiesInc.，Rockville，MD，USA)，其补充有支持的酶和激素。这些酶可以是例如胰岛素(ActRapid;NovoNordisk，Bagsvaerd，DENMARK)、孕酮和/或Apo转铁蛋白（BiologicalIndustries，BeitHaemek，Israel)。其它成分列于实施例部分。[0059]本文所用的短语"视黄酸"是指维生素A的活性形式(合成的或天然的），能够诱导神经细胞分化。可根据本发明使用的视黄酸形式的实例包括但不限于视黄酸、视黄醇、视黄醛、11-顺-视黄醛、全反-视黄酸、13-顺视黄酸和9-顺视黄酸(均可得自Sigma-Aldrich，St.Lewis,M0)〇[0060]在本发明的一些实施方案中，以1-50μΜ的浓度范围使用视黄酸。[0061]所述培养基可进一步补充生长因子，其可至少存在于部分培养期中以促进细胞增殖以及利于分化成神经元的神经胶质细胞系。根据本发明的此方面的一个实施方案，所述生长因子包括例如EGF(5-50ng/ml)和bFGF(5-50ng/ml)(R&DSystems，Minneapolis，MN，Biotest，Dreieich，Germany)〇[0062]本文所用的短语"神经球"是指这样的类球形的簇或球，其主要含有神经干细胞和早期多能祖细胞，所述细胞可分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞以及其它神经胶质细胞。[0063]培养所述细胞直至形成成熟的神经球。[0064]本文所用的短语"成熟的神经球"是指这样的神经球，其中神经干细胞中的某些已分化变为具有获得的少突胶质细胞系标志物（例如3似10、他12.2.、如2^285)的特化少突胶质细胞祖细胞，而其它的已分化变为神经祖细胞或星形胶质细胞祖细胞。[0065]根据本发明的一个实施方案，使所述细胞培养例如10-30(例如20-30)天，在此结束时形成分离的神经球。然后使所述神经球或自其解离的细胞粘附至粘附基底(例如基质胶或胞外基质组分（如胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白））并用生长因子使之进一步扩展以及在去除生长因子之后在阳离子粘附基底(例如含有纤连蛋白（FN)的多聚-D-赖氨酸或多聚鸟氨酸)或粘附基底(例如基质胶或胞外基质组分(如胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白））上最终分化。[0066]本文所用的术语"人星形胶质细胞祖细胞(hAPC)"或"人祖星形胶质细胞"意指能够产生为成熟星形胶质细胞的子代的细胞。通常，所述细胞表达星形胶质细胞系所特有的表型标志物中的某些。[0067]术语"给予的"和"给予"是指通过其将本文所考虑的治疗上有效量的星形胶质细胞或药剂递送给受试者用于预防和/或治疗目的的过程。所述星形胶质细胞和药剂依照良好医疗实践给予，并考虑所述受试者的临床病况、给予的部位和方法、剂量、患者年龄、性另IJ、体重及医师已知的其它因素。[0068]术语"治疗"是指逆转、缓解或抑制所述术语应用的疾病的进展或者所述疾病的一种或多种症状。治疗包括管理和护理正在诊断或之后的受试者。治疗可以急性或慢性方式进行。根据所述受试者的病况，所述术语可指预防疾病，并且包括预防疾病的发作或者预防疾病相关的症状。所述术语亦指在受疾病所累之前减轻所述疾病的严重性或所述疾病相关的症状。所述在受累之前预防或减轻疾病的严重性，是指给予并未在给予时间内受所述疾病所累的受试者星形胶质细胞或相同组成的药剂。"预防"亦指预防疾病或者所述疾病相关的一种或多种症状的复发。治疗的目标为对抗所述疾病并且包括给予所述星形胶质细胞以预防或延迟所述症状或并发症的发作，或者减轻所述症状或并发症，或者消除或部分消除所述疾病。术语"疗法"和"在治疗上"，是指治疗的行为，如"治疗"在上文所定义。[0069]本发明涉及这样的细胞及其群体，其可移植到患者中以治疗大量的神经变性疾病。[0070]根据本发明的一些实施方案，未对所述细胞及其群体进行基因操作（即，使用表达构建体转化)以产生本文所述的细胞及细胞群体。[0071]术语或短语"移植术"、"细胞替代"或"移植(grafting)"在本文中可交换使用，以及是指将本发明的细胞引入靶组织中。[0072]可将所述细胞移植到中枢神经系统中或者室腔中或者硬膜下移植到宿主脑的表面上或者宿主脑脊液上。成功移植的条件可包括：（i)所述植入物的生存力；（ii)所述移植物保留在移植部位;和（iii)在移植部位最小量的病理反应。用于将不同神经组织例如胎脑组织移植到宿主脑中的方法已描述于："哺乳动物CNS中的神经移植(NeuralgraftinginthemammalianCNS)"，Bjorklund和Stenevi，编辑（1985);Freed等，2001;Olanow等，2003)。这些程序包括实质内移植，即在宿主脑中（与脑外部或实质外移植相比），其通过在宿主脑中注射或安置(deposition)组织来实现，以便在移植时对抗脑实质。实质内移植可使用两种途径实现：（i)将细胞注射到宿主脑实质中或（ii)通过外科方式制备腔以暴露所述宿主脑实质并随后将所述移植物安置到所述腔中。两种方法均在移植时提供所述移植物与宿主脑组织之间的实质安置，并且二者均利于所述移植物与宿主脑组织之间的解剖学整合。如果需要所述移植物变为所述宿主脑的组成部分并且在所述宿主的生命中存活，那么这很重要。或者，可将所述移植物置于室(例如脑室）中或者硬膜下置于脑脊液上，即置于通过介入软脑膜或蛛网膜和软脑膜将其从宿主脑实质中分离的宿主脑的表面上。移植到室中可通过注射所述细胞来完成。对于硬膜下移植，可在硬膜中制备切口之后在脑表面的周围注射所述细胞。注射到所选的宿主脑区中可通过钻孔并刺穿硬膜以允许插入微量注射器的针头来进行。优选将所述微量注射器安装在立体定位架上并且选择三维立体定位坐标用于将所述针头放入脑或脊髓的所需部位中。亦可将所述细胞引入脑的壳、基底核、海马皮质、纹状体、黑质或尾状区以及脊髓中。[0073]亦可将所述细胞移植到组织的健康区域中。在一些情况下，受损组织区的准确位置可能是未知的，并且可能将所述细胞无意中移植到健康区域。在其它情况下，可能优选将所述细胞给予到健康区域，从而避免对所述区域的任何进一步损伤。不论哪种情况，在移植之后，所述细胞均可迀移到受损区域。[0074]对于移植，将所述细胞悬液吸入注射器中并给予麻醉的移植受体。可使用此程序进行多次注射。[0075]因此所述细胞悬浮程序允许将所述细胞移植到脑和脊髓中的任何预定部位，为相对非创伤性的，允许使用相同的细胞悬液在数个不同部位或相同部位同时多次移植。[0076]对于移植到腔内，其对于脊髓移植可能为优选的，从靠近中枢神经系统(CNS)外表面的区域中移除组织以形成移植腔，例如通过Stenevi等(BrainRes.114:1-20.，1976)所述，通过移除覆盖脑的骨并使用例如明胶海绵等材料止血来进行。可使用抽吸产生所述腔。然后将所述移植物置于所述腔中。[0077]鉴于非自体同源细胞在给予身体时可能诱导免疫反应，已开发数种途径来降低非自体同源细胞的排异作用的可能性。这些途径包括阻抑受体免疫系统。免疫抑制剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤、环磷酰胺、环孢霉素、环孢霉素A、氯喹、羟氯喹、柳氮磺吡啶(磺胺柳氮吡啶（811]^1^83132(^5^；[116))、氯金酸钠(801(1331〖8)、0-青霉胺、来氟米特、硫唑噪呤、阿那白滞素、英夫利昔单抗、依那西普、TNF、a阻断剂(靶定炎性细胞因子的生物剂）、和非甾体抗炎药(NSAIDhNSAID的实例包括但不限于乙酰水杨酸、胆碱水杨酸镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮略酸、甲氯灭酸盐(meclofenamate)、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、他克莫司、托美丁、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂和曲马多。[0078]术语"受试者"、"个体"或"患者"在本文中可交换使用，以及是指包括温血动物在内的动物，例如哺乳动物。[0079]本文所用的术语"健康受试者"意指不具有诊断的ALS或ALS症状的受试者，具体而言为哺乳动物。[0080]本文所用"药物组合物"是指本文所述的一种或多种活性成分或细胞与诸如生理学上合适的载体和赋形剂等其它化学组分的制剂。药物组合物的目的是要利于将细胞或化合物给予生物。[0081]本文的术语"活性成分"是指增强所述运动神经元群体的存活或神经功能的剂。[0082]下文中，短语"生理学上可接受的载体"和"药学上可接受的载体"可交换使用，是指不会引起对生物的显著刺激并且不会消除所述给予化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。辅剂包含在这些短语之内。[0083]本文的术语"赋形剂"是指加入药物组合物中以进一步利于活性成分给予的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。[0084]"治疗上有效的量"涉及星形胶质细胞或其药剂的量或剂量，其将导致一种或多种所需效应，具体而言，一种或多种有益效应。物质的治疗上有效的量可根据以下因素而不同，例如所述受试者的疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述物质在所述受试者中引起所需反应的能力。可调整给药方案以提供最佳的治疗反应(例如有益效应，更具体而言持续的有益效应）。例如，可每日给予数个分次剂量或者可相称地减少剂量，如通过治疗状况的紧急情况所指示。[0085]诱导的多能和多潜能干细胞系在本文中被称为"诱导的干细胞系"（iSC系）。诱导的多能干细胞被称为iPS细胞或iPSC。[0086]本文所用的"校正"表型，是指改变表型以使其更密切接近正常表型。[0087]用于配制和给予药物的技术可在"雷明顿药物科学（Remingtοη'sPharmaceuticalSciences)"，MackPublishingCo.，Easton，PA，最版本版中找到，其通过引用结合到本文中。[0088]本文所用的术语"大约"是指±10%。[0089]术语"包括（comprises)"、"包括（comprising)"、"包含（includes)"、"包含(including)"、"具有"及其变化形式(conjugates)，意指"包括但不限于"。[0090]术语"由……组成"意指"包括且限于"。[0091]术语"基本上由……组成"意指所述组合物、方法或结构可包含另外的成分、步骤和/或部分，但仅在所述另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变权利要求的组合物、方法或结构的基本特征和新特征的情况下。[0092]贯穿本申请，本发明的各种实施方案可以范围形式表示。应理解的是，以范围形式描述仅为了方便和简洁，而不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应认为是具体地公开所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，如1-6的范围描述应认为是具体地公开诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范围，以及所述范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度，这均适用。[0093]每当本文中显示数值范围时，均意指其包含所示范围内的任何引用数字(分数或整数）。短语"范围为/范围在第一标示数和第二标示数之间"和"范围为/范围从第一标示数到第二标示数"，在本文中可交换使用并意指包含所述第一和第二标示数以及在其间的所有分数和整数。[0094]本文所用的术语"方法"是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的那些方式、手段、技术和程序，或其从已知的方式、手段、技术和程序中容易开发的那些方式、手段、技术和程序。[0095]要理解的是，本发明的某些特征，其为清楚起见而在独立的实施方案的文段中描述，亦可在单个实施方案中以组合提供。相反地，本发明的多个特征，其为简洁起见而在单个实施方案的文段中描述，亦可独立提供或者以任何合适的亚组合提供，或者在合适时(assuitable)在本发明的任何其它描述的实施方案中提供。在各个实施方案的文段中描述的某些特征，不被认为是那些实施方案的基本特征，除非所述实施方案在没有那些要素的情况下为无效的。[0096]如在下文中所述以及在下文权利要求部分中所要求的本发明的各个实施方案和方面，在下列实施例中得到实验支持。实施例[0097]现在对以下实施例进行参考，其同上文描述一起以非限制性方式阐述本发明的一些实施方案。[0098]-般而言，本文使用的命名法以及在本发明中所使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。文献中透彻地解释了这类技术。参见，例如"分子克隆:实验室手册（MolecularCloning:AlaboratoryManual)"Sambrook等，（1989);"分子生物学中的现行方案（CurrentProtocolsinMolecularBiology)"第I-III卷Ausubel，R.M.，编辑（1994);Ausubel等，"分子生物学中的现行方案（CurrentProtocolsinMolecularBiology)"，JohnWiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989);Perbal，"分子克隆实用指南（APracticalGuidetoMolecularCloning)"JohnWiley&Sons，NewYork(1988);Watson等，"重组DNA(RecombinantDNA)''，ScientificAmericanBooks，NewYork;Birren等（编辑）"基因组分析：实验室手册系列（GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries)''，第1-4卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);在美国专利号4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057中陈述的方法学；"细胞生物学：实验室手册（CellBiology:ALaboratoryHandbook)"，第I-III卷Cellis，J.E·，编辑（1994);"动物细胞培养-基本技术手册(CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechniqueFreshney,ffiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；"免疫学中的现行方案(CurrentProtocolsinImmunology)"第I-III卷ColiganJ.E·，编辑（1994);Stites等（编辑），"基础和临床免疫学（BasicandClinicalImmunology)"(第8版），Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994);Mishell和Shiigi(编辑），"细胞免疫学中的选择方法（SelectedMethodsinCellularImmunology)"，W.H.Freeman和Co.，NewYork(1980);可得的免疫测定法广泛描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利号3，791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011,771和5，281,521;"寡核苷酸合成（OligonucleotideSynthesis)"Gait，M.J.，编辑（1984);"核酸杂交(NucleicAcidHybridization)"Hames，B.D.和HigginsS.J·，编辑（1985);"转录和翻译（TranscriptionandTranslation)"Hames，B.D.和HigginsS.J·，编辑（1984);"动物细胞培养(AnimalCellCulture)"Freshney，R.I·，编辑（1986);"固定化细胞和酶(ImmobilizedCellsandEnzymes)"IRLPress，（1986);"分子克隆实用指南（APracticalGuidetoMolecularCloning)"Perbal，B.，（1984)和"酶学的方法(MethodsinEnzymology)"第1-317卷，AcademicPress;"RCR方案：方法和应用指导（PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications)''，AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak等，"蛋白质纯化和表征策略-实验室课程手册（StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual)''CSHLPress(1996);所有所述文献均通过引用结合，如同完整陈述于本文中。在整个本文档中提供其它的一般参考文献。认为其中的程序为本领域所熟知并且提供其以方便读者。其中包含的所有信息均通过引用结合到本文中。[0099]材料和方法用于测定的星形胶质细胞的产生使人ES细胞系在人新生儿包皮成纤维细胞(HEF)的滋养层上于37°C、5%C02下培养。所述生长培养基(ESI)由以下组成:DMEM/F12(Sigma)、14%knockout血清替代物(KSR)、非必需氨基酸（1/100)、0.111^[匕6七3-疏基乙醇（三者均来自111￥；[1：1'08611/6；[13(30)、111^[丙酮酸钠、2μg/ml肝素（Sigma)和8ng/ml人重组碱性FGF(FGF_2;Preprotech)。接种五天之后，使用1.2mg/ml胶原酶IV(Worthington)使hES细胞集落于37°C分离45-90分钟。如上将所述聚集物进一步培养，或者如所述（Izrael等MolCellNeurosci34,310-323(2007))使其经历分化。[0100]步潔转满.·对于此转换步骤，将hES细胞集落转移到组织培养板的培养基T(转换）中，所述培养基由50%(v/v)ESI培养基和50%(v/v)的ITTSPP/B27培养基组成。ITTSPP/B27本身为一体积的含2%B27补充物（Invitrogen)的DMEM/F12与一体积的含25μg/ml人膜岛素（ActRapid，NovoNordisk)、50μg/ml人Αρ〇-转铁蛋白（BiologicalIndustries，Israel)、6.3ng/ml孕酮、10μg/ml腐胺、50ng/ml亚硒酸钠和40ng/ml三鹏甲腺原氨酸(T3)(均来自Sigma)的DMEM/F12的混合物，并具有100U/ml青霉素和100yg/ml链霉素。培养基T补充有20ng/mlr-人EGF(R&DSystems)和4ng/mlr-人bFGFd天之后，将大量的未粘附的hES细胞集落和聚集物转移到6cm细菌(非粘附性)平板并在补充有20ng/mlr-人EGF(R&DSystems)和2ng/mlr-人bFGF的T培养基中生长。[0101]步潔^;全反式黎伊麽处湮；将培养基换成ITTSPP/B27,添加20ng/mlEGF和10μΜATRA。每天更换培养基，进行7天。[0102]步潔^;產浮潜养；在此步骤中，其使神经球(NS)成熟，所述培养在含20ng/mlEGF的ITTSPP/B27培养基中继续18天。每隔一天更换培养基。[0103]神经干细胞增殖和分化步潔^:基處歡齡将球/簇转移到6-孔组织培养板，所述培养板已使用以1:30稀释在DMEM/F12中的BD基质胶(减少生长因子的基质胶，BDBiosciences)于室温(RT)包被1.5h。所述培养基为含20ng/mlEGF的ITTSPP/B27,以及在一天之后去除任何未粘附的聚集物。每隔一天更换培养基，进行7-9天。[0104]:基處狡齡..挑选不含成纤维细胞和上皮细胞的神经球/簇并挑取到新的基质胶平板上。使神经球(不超过10NS)分离并使用含0.025%胰蛋白酶（InVitrogen)的PBS(不含Ca+和Mg2+)于37°C部分解离2-3min(第1代）。通过一体积的胰蛋白酶抑制剂(Invitrogen)和四体积的含2mg/mlBSA的ITTSPP/B27中和胰蛋白酶。使所述细胞在Eppendorf离心机中以1200rpm旋转五分钟。将解离的小细胞簇重新接种到基质胶包被平板（以1:1-1:3比率）中含20ng/mlEGF的ITTSPP/B27上(步骤4)。2-3周之后，如上通过胰蛋白酶处理解离所述细胞(第2代)并将所得hES-NS细胞接种到用多聚D-赖氨酸(PDL，100yg/ml)包被的平板或者基质胶包被的平板上，以及具有20ng/mlEGF的含小鼠层粘连蛋白（20μg/ml)或TOL(20μg/ml)和纤连蛋白5μg/ml的ITTSPP/B27,维持一天。在每次新接种时，向培养基中加入1μg/ml小鼠层粘连蛋白（Sigma)。[0105]步骤6和7:多聚D-赖氨酸或基质胶上的扩展：一天之后Μ培养基更培养基，其由含0.5%(v/v)N2补充物（Invitrogen)、l%(v/v)B27补充物的DMEM/F12组成。生长因子EGF和bFGF各自以10ng/ml添加。7-14天之后，通过胰蛋白酶消化使所述细胞分裂（1:2或1:3,第2代(P2))以获得单层。一周之后，用胰蛋白酶收集细胞并以0.5ΧΙΟ，细胞冻存在安瓿中(Ρ3)。在需要时(whenindicated)，每周进行进一步传代。[0106]为了富集星形胶质细胞并促进其定型，可使所述细胞生长在基质胶、Cultrex或Geltrex上。[0107]步潔^:仏去餘.·在不同的传代中，通过去除生长因子来启动终末分化。每当去除生长因子，便向N2/B27培养基中加入50μg/ml维生素C。使细胞在补充有生长因子bFGF和EGF的N2/B27培养基中解冻。在分裂并接种到96孔板之前一天，去除生长因子。[0108]使用添加星形胶质细胞条件培养基（astrocyteconditionmedium)或星形胶质细胞的神经保护测定化合物的效果可在下列步骤中测试(黄色圆圈）：1.在hAPC向成熟星形胶质细胞分化的期间可添加化合物，此后可向神经元中加入所述暴露于化合物的星形胶质细胞或其条件培养基。[0109]2.在诱导氧化应激之前24-72小时最后一次培养基更换时。[0110]3.在氧化应激期间的共培养中。[0111]4·可进行组合，BP1+2、1+3、2+3等。[0112]步潔7:从啮齿类动物的脊髓中产生运动神经元将来自大鼠胚胎(E15)的脊髓用于各实验。从全部脊髓中去除脑膜。将所述脊髓组织切成小碎片并分到15ml管中（每管5个胚胎）。向各管中加入胰蛋白酶(2ml，0.25%)(Gibco#250050014)并于37°C孵育15min。用NB培养基(7ml)和FCS(1ml)重悬浮细胞、以300g离心5分钟并吸除上清液。用NB培养基(2ml)重悬浮沉淀。对单细胞计数并接种（120K个细胞/孔)到基质胶(K)#FAL354230)包被的96孔板(Costar#cc-3596)上。在补充有50ng/mlNGF(Alomone#n-100)的NB培养基中培养细胞，每2天更换培养基。运动神经元的表征在培养三天之后进行。用微管蛋白_b3、神经丝和HB9(运动神经元特异性转录因子)将所述神经元染色。至少70%的所述神经元对这些抗体为阳性的。[0113]步蔡:星形胶质细胞接种在第8-10天（脊髓手术之后）接种所述星形胶质细胞。使用补充有50ng/mlNGF(Alomone#n-100)的NB培养基培养细胞。[0114]步潔^:星形胶质细胞条件培养基产生收集来自hPSC源星形胶质细胞(30-150日龄星形胶质细胞)的培养基；用补充有维生素C的新鲜N2B27以1:1稀释。所述培养基称为ACM(星形胶质细胞条件培养基）。[0115]步蔡4:氧化应激诱导(在第9-10天进行）用补充有维生素C或ACM的N2B27(150μ1)稀释50μΜ或150μΜH202(Sigma#216763)，并加至接种有星形胶质细胞的平板的各孔中。将所述平板于37°C孵育6小时。[0116]用4%PFA(100μ1/孔)将所述平板固定10分钟，然后将所述平板清洗两次并储存于4°C直至染色。[0117]:运动神经元细胞死亡分析：染色：将所述细胞与补充有Tx-1000.3%(sigma)的封闭缓冲液一起于室温(RT)孵育1小时，然后用PBS(-/-)清洗。[0118]将所述细胞与下列抗体一起于RT孵育1小时：Ist抗体-Rb-抗半胱天冬酶_3a(Promega#G748l)(1:25〇)Μ-抗-β-ΤιΛ3(Convence#MMS-435P)(1:500)Rb-抗-HB9(Abeam#AB-ab92606)(1:100)使用PBS(-/-)将所述细胞清洗两次，并与下列抗体一起于RT孵育1小时：211??体-山羊-抗-Rb-568(Invitrogen#A11036)(1:1000)山羊-抗-鼠-488(Invitrogen#A11029)(1:1000)使用PBS(-/-)将所述细胞清洗两次，用DAPI(1:1000)标记，孵育5min并使用PBS(_/_)清洗两次。使用ScanArray-Cellomics(Thermo-scientificinc)进行HCS分析。[0119]ACM或者添加hPSC源星形胶质细胞的效果可用其它应激诱导物测试，例如：-运动神经元兴奋性中毒。具体而言，谷氨酸盐毒性(除运动神经元细胞生存力之外测试谷氨酸盐摄取能力）-另外的活性氧簇毒性-AMPA/红藻氨酸盐毒性培养基组成：N2B27培养基：-DMEM/F12(Sigma#01-170)96.5%。[0120]-N2(Invitrogen#17502-048)0.5%〇[0121]-B27(Invitrogen#17504044)l%〇[0122]-Pen/Srep/AmphoB(Biologicalind.#03-〇33-lB)l%〇[0123]-GlutaMAX(Invitrogen#35050038)l%〇[0124]NB培养基:-Neurobasal培养基（Gibco#2ll〇3〇49)97%〇[0125]-B27(Invitrogen#17504044)l%〇[0126]-Pen/Srep/AmphoB(Biologicalind.#03-〇33-lB)l%〇[0127]-GlutaMAX(Invitrogen#35050038)l%〇[0128]使用FACS分析表征人PSC源星形胶质细胞：用于FACS的样品：将来自不同发育阶段的hPSC源星形胶质细胞的样品染色；第0天=在EGF和bFGF存在下生长的hPSC源星形胶质细胞第7-14天=在不存在EGF和bFGF的情况下生长7-14天的hPSC源星形胶质细胞第14-28天=在不存在EGF和bFGF的情况下生长14-28天的hPSC源星形胶质细胞第28-42天=在不存在EGF和bFGF的情况下生长28-42天的hPSC源星形胶质细胞第42-56天=在不存在EGF和bFGF的情况下生长42-56天的hPSC源星形胶质细胞FACS染色：试剂：FACS缓冲液:PBS(Gibco#14190-094)99.5%BSA(sigma#A9418)0.5%抗体：-GLAST(Miltenyi)-A2B5(Miltenyi)-CD44(Miltenyi)-CXCR4(Miltenyi)-CD140(BD)-CD9(Miltenyi)-CD133(Miltenyi)-TRA1-60(Miltenyi)-EpCAM(Miltenyi)-ALDHILI(Miltenyi)-GFAP(固定之后）（Sigma)_Aqua4(固定之后+Tx_100)粘附细胞的细胞制备：使用胰蛋白酶(Gibco)将细胞进行胰蛋白酶消化3分钟，用含有补充了2mg/mlBSA(Sigma，Cat#:A9418)的DTI(Gibco)的DMEM/F12(Sigma)灭活。将细胞连同培养基一起收集到锥形管中，以300g于RT离心5分钟并弃去上清液。使用冷的PBS缓冲液(Gibco，Cat#:14190-094)重悬浮细胞，以300g于RT离心5分钟并弃去上清液。[0129]固定:使用PFA0.5%(经稀释的，EMC)重悬浮细胞并于4°C孵育30分钟。将细胞以300g离心5分钟，弃去上清液。用1mlPBS清洗细胞，以300g离心5分钟并弃去上清液。[0130]用于胞内抗原染色的透化:将细胞与Tx-1000.5%-起于4°C孵育30分钟以将细胞膜透化。将细胞以300g离心5分钟，弃去上清液。用PBS重悬浮细胞，以300g离心5分钟并弃去上清液。[0131]免疫染色:用FACS缓冲液(FB)(1X105个细胞/管，以100ul的体积)重悬浮细胞。[0132]对于未缀合的第一抗体：用FB分别稀释未缀合的第一抗体和未缀合的同种型对照抗体。根据制造商说明书以最佳稀释度稀释第一抗体。用所述稀释的第一抗体或稀释的同种型对照抗体重悬浮细胞并于4°C孵育30min。将细胞以300g离心5分钟并弃去上清液。用FB清洗细胞并以300g离心5分钟，弃去上清液。用FB稀释相应的荧光染料缀合的第二抗体。用所述稀释的第二抗体重悬浮细胞并于4°C孵育30分钟。根据制造商说明书以最佳稀释度稀释第二抗体，并且此孵育必须在黑暗中完成。用FB重悬浮细胞并以300g离心5分钟，弃去上清液。用0.5mlFB重悬浮细胞并在流式细胞仪上分析。[0133]对于荧光染料缀合的第一抗体：根据制造商说明书用FB稀释所述荧光染料缀合的第一抗体。用所述缀合的第一抗体重悬浮细胞并于4°C在黑暗中孵育15min。将细胞以300g离心5分钟并弃去上清液。用FB重悬浮细胞并以300g离心5分钟，弃去上清液。用0.5mlFB重悬浮细胞并在流式细胞仪上分析。[0134]人PSC源星形胶质细胞的基因表达：用于RNA提取的样品：RNA样品提取自不同发育阶段的hPSC源星形胶质细胞；第0天=在EGF和bFGF存在下生长的hPSC源星形胶质细胞第7-14天=在不存在EGF和bFGF的情况下生长7-14天的hPSC源星形胶质细胞第14-28天=在不存在EGF和bFGF的情况下生长14-28天的hPSC源星形胶质细胞第28-42天=在不存在EGF和bFGF的情况下生长28-42天的hPSC源星形胶质细胞第42-56天=在不存在EGF和bFGF的情况下生长42-56天的hPSC源星形胶质细胞从hPSC源星形胶质细胞中提取RNA:向所述细胞样品（1*1〇6_1〇*1〇6个细胞）中加入〇.05%胰蛋白酶（Invitrogen#25200-056)。将细胞于37°C孵育5分钟。通过加入2体积的2mg/mlBSA(Sigma)将胰蛋白酶灭活。将细胞以300rpm离心并去除上清液。用lml的RLT(Qiangen)和10yLbeta-疏基乙醇重悬浮沉淀，并储存于-80°C。[0135]实时RT-PCR试剂和仪器TaqMan?基因表达测定探针：-A2B5(ABI，Lifetechnologies)-GFAPHs00909236(lifetechnologies)-BDNF(ABI，Lifetechnologies)-PDGFRHs00998018(lifetechnologies)-GLAST(ABI,Lifetechnologies)-GDNF(ABI，Lifetechnologies)-ALDH1L1Hs00201836(lifetechnologies)-TRA-1-60(ABI,Lifetechnologies)-NanogHs04260366(lifetechnologies)-〇ct4(ABI,Lifetechnologies)-GlulHs00365928(lifetechnologies)-IGF-1(ABI,Lifetechnologies)-NGF(ABI,Lifetechnologies)-Aqua4(ABI,Lifetechnologies)-间隙连接蛋白3〇(ABI，Lifetechnologies)-CD44(ABI,Lifetechnologies).人总RNA(Ambion)。[0136].人胎儿RNA(Clontech)。[0137].TaqManPCR预混液，50ml(AppliedBiosystems)。[0138].FastOptical96孔反应板（AppliedBiosystems)。[0139].用于RT-PCR的T-Professional基础梯度仪（Biometra)〇[0140].高容量cDNA反转录试剂盒(200次反应）（AppliedBiosystems)。[0141].StepOnePlus实时PCR系统（AppliedBiosystems)。[0142]反转录使用高容量cDNA反转录试剂盒(AppliedBiosystems)和T-Professional基础梯度仪进行反转录。下列程序是基于Invitrogen的方案。[0143]在各管中制备下列RNA/引物混合物：RT缓冲液2μL总RNA1ygRT随机引物1μLRNA酶抑制剂1μL反转录酶1μL100mMdNTP混合物0.8μLDEPCΗ20至10μL将自动热循环仪编程为：1.25Γ10min2.37°C120min3.85〇C5min4.4°C暂停将cDNA储存于-20°C直至用于实时PCR。[0144]实时PCR在光学板的各孔中制备下列混合物(对于10μL反应混合物）。[0145]5μLTaqManMix0.5μL探针+引物0.5μLcDNA4μLΗ20使用成人胎脑RNA作为内参，分析通过qPCR对各个基因获得的数据。[0146]hPSC源星形胶质细胞神经营养因子分泌测定Elisa方案：使用的市购试剂盒：_m)NF(promega#G7610)-GDNF(promega#G7620)-IGF-1(R&DSystems#DG100)-VEGF(R&DSystems#DVE00)-NGF(promega#G7630)使hPSC源星形胶质细胞在不存在生长因子(EGF+bFGF)的情况下生长至少20天。在最后一次培养基补充之后收集hPSC源星形胶质细胞上层培养基(条件培养基)和/或细胞内容物(24h-72h)〇[0147]根据制造商方案说明书对各因子进行Elisa。[0148]谷氨酸盐摄取方案：市购试剂盒使用EnzyChrom谷氨酸测定试剂盒(BioassaySystems#EGLT-100)。[0149]使用的细胞培养物样品：至少20天的去除生长因子(EGF+bFGF)的hPSC源星形胶质细胞，阳性对照-人星形胶质细胞(Gibco)，阴性对照-人成纤维细胞。向各实验孔中加入谷氨酸盐(〇.5-3mM)。[0150]在以下时间点从测试细胞中取出至少0.5ml的培养基样品：T=0'、10'、30'、60'、90'、120'并将其储存于4°C直至进一步处理。根据制造商方案(BioassaySystems#EGLT-100)进行谷氨酸盐摄取。[0151]用于移植的人星形胶质细胞：如上所述（"用于测定的星形胶质细胞的产生"）进行步骤1-8来产生人星形胶质细胞。对于移植，通过去除生长因子使人星形胶质细胞前体细胞分化。将两个细胞群体用于所述实验:一个为在不含生长因子的情况下生长7天的细胞群体（"第7天"），另一个为生长42天的细胞群体（"第42天"）。以2.85X105个细胞/yL的浓度用DMEM/F12重悬浮"第7天"和"第42天"的人星形胶质细胞。[0152]细胞移植实验设计测试了5个移植实验组。在组#1中，使用"第42天"分化的人星形胶质细胞对67±2日龄S0D1G93M、鼠进行移植(n=10只S0D1G93M、鼠）。组#2,使用"第7天"分化的人星形胶质细胞对67±2日龄SOD1G93M、鼠进行移植（n=12只SOD1G93M、鼠）。组#3，在67±2日龄SOD1G93M、鼠和第97±2天的SOD1G93M、鼠上进行两次"第7天"细胞注射(n=13)。组#4仅用溶媒(DMEM/F12假注射组)对67±2日龄S0D1G93M、鼠进行注射(n=10)以及组#5不接收任何处理(未处理组，n=4)。从移植之前3天开始直至实验结束，经由每天I.P.注射10mg/Kg环孢霉素（Sandimmun，Novartis)使小鼠免疫抑制，此外，从移植之前3天开始直至移植后第7天，每天两次给予15mg/kgCellCept(Roche)(经由O.S(perO.S))。[0153]人星形胶质细胞移植免疫抑制的动物在第67±2天(所有组)和第97±2天(组#3)接受移植。将7μ1的培养基或总体积7μ1的2.0X106个细胞通过小脑延髓池鞘内注射。使用附有30号45°斜角针头的HamiltonGastight注射器（10yL)(Hamilton;Reno，NV)递送细胞。完成移植阶段之后，使用Nucleocounter评价细胞生存力并发现其大于85%。[0154]S0D1G93M、鼠使用携带具有G93A突变的人S0D1基因的转基因小鼠（B6SJL-Tg(S0Dl*G93A)lGur/J)。将雄性和雌性小鼠均勾分布在实验组之间。小鼠获自Jackson实验室(BarHarbor，ME)，并维持为内部群体。[0155]动物的护理和处理所有程序均严格按照以色列指导方针进行;采取措施以使任何可能的痛苦或动物不适最小化。将小鼠圈养在标准温度(2ΓΟ下和控制光照的环境中，任意取用食物和水，并维持在位于相同房间的通风笼子的架子中。为了避免脱水，当动物开始显示疾病症状时，提供通往笼子水盆的途径。[0156]行为和运动性能分析前肢抓力在移植前一周开始动物称重和所有行为数据收集，并每周进行两次直至末期。使用"抓力计"单独测定前肢肌肉抓力。通过使动物抓住连接至测力计的细杆来进行抓力测试。在此之后将所述动物拉离所述测力计直至后肢或前肢放开所述杠。这提供最大抓力的力值。在三个独立试验中记录力的测量结果，并将平均值用于分析。[0157]转棒性能测试每周两次进行运动功能。使用加速转棒装置（180秒，转棒7650;UgoBasile，Comerio，Italy)测试运动功能。记录小鼠脱离(failfrom)转棒的时间。在记录之前将动物训练一周。在植入之前一周开始记录。[0158]BBB-临床评分根据下表，以0-5的等级评分。当临床现象介于两个规定得分之间时，可对小鼠给出"中间"得分（即〇.5、1.5、2.5、3.5)。[0159]以等级0-5进行评分：当临床现象介于两个规定得分之间时，对小鼠给出"中间"得分（即〇.5、1.5、2.5、3.5)。在大部分笼中，小鼠达到3.5-4的临床得分，并且其临床体征从该点之后恶化。[0160]体重每周两次测量体重。[0161]存活/末期和发作分析为了以可靠且伦理的方式确定疾病末期，通过以下来确定末期：当使其侧卧时，小鼠不能在30秒内将自身扶正。[0162]通过小于160秒的转棒性能上的下降来确定疾病发作。[0163]统计分析使用统计学软件Sigmastat(SASSoftware)进行所述S0D1G93M、鼠的Kaplan-Meier分析，以分析存活、疾病发作和持续期数据。通过重复测量ANOVA分析WeightRotarod、BBB和抓力结果。在一些情况下，进行Student?检發以在动物组之间比较数据。所有数据作为平均数土S.E.M.显示，并将显著水平设置为ρ<0.05。[0164]组织学和生化分析组织处理通过心脏灌注(transcardialperfusion)0.3%盐水接着冰冷的4%多聚甲醛(FisherScientific;Pittsburgh，PA)在末期处死动物。从所述动物中移出脊髓，接着用30%鹿糖(Fisher)/1Μ磷酸盐缓冲液于4°C低温保护3天。将所述组织包埋到OCT(Fisher)中，用干冰快速冷冻并储存于_80°C直至处理。以30μπι厚度以矢状面或横断面切割脊髓组织块。将切片采集到载玻片上并储存于_20°C直至分析。将脊髓切片的子集收集在PBS中用于自由漂浮组织化学（freefloatinghistochemistry)。[0165]移植物存活和迀移的定量使用他嫩（人核抗原;1;111丨。(^6;161116〇1113,04;单克隆；1:400)选择性鉴定移植物来源的人细胞(hGRP和hF二者）。[0166]实施例1人多能干细胞(PSC)源星形胶质细胞的体外产生和表征通过以下对各星形胶质细胞系在体外测试人星形胶质细胞前体细胞(APC)向成熟星形胶质细胞的分化：ALDH1L1。图1显示hESC源星形胶质细胞的星形胶质细胞系基因表达的动力学。为了促进星形胶质细胞前体细胞向成熟表型分化，从培养基中去除生长因子。在第〇天(含生长因子）以及在去除生长因子之后每两周收集样品并检测。将人胎脑用作所有测试基因的内参样品(相对定量(RQ)=1)，并且与成人脑一起用作阳性对照。重点注意的是，成人脑由多于50%星形胶质细胞组成。在本研究中，在细胞分化时在所有测试的星形胶质细胞基因中均发现显著增加，以及在许多情况下，星形胶质细胞基因（astrocyticgene)(即GFAP、BDNF、PDGFRa和GLAST)的表达显著高于人胎脑（图1)。这些结果证明，所述方案导致人星形胶质细胞的富化群体。[0167]b.使用早期和晚期神经胶质限制标志物(例如:CD44、CXCR4和GLAST)的荧光激活细胞分选(FACS，流式细胞术)分析。在所示FACS分析中（图2)，测试了诸如CD44和CXCR4等早期星形胶质细胞标志物以及作为晚期星形胶质细胞标志物的GLAST的动力学。CXCR4亦称为融合素或者CD184,为在CNS中具有潜在的趋化活性的趋化因子受体。发现大于95%的所述细胞在第0天至第21天表达CXCR4和⑶44,这些水平在星形胶质细胞成熟时降低。同时，GLAST的水平在星形胶质细胞成熟时增加（图2)XXCR4表达表明所述hESC源星形胶质细胞前体细胞的高迀移潜能，这是所述细胞达到其目的地所需的能力。[0168]c.使用星形胶质细胞特异性抗体的免疫组织化学（IHC):GFAP、GLAST、S100l^PA通道蛋白4。通过我们的ScanArray高容量筛选装置(HCS)定量染色。在图3上，在体外分化的第50天将hPSC源星形胶质细胞染色。如可在图片中看到，大部分的所述细胞对于星形胶质细胞特异性标志物(GFAP、GLAST和AQP4)为阳性的。[0169]实施例2测试所述hPSC源星形胶质细胞的生物学功能性进行数个实验以证明hPSC源人星形胶质细胞表现出成熟健康的星形胶质细胞的功能特性。这些体外结果阐明了可能的体内作用机制。对于所述目的，测试了下列功能机制：a.神经营养因子(NTF)分泌：对星形胶质细胞上层培养基和去垢剂提取物进行针对BDNF、GDNF和VEGF的Elisa。使用了诸如IFN-γ和LPS等不同的星形胶质细胞激活物。图4证实在激活hPSC源星形胶质细胞时，GDNF、BDNF和VEGF分泌到培养基中（图4，分别为中间的柱)。[0170]b.谷氨酸盐摄取:通过测量星形胶质细胞上层培养基中的谷氨酸盐水平来测试星形胶质细胞谷氨酸盐摄取能力。使用比色测定(Enzychrom)以便测量培养基中的谷氨酸盐水平。使用成纤维细胞作为阴性对照，同时将来自成人组织的星形胶质细胞用作阳性对照。数据显示通过人PSC源星形胶质细胞的谷氨酸盐摄取（图5)。在本研究中，在下列时间点测试了两个谷氨酸盐浓度(〇.5mM和2mM)的谷氨酸盐摄取的动力学:添加谷氨酸盐之后的0'、10'、30'、60'、90'和120'。发现的是，所述hPSC源星形胶质细胞以时间依赖性方式从两种浓度的培养基中摄取谷氨酸盐。这表明所述星形胶质细胞的具体样品摄取谷氨酸盐的能力。[0171]c.丽神经保护测定:在此测定中，使用过氧化氢(H2〇2)激发小鼠或人来源的丽。在诱导氧化应激之后测试加入hPSC源星形胶质细胞条件培养基和/或星形胶质细胞对MN存活的作用。通过使用高容量筛选装置(Ce11omics-ScanArray)评价活/死MN的数量。此测定可用作寻找影响ALS疾病中的匪存活的新药的有价值工具。所述数据显示了来自hPSC源星形胶质细胞组织培养物的调节的培养基对处于氧化应激(使用H2〇2)下的啮齿类动物脊髓MN的神经保护作用。如在图6中所示，测试了来自hPSC源星形胶质细胞的条件培养基对小鼠MN培养物的保护作用以及直接向小鼠MN培养物中添加hPSC源星形胶质细胞的作用。以两个H2〇2浓度(50μΜ和150μΜ)。在两个H2〇2浓度下添加hPSC源星形胶质细胞调节的培养基之后，均发现在MN死亡上的显著减少。惊人的是，向处于氧化应激下的MN培养物中加入hPSC源星形胶质细胞的神经保护作用甚至大于添加其调节的培养基（图6)，表明与仅有其分泌物相比，其存在在降低氧化应激上更显著。这些结果进一步证实我们的hPSC源星形胶质细胞的体外神经保护能力。所述hPSC源星形胶质细胞方案得到高纯度的人星形胶质细胞。所述人星形胶质细胞在体外显示功能性星形胶质细胞特性，例如分泌神经营养因子和谷氨酸盐摄取，已知增加运动神经元存活的特性。使用体外模型直接验证hPSC源星形胶质细胞在保护氧化应激下的运动神经元的潜能。此测定为寻找在体内增加人星形胶质细胞神经保护潜能的药物的有价值工具。[0172]实施例3寻找用于移植hPSC源星形胶质细胞的最佳条件在对S0D1动物进行实验之前，进行对于不同移植方面的优化实验。[0173]a.优化细胞注射方法i.测试了不同的移植部位(即直接注射到脊髓腹角中、鞘内注射或脑室内注射）。[0174]ii.测试了hPSC源星形胶质细胞的数量(每次注射/每个部位）。[0175]b.进行用于测量神经元损伤和检测植入细胞的评价组织学方法，其用于优化大规模功效研究。[0176]c.评价用于跟进所述疾病的行为测试和电生理测试的功效。[0177]d.使用免疫组织化学测试在移植之后hPSC源星形胶质细胞生存;迀移和细胞分化的动力学。[0178]实施例4hPSC源星形胶质细胞移植到ALS动物模型(S0D1小鼠）中在体内测试了hPSC源星形胶质细胞对MN的神经保护作用，即对动物运动改善和存活的作用。对于所述目的，如在材料和方法中所述使用和处理hSODlG93AC57BL6/SJL背景（高拷贝数)小鼠模型。[0179]如在图7中所示，注射早期的人来源的星形胶质细胞增加hSODl小鼠的存活。图8证实与假注射相比"第7天(库(pool))"在BBB转棒性能上的显著改善(P〈0.05)。[0180]如在图9中所示，与假注射组相比，"d7"组显著维持其体重(P〈0.05)。[0181]如在图10中所示，T1/2统计分析揭示在存活上的显著增加，如在"第7天"两个注射组与假注射组相比中观察到的(P=〇.046)。[0182]尽管结合其具体实施方案来阐述本发明，但显然许多备选方案、修改和变动对于本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，意图其包括落入随附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些备选方案、修改和变动。[0183]本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体结合到本说明书中，其引用程度如同具体且单独地指出各单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合到本文中。此外，对本申请中任何参考文献的引用或鉴定，不应理解为承认所述参考文献可用作本发明的先有技术。对于节标题使用的程度，不应将其理解为必要限制。【主权项】1.一种筛选用于预防或治疗肌萎缩侧索硬化(ALS)的剂的方法，所述方法包括：(a)使星形胶质细胞群体与所述剂接触，所述星形胶质细胞离体分化自多能干细胞(PSC)；(b)将所述步骤(a)的星形胶质细胞群体或其调节的培养基与神经元群体共培养;和(c)定量所述剂增强所述神经元群体的存活或神经功能的作用。2.权利要求1的方法，其中所述神经元群体为含氧低的、在氧化应激下的、在谷氨酸盐毒性下的或者在AMPA/红藻氨酸盐毒性下的。3.权利要求1的方法，其中在步骤(b)中，所述星形胶质细胞与神经元的群体比率为大于1:1、10:1、100:1、1000:1或10,000:1。4.权利要求1的方法，其中所述星形胶质细胞表达GFAP、GLAST、AQP4的每一个或其组合。5.权利要求1的方法，其中所述星形胶质细胞显示分泌神经营养因子，其选自BDNF、⑶NF和VEGF。6.权利要求1的方法，其中所述氧化应激选自活性氧簇(ROS)、H2〇2及其任何衍生物。7.权利要求1的方法，其中所述定量通过计数处于凋亡下的神经元数量来进行。8.权利要求7的方法，其中所述凋亡通过半胱天冬酶-3a标记、膜联蛋白V、微管蛋白-B3、HB9或DAPI来检测。9.权利要求1的方法，其中所述剂为小分子。10.-种用于在有需要的受试者中治疗或预防ALS进展的方法;所述方法包括将治疗上有效量的人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞的细胞群体给予有需要的受试者，所述人祖星形胶质细胞和人星形胶质细胞离体分化自多能干细胞(PSC)。11.权利要求10的方法，其中所述祖星形胶质细胞或星形胶质细胞表达GFAP、GLAST、AQP4的每一个或其组合。12.权利要求10的方法，其中所述祖星形胶质细胞或星形胶质细胞显示分泌神经营养因子，其选自BDNF、GDNF和VEGF。13.权利要求10的方法，其中所述祖星形胶质细胞或星形胶质细胞显示谷氨酸盐摄取能力。14.权利要求10的方法，其中所述给予涉及有需要的受试者的脑脊液、脑或脊髓。15.权利要求10的方法，其中所述人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞对于所述受试者而言为非自体同源的。16.权利要求10的方法，其中所述人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞对于所述受试者而言为同种异体的。17.权利要求10的方法，其中所述人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞为未经遗传修饰的细胞。18.人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞的细胞群体用于制备经鉴定用于治疗ALS的药剂的用途，所述人祖星形胶质细胞或星形胶质细胞离体分化自多能干细胞(PSC)。【文档编号】G01N33/50GK105960453SQ201480054641【公开日】2016年9月21日【申请日】2014年9月23日【发明人】M.伊兹拉伊,M.雷维,A.哈斯森,K.莫拉坎多夫,J.彻巴斯【申请人】卡迪马干细胞有限公司