用于精子分选的系统和方法

用于精子分选的系统和方法
【专利摘要】本发明提供用于分选精子的系统和方法。所述系统包括壳体和由壳体支撑的微流体系统。所述系统还包括入口和出口，所述入口提供通往微流体系统的路径以将精子输送至微流体系统，所述出口提供通往微流体系统的路径以从微流体系统收集被分选的精子。所述微流体系统提供精子从入口到出口的流通通路，且包括至少一个从入口延伸至出口的通道，以使通过入口被输送至微流体系统的精子沿着流通通路向出口流动。所述微流体系统还包括过滤器，所述过滤器包含第一多微孔且设置在入口和出口之间的流通通路中，以使沿着流通通路转移的精子移动穿过过滤器并克服重力以到达出口。
【专利说明】用于精子分选的系统和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本发明基于2013年11月20日提交且标题为"SYSTEM AND METHOD FOR SPERM S0RTING(用于精子分选的系统和方法)"的美国临时申请号61/906，740并要求其优先权，其 通过引用全文纳入本文用于所有目的。
[0003] 关于联邦资助研究/开发的声明
[0004] 不适用
[0005] 发明背景
[0006] 本发明一般涉及用于精子分选的系统和方法。
[0007] 根据估计，全世界有7000万以上的不孕夫妇。每4对不孕夫妇中大约有1对寻求临 床治疗，其中，根据数据来源，不孕病例中大约50%可能是由男性因素导致的。在生殖临床 上通常采用辅助生育技术(ARTs)来治疗不孕夫妇，所述辅助生育技术例如有体外受精 (IVF)、卵细胞胞浆内单精子注射(ICSI)和宫腔内人工授精（IUI)。随着由环境和生理环境 导致的男性不育的概率的增加，在生殖临床上存在不断增长的使用ARTs的需求。对最具活 动力且形态正常的精子进行分离是常用的IVF/ICSI方法的不可或缺的步骤。从未经处理的 精液(储备精子）中选择健康的精子是重要的，原因在于其需要选择的精子不仅是高度活动 的，而且具有正常形态，成熟的核，并具有较少的反应性氧物质（R0S)产生。尽管目前IVF/ ICSI操作带来大约50%的成功受孕，但是如果选择的精子异常，则结果可受到显著的损害。
[0008] 目前，更广为人知的ART技术采用基于离心的精子上游（swim-up)、密度梯度分离 方法，以及基于微流体的方法，使用/不使用化学趋向性来分选精子。这些技术在如同IVF/ ICSI那样精密的方法的使用中时存在潜在的缺陷和限制。值得注意的是基于离心的精子分 选技术(例如上游），在重复的离心步骤中会牺牲精子质量。精子样品质量在上游技术过程 中会由于R0S的产生而下降。暴露于R0S能极大地损害看似活动且健康的精子的DNA。进一 步，基于离心的精子分选技术是劳动密集型的，且结果会随着技术员的变化而变化。
[0009] 基于微流体的精子分选技术具有优点，因为其能够精确地对小体积的精子样品进 行操作。另一方面，基于微流体的精子分选装置具有极低的处理量，且仅能处理少量的精液 (例如2μ1-50μ1)，这限制了它们在生殖临床上的应用，其中正常精子样品的体积可为1.5ml 以上。
[0010] 在临床ICSI操作中，胚胎学家平均需要20个卵母细胞，能够在四个皮氏培养皿进 行操作，且需要20个精子。胚胎学家希望在少精子症样品中从数百个精子中选择这20个精 子。这种情形下会需要对单个精子进行即时监控，并在20个精子到达出口时从出口对精子 进行收集，这在使用现有临床或微流体技术时是无法实现的。在第二种操作中，胚胎学家操 作健康的样品，使用悬浮在5_20μ1悬液中的将会导入卵母细胞的50万个健康的精子实施体 外受精。然而，如上所述的现有分选系统不能提供满足这些标准所需的处理量。
[0011] 以往，使用光学显微镜对精子进行成像以用于计算机辅助精子分析(CASA)和用于 ARTs的精子活动力的人工鉴定。该传统的方法由于其视野(field of view，F0V)小而在同 时追踪大量精子的情况中存在限制。另外，精子追踪和活动力分析在分选之后实施。目前不 存在能够同时分选和分析精子的系统。
[0012] 因此需要提供用于处理(包括例如分选)精子的系统和方法，所述系统和方法不损 伤精子或将精子置于潜在损伤环境。进一步，需要提供能够分析精子但是高效且能够规模 化(scale)的系统和方法。

【发明内容】

[0013] 本发明通过提供系统和方法来克服上述的缺陷，所述系统和方法整合微流体和宏 流体(macro-fluidics)，以高效选择有利地适合受精的精子的方式对精子进行分选。具体 而言，本发明认识到最需要的是适于受精的精子，且能够使用本发明的系统以及与受精过 程中相似的环境来对所述精子进行选择和分选。对此，提供一种系统，其中大型贮藏室通过 微孔连接以模拟女性生殖道。提供一种系统和方法，从而最具活动力、形态正常、成熟和功 能性的精子克服重力选择性地穿过微孔，留下死亡或功能性较弱的精子。本发明是无化学 品、不使用离心和液流的技术，其中以高回收率从未经处理的精液样品中分离功能性精子。
[0014] 根据本发明的一个方面，提供用于分选精子的系统，所述系统包括壳体以及由壳 体支撑的微流体系统。所述系统还包括入口和出口，所述入口在微流体系统中提供路径以 将精子输送至微流体系统，所述出口提供通往微流体系统的路径以从微流体系统收集被分 选的精子。所述微流体系统提供精子从入口到出口的流通通路，且包括至少一个从入口延 伸至出口的通道，以使通过入口被输送至微流体系统的精子沿着流通通路向出口流动。所 述微流体系统还包括过滤器，所述过滤器包含多个微孔，且设置在入口和出口之间的流通 通路中，以使沿着流通通路运行的精子移动穿过过滤器并克服重力而到达出口。
[0015] 根据本发明的另一个方面，公开了用于分选精子的方法，所述方法包括:将精子样 品输送至与微流体系统连接的入口；使精子样品中的精子沿流通通路运行穿过微流体系统 朝向出口，所述出口提供通往微流体系统的路径以从微流体系统收集被分选的精子。所述 方法还包括:在到达出口之前利用具有多个微孔的过滤器以及重力对精子进行过滤，以限 制精子移动穿过所述过滤器。所述方法进一步包括：穿过所述过滤器并克服重力之后对运 行至所述出口的精子进行收集。
[0016] 通过以下描述可以清楚地了解本发明的上述和其他方面和优势。在以下说明书 中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示了本发明的优选实施方式。这 类实施方式不必然代表本发明的全部范围，而是因此对权利要求进行说明并在本文中解释 本发明的范围。
[0017] 附图的简要说明
[0018] 图1A是根据本发明的精子分选系统的俯视图。
[0019] 图1B是图1A所示系统的截面视图。
[0020] 图1C是具有收集腔室以浓缩被分选的精子的多通道系统的示意图。
[0021] 图1D是具有收集/浓缩腔室以及与入口连接的多通道的多空腔系统的示意图。 [0022]图2A是根据本发明的精子分选和成像系统的剖视截面视图。
[0023]图2B是图1A或2A所示微流体系统的详细透视图。
[0024]图2C是根据本发明的多通道微流体系统的示意图。
[0025]图2D是根据本发明的精子分选和成像系统的系统整体的截面视图。
[0026] 图3是根据本发明的用于精子分选的原型系统的透视图。
[0027] 图4是使用本发明而获得的一系列精子的图像。
[0028] 图5A是说明使用不同孔径的过滤器并在不同时间点回收的人类精子的活性的图。
[0029] 图5B是说明使用不同芯片的被分选精子的回收率的图。
[0030] 图6A、6B和6C分别是说明使用3、5和8μπι的丽SS芯片的储备精子和分选精子的曲线 速度(VCL)、直线速度(VSL)和平均通路速度(VAP)的图。
[0031] 图7是显示储备精子和分选精子的正常形态（％ )的图。
[0032] 图8是显示计算出的储备精子和分选精子的成熟精子百分比的图。
[0033]图9Α是显示使用3、5和8μπι过滤器装置分选的精子的图，其与上游方法和洗涤方法 比较，呈现了显著更少的R0S产生。
[0034]图9B-9G是反应性氧物质(R0S)产生的图，其中分别如下：（Β)精液样品，（C)洗涤过 的精子、（D)使用上游方法分选的精子(R0S区域用圆标出）、（Ε)使用3μπι的MMSS芯片分选的 精子、（F)使用5μπι的丽SS芯片分选的精子，以及(G)使用8μπι的丽SS芯片分选的精子。
[0035]图10Α是显示使用5和8μπι的MMSS芯片分选的精子的图，其与上游和未分选的精液 样品相比，呈现了显著更少的DNA片段化。
[0036] 图10B-10F是DNA片段化散点图，其中分别如下：（Β)精液样品，（C)使用上游方法分 选的精子、（D)使用3μπι的丽SS芯片分选的精子、（Ε)使用5μπι的丽SS芯片分选的精子，以及 (F)使用8μπι的MMSS芯片分选的精子。
[0037] 图11是列出了根据本发明的一些步骤的一个示例的流程图。
[0038] 发明详述
[0039] 本发明认识到，阴道粘液变为水状并形成微小的微通道，所述微通道帮助将精子 引导至卵子。本发明认识到排空是分选精子的机理，并使用粗粒度多尺度模拟已从实验上 和理论上说明了利用排空来对健康的精子进行分选。具体地，本发明提供宏-微流体精子分 选(MMSS)系统以高效、可靠并成功地对精子进行分选。如所要阐述的，健康的活动精子在分 选后于出口被完整收集。该系统以最小的干扰提高精子选择过程的效率，从而抑制DNA片段 化、碎片的累积以及R0S的产生。
[0040] 另外，本发明可同时分选、监控和评价精子。特别地，本发明的系统能够独立地评 价各个精子，例如，基于速度响应，使用宽视野(F0V)无透镜成像技术。所述系统提供利用阴 影成像的基于微芯片的宽-F0V的无透镜技术。另外，本发明能够用于收集形态度量学信息， 它是男性能育性的可靠指标。
[0041] 参照图1A说明了精子分选系统10。系统10可基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、基于聚 甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或其它微流体系统。系统10包括壳体12和收集腔室16,所述壳体具 有入口 14,所述收集腔室中设置有过滤器18。过滤器18可以是聚碳酸酯过滤器或其他具有 合适材料性质的过滤器，所述性质例如有将要描述的孔或通道尺寸。根据图1B，入口 14和收 集腔室16通过沿着微流体芯片22延伸的通道或流通通路20被连接。如将要描述的，微流体 芯片22可包括微芯片，所述微芯片可以是一次性的并操作未经处理的精液样品（新鲜或冷 冻的，处理过的或未处理的），例如l〇yl-3ml的精液样品，并且快速分选精子(例如少于30分 钟)而不需要复杂的仪器或受过培训的操作人员。
[0042]流通通路20从入口 14延伸至收集腔室16。在收集腔室16中，第一或底部腔室24位 于靠近微流体芯片22的位置，第二或顶部腔室26在第一或底部腔室24上方，位于微流体芯 片22的远端位置。如上所述，设计第一腔室24以收集入口 14处的样品精液(新鲜或冷冻的， 处理的或未处理的），设计第二腔室26以过滤活动精子。
[0043]参照图1C，可对上述图1B的系统进行修改，以包括额外的收集或"浓缩"腔室25,所 述腔室25通过流体连接件27与顶部腔室连接。即，在这种情况下，可在收集腔室25中对精子 进行浓缩，以更容易地收集精子。
[0044]在另一种配置中，如图1D所示，收集腔室25可与多个通道28连通，所述通道各自具 有与浓缩腔室25相对的入口 29。这种情况下，来自图1C中多个流通通路20或来自多个收集 腔室16的精子可被输送至公用的浓缩腔室25。上述设计中的这种变化可有助于使用多个过 滤器和多个通道，以操作更大体积或更高处理量的应用。
[0045] 参照图2A，说明了系统10的一种选择性配置的剖视图，所述系统10包括整合的成 像系统。所述成像系统可形成无透镜的宽视野成像平台。在该视角中，整合的成像系统的组 件，例如光源30、成像传感器31、玻璃保护层32与上述系统10结合。在运行过程中，光源30照 亮精子34,所述精子通过入口 14导入微流体芯片22。被照亮的精子34可通过成像传感器31 进行成像，所述成像传感器可以是电荷耦合装置(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)或其 他成像装置。更具体而言，根据图2,在运行过程中，可使用例如移液管36将精子和精液34导 入出口 14。精子沿着微流体芯片22穿过介质38,所述微流体芯片可包括前述的玻璃32和 PMMA或其他材料层40,以及设置在两者之间的双面粘性(DSA)层42,以将玻璃32和PMMA层40 粘附在一起。最终，精子34穿过微流体芯片22到达出口 16,其中可发现矿物油44。具体而言， 可将一层薄的无菌、胚胎测试过的矿物油置于入口 14和出口 16中的介质38的顶部，以避免 介质的蒸发。
[0046] 如所述，可使用或选择不同的通道长度以有效地分选精子。进一步，根据图2C，可 采用多通道设计，其中入口 14和收集腔室16通过多通道46连接。如所述，可包括PBS收集缓 冲液48，以用于例如洗涤。进一步，容纳通道的芯片基板可以是一次性的。
[0047]根据图2A和2B，如果包括无透镜成像，则其可用于将各个单独精子34的阴影图像 记录在光电传感器阵列板31上。该系统10的目的为检测/计数细胞，或以超宽F0V实时监控 芯片上成百上千个单独细胞的动态位置，所述超宽F0V例如是宽度为数厘米的F0V。该技术 提供复杂程度降低和易于微型化的这些特性。
[0048]具有成像能力的系统10的一个具体示例在图2D中进行说明。标准显微镜无法监控 整个微流体分选芯片并实时分析精子。可通过整合无透镜成像技术来解决该挑战，其中使 用微通道提供并行的芯片上的监控和精子计数。所述设计使得该技术能够微型化，从而使 其合适用于胚胎学/临床实验室和定点看护(p〇int-〇f-care)装置。
[0049]图2D示例中的系统10包括光源30，其通过孔隙50 (例如50μπι的孔隙）照入壳体12， 以向微流体芯片22聚集单色光52，如上所述，精子34穿过所述微流体芯片22。系统10可与计 算机系统54、可充电电池或其他电源58耦联，所述系统10与所述计算机系统54通过数据连 接56连接，所述数据连接可以是有线或无线的，所述系统10与可充电电池或其他电源58通 过电源连接60连接，以向成像功能提供可操作的功率。
[0050] 在一种配置中，采用厚度为1.5mm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和厚度为50μπι的双 面粘性(DSA)膜的组合产生微通道。可使用激光切割器将DSA膜切断以产生不同长度的微通 道，长度范围为5mm-40mm。入口和出口的端口延伸穿过PMMA，直径分别为Ο · 65mm和2mm。然后 直接将DSA膜置于PMMA上，以将两者有效结合。将玻璃载片置于DSA膜的另一面，从而通道的 高度取决于粘性层的厚度。特别设计更大的出口尺寸是为了能够容易地用移液管将分选的 精子从通道容易地抽取而出。通道的长度取决于入口和出口之间的距离。通道的长度定义 为入口和出口之间的距离。
[0051]为了增加出口处的活动细胞和用于高容量处理的细胞的百分比，可将聚碳酸酯过 滤器整合入这些微芯片。该基于过滤器的装置可通过下述方式进行设计:使用3mm厚的PMMA 并切成50mm X 30mm的面积大小，将另一个切成30mm X 30mm的面积大小。直径20mm的圆柱可 被切成这两种PMMA组件，并可使用150μηι的DSA相互之间纵向对齐。在1 Omm的距离处，0.6mm 的精液注射入口也被切为更大的装置组件。可使用位于两个PMMA组件之间的沃特曼核孔 (whatman nucleopore)过滤器组装该系统。
[0052]参照图1A-2D，系统10能够用于大规模的精液处理。照此，通过入口 14将精子34导 入，之后将置于微流体芯片22中。在该移动过程中，可使用光源30和成像传感器31对精子34 进行成像。精子34朝向出口 16移动。该出口 /收集腔室具有两个腔室24和26。第一腔室24包 括一个具有微孔的过滤器，第二腔室26包括另一个具有微孔的过滤器。对此，系统10具有大 型贮藏室14和16，它们通过微孔连接以模拟女性生殖道。其中，精子34之间产生自然的相互 影响，整体沿着介质38向出口 16移动。最具活动力、形态正常、成熟和功能性的精子克服重 力选择性地穿过微孔，在第一腔室24中留下死亡或功能性较弱的精子。即，精子头部是球形 的且尺寸约为3μπι χ4.5μπι。精子尾部长度约为45-50μπι。如果微孔直径大于精子头部的过滤 器位于第一腔室24和第二腔室26,则仅有活动的精子可穿过微孔，但是死亡的、垂死的或损 伤的精子由于它们长的尾部而不能穿过微孔。这些死亡、垂死和/或损伤的精子受制于重力 并停留在第一腔室24中。
[0053]从而，提供基于微芯片的系统，将其设计成不需要任何离心步骤而回收健康、活动 的且形态正常的精子的形式，且具有最少的R0S产生。该装置设计使得精子分选步骤更为廉 价且不再劳动力密集。该系统组合利用了空间受限的通道中的排空作为精子分选的机理。 该系统可将活动且形态正常的精子分离而不需要任何离心步骤。从而，精子活动力的现有 粗粒度模型用于在三个维度上模拟基于过滤器的微流体装置，带来如下效果:其协同产生 自精子、通道壁、以及过滤器表面和孔洞之间的流体动力学相互作用。该模型允许使得能够 设计装置参数，例如微孔尺寸和培养时间。
[0054] 上述系统的设计和操作可进一步根据下述的对系统的示例、这种系统的配置以及 这种系统的测试结果的讨论来进行理解。这仅仅是一种示例，且在本质上不限制可采用的 以及落入本发明范围的多种配置、设计以及操作。 实施例
[0055] MMSS芯片的组装
[0056]使用激光切割器（亚利桑那州斯科茨代尔的维萨激*TM( Versa Laser?， Scottsdale，AZ))将聚甲基丙稀酸甲酯（PMMA，3mm厚；佐治亚州亚特兰大的MMC公司 (McMaster Carr，At lanta，GA))和双面粘附剂（DSA，120μηι厚，明尼苏达州圣保罗市 (St.Paul，ΜΝ))切割。芯片的设计在Coral Draw4上进行，在USLE Engrave软件上实施以进 行切割。MMSS芯片的主要组件包括一个3mm的面积为50mm x30mm的PMMA切片(底部腔室）和 另一个面积为30mm x30mm的切片（顶部腔室）。距离腔室5mm处，还在底部PMMA片材上切出 0.6mm的注射点。直径20mm的圆柱被切割成两个PMMA组件。首先使用DSA将底部PMMA腔室结 合在玻璃载片上。使用DSA将顶部PMMA腔室与底部腔室对齐并结合。在芯片组装过程中，将 核孔?"(Nuclepore?)径迹蚀刻聚碳酸酯膜过滤器(沃特曼公司(Whatman Ltd)，25mm直径，3 μηι，5μηι，8μηι)夹入两个PMMA腔室之间。从而，认为Ιμπι以上且低于ΙΟμηι可以是有利的孔径范 围。组装芯片的透视图示于图3。
[0057]使用MMSS芯片进行精子分选
[0058]将解冻的、未经处理的精液样品（储备精子)注射入MMSS芯片的入口，直至其充满 第一 /底部腔室。将第一 /底部腔室设计成能够容纳560μ1精液样品的形式。试验的另一组 中，注射入MMSS芯片中之前，在人类输卵管液(HTF)中使用1%牛血清白蛋白（BSA)将储备精 液样品稀释4倍。注射之后，第一 /上部腔室被560μ1的1 % BSA (HTF中）充满。然后在保温箱中 以37 °C将芯片保存15、30、45和60分钟，之后将顶部腔室中的流体收集在艾本德 (eppendorph)管中用于分析。
[0059]浓度和活动力分析
[0060] 使用光学显微镜和标准Makler血细胞计数器分析精子样品的浓度和活动力。简而 言之，将?μL的精子样品移取至Makler血细胞计数器，并使用血细胞计数器的盖罩将其覆 盖。熟悉使用点击计数器方法的人员对精子进行至少三次计数。认为向前移动的精子是具 有活动力的。
[0061] 存活力分析
[0062] 使用UVE/DEAD?精子存活力试剂盒(L-7011，分子探针(MolecularProbes⑧）） 对精子样品的存活力进行分析。使用SYBR 14染料对存活精子进行染色，使用碘化丙啶(PI) 对死亡精子进行染色。根据生产商的规程对样品进行染色。简而言之，首先将SYBR 14染料 加入精子样品，使最终浓度为l〇〇nM。以37°C将样品保存5分钟。为了将死亡精子染色，将PI 染料加入样品，使最终浓度为1〇μΜ，并额外保存5分钟。将精子样品涂抹在玻璃盖玻片上，使 用Zeiss Axio Observer.Ζ1荧光显微镜进行成像。分别对SYBR 14和ΡΙ使用绿色和红色发 射滤光片。
[0063] 速度测量
[0064] 使用用于精子分析的WHO实验室指南所描述的方法对精子样品进行了分析。简而 言之，在30分钟后从MMSS芯片（3μπι，5μπι，8μπι)回收精子。通过如下方式制备了载片：在玻璃 载片上放置6μ1的精子样品，并使用18Χ 18mm的盖片覆盖样品，使样品的厚度为20.7μπι。为 避免样品的干燥，载片是分批制作的，而不是同时制作的。使用光学显微镜以20 X的倍率 (Carl Zeiss)对各个载片进行分析，样品的实时图像被投影在计算机显示器上。使用视频 抓取软件（31^81七，1^(^51^〖11公司），在随机位置对精子样品的运动抓取5秒。使用 Videotojpeg软件以lOOfps的帧率将视频转换为图像序列。将所述图像序列输入ImageJ(国 立卫生研究院（National Institute of Health),http://rsbweb.nih.gov/ij/)用于分 析，使用CASA插件监控精子速度参数，即直线速度(VSL)、曲线速度(VCL)和平均通路速度 (VAP)〇
[0065] 精子形态评价
[0066] 30分钟后，收集从5μπι和8μπι的MMSS芯片中回收的精子悬液。从3μπι的MMSS芯片中回 收的精子未用于分析精子形态，因为精子浓度过低而不能用于形态分析。取i〇yL的精子悬 液并置于清洁和消毒过的显微镜载片上，制备了薄涂片。在空气中将涂片干燥以固定。之后 使用与FertiPro类似的Spermac染色规程对精子进行染色，以进行形态评价。简而言之，在 Spermac固定液中将干燥的涂片浸没至少5分钟，然后使用DI水进行清洗。将染色剂A移取至 载片的一个边缘，使其流过整个涂片。然后将载片置于平坦的表面，使染色剂浸渍1分钟。之 后使用DI水将载片洗涤两次。接着，与染色剂A类似地施用染色剂B，并使之渗透精子1分钟。 然后使用DI水进行一次清洗。最后，将染色剂C移取至涂片上，使其稳定1分钟，然后使用DI 水进行清洗。此时，使用油浸和100X物镜对至少100个精子进行了成像(N(重复次数）=3)。 如果精子落入WHO形态标准(头部:球形头部;顶体覆盖40-70 %的头部面积;头部长度3.7- 4.7μπι;头部宽度2.5-3.2μπι;长宽比1.3-1.8; 2个以下的小液泡;顶体后部区域不应包含任 何液泡。中段：中段无残留细胞质；中段长度应当与头部长度大致相同；无断裂的颈部。主 段:无表明尾部折断的尖锐的角或弯曲；薄于中段，主段长度应当为头部长度的大约10倍）， 则认为精子是形态正常的。
[0067]精子成熟度评价
[0068] 30分钟后，收集从5μπι和8μπι的MMSS芯片中回收的精子悬液。从3μπι的MMSS芯片中回 收的精子未用于核成熟度分析，因为精子浓度过低而不能用于该分析。在Spermac固定液中 将干燥的涂片固定5分钟，然后用DI水清洗。制备了 5 %苯胺蓝(4 %乙酸溶液中）并倾倒在涂 片上。在染色溶液中将涂片浸渍5分钟，然后用DI水清洗。使用油浸100 X物镜对至少100个 精子进行评价(N(重复次数）=3)。头部被染成深蓝色的精子被认定为不成熟的，未被染色 的精子则被认定为成熟的。
[0069] R0S 检测
[0070] 精子清洗:从冷冻保存箱中取出1ml的精液，在37 °C的暖浴中解冻15分钟。通过下 述方式制备了清洗的精液样品：在lml的精液中加入9ml的HTF+1 %BSA介质，以500Xg离心5 分钟并移除上清液，同时将精子微粒留在试管底部。将该步骤重复三次。将HTF介质加入精 子微粒，对样品染色进行R0S研究。
[0071] 上游方法:从冷冻保存箱中取出1ml的精液，在37 °C的暖浴中解冻15分钟。使用9ml 的HTF+1%BSA对精液进行稀释。然后，以500Xg对稀释的精子悬液离心5分钟。之后，移除上 清液并丢弃。通过以500Xg离心样品5分钟的方式再次对剩余的微粒进行清洗。再次移除上 清液并丢弃。最后，沿着离心管的侧壁添加500yL的介质，同时避免破坏微粒。然后将样品置 于保温箱中，用30分钟使活动精子向上游出微粒。将微粒留下，收集了活动精子。将MMSS芯 片保温30分钟，回收精子悬液用于R0S研究。
[0072] 染色以进行R0S检测:使用流式细胞术和两种荧光染料(二氢乙啡啶(DHE)和SYT0X 绿)对R0S产生进行了检查。DHE与超氧阴离子反应并产生两种荧光物质，所述荧光物质与精 子DNA结合并产生红色荧光。同时SYT0X绿指示细胞存活力，当细胞死亡时其产生绿色荧光。 针对该试验，制备了四组对照样品，其均由200yL的回收精子悬液和20yL的过氧化氢混合而 成。随后以37°C的温度保存30分钟。将染料加入样品；阴性对照中不添加染料，在第二样品 中加入5μΜ的DHE，在第三样品中加入50nM的SYT0X绿，第四样品中含有5μΜ的DHE和50nM的 SYT0X。将染料保存15分钟，然后在测试样品15分钟之前转移至流式细胞仪。在试验中使用 FACSCalibur流式细胞仪（加利福尼亚州圣何塞的BD公司（Becton Dickinson, San Jose， CA))。分别对FL1和FL2使用530/30带通(绿)和585/42带通(红)滤光片，将488nm的氩激光激 发与发射测量结合。非精子物质被排出，且检查了至少1〇,〇〇〇个细胞。作为测试样品，从解 冻的精液、上游悬液以及3、5和8μπι过滤器孔径芯片收集了 500yL的样品。将5μΜ的DHE和50nM 的SYT0X分别加入各个样品并保存15分钟。将样品取至流式细胞仪用于测量。
[0073] DNA片段化
[0074]使用TUNEL试验试剂盒（原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素，罗氏应用科学公司 (Roche Applied Science))，对未经处理的精液、上游精子、以及从3、5和8μηι孔径过滤器微 芯片装置回收的精子群的DNA片段化进行了量化。所有这些样品均来自前述的R0S检测环 节。首先，通过使用PBS和1%BSA以500Xg离心5分钟的方式将所有的精子悬液清洗两次。一 旦进行清洗，则精子细胞的浓度被调整为2X106细胞/ml。然后用4%多聚甲醛在PBS(每100 yL的细胞悬液使用200yL)中以室温将精子悬液固定30分钟。用roS和1%BSA以500Xg离心6 分钟的方式将精子细胞清洗两次，并用0.1 %曲通X(〇.l%柠檬酸钠中）在冰中/上进行透 化。将精子清洗两次，然后用5yL的酶(TdT)溶液和45yL的标记(dUTP-荧光素)溶液以37 °C保 存1小时。类似地制备了阴性和阳性对照样品。但是，在染色之前，使用DNA酶以37°C将阳性 对照样品保存40分钟。在染色过程中，仅用标记溶液(无酶溶液)保存阴性对照样品。在染色 后，使用和1%BSA将样品清洗两次，并再次悬浮于PBS中（Muratori等，2000)。使用流式 细胞仪对DNA片段化细胞的荧光发射进行评价，并使用FL-1检测器(521nm)进行检测。总共 得到了5000个物质。将精子群从数据中输出，以消除任何来自碎片的信号。试验重复6次(N =6)〇
[0075]结果和讨论
[0076]为了发展不需化学品和离心、高处理量的垂直精子分选装置，如上所述制作并组 装了MMSS芯片。简而言之，所述芯片是两腔室芯片，两个腔室被具有各种直径（例如3、5、8μ m)的聚碳酸酯过滤器分隔。将精子样品注入底部腔室并从顶部回收腔室收集被分选的活 动/健康精子。将过滤器(例如在两个腔室之间具有尺寸均匀的孔)设计成大部分活动和健 康精子能够转移通过过滤器孔的形式。如图4所示，用于精子分选的聚碳酸酯过滤器的扫描 电子显微镜(SEM)图像呈现均匀的孔径。具有不同微孔径（υ3μπι，?)5μπι和iii)8ym)的聚碳 酸酯核孔径迹蚀刻膜过滤器的SEM图像。比例尺为ΙΟμπι。这些图像示出了各种过滤器孔和精 子的对比尺寸。
[0077] 精子头部是球形的且尺寸约为3μπιΧ4.5μπι。精子尾部长度约为45_50μπι。如果直径 大于精子头部的过滤器位于该两腔室芯片中，则仅有活动的精子可穿过微孔，但是死亡的/ 垂死的精子由于它们长的尾部而不能穿过微孔。
[0078]精子活动力和回收率
[0079]为调查被分选精子的活动力，本发明人分析了从3个MMSS芯片(3、5和8μπι直径的过 滤器芯片）的顶部回收腔室收集的精子。如图5Α所示，结果表明，与储备精子样品相比，用 MMSS芯片分选的精子呈现了显著更高的精子活动力。具体而言，3、5和8μπι过滤器芯片的精 子活动力分别为95± 10%以上、90.4± 1.8%以上、85.9± 1.5%以上，其显著高于储备精子 活动力(39 · 8 ± 1 · 9 % )。本发明人进一步考察了保存时间对精子活动力的影响。在15、30、45 和60分钟后对精子进行收集。本发明人发现，当在更长的时间后收集精子样品时，回收的精 子的活动力增加;60分钟时间点处的活动力最高，然而15分钟时间点处的活动力最低，如图 5A所示。在三种芯片中均观察到了该活动力的增加。在各个试验的起始阶段将HTF+1%BSA 移取至MMSS芯片的顶部腔室时，会因两种液体的混合而在精子样品中产生轻微的扰动;储 备精子样品和HTF+1%BSA介质。该精子样品中的扰动可能是试验起始阶段(15分钟后)的精 子活动力比之后的时间点（30、45和60分钟后)更低的原因。另外，本发明人计算了不同时间 点的精子回收率，即，从储备精子中回收的健康精子的百分比（％ )。对任何精子分选装置而 言，回收率是重要的参数，特别是在精子样品具有低精子密度的数量的情况下(精子少的试 样和无精子的试样）。丽SS芯片中，在一个时间段内分析了精子回收率；15、30、45和60分钟 时间点在图5B中进行了说明。在30分钟时间点收集的样品具有最高的精子回收率(3、5和8μ m的MMSS芯片分别为3.08 ±0.42%、23.75 ± 3.96%和28.58± 2.81 % )。本发明人将该30分 钟时间点称作饱和时间点，因为如果将样品保存超过30分钟则精子回收率降低，如图5B所 示。本发明人相信在30分钟后一些精子可能穿过过滤器而移动返回至底部腔室。
[0080] 精子存活力
[0081] 认为活动的精子是存活的精子。为了证实分选的精子是存活的，本发明人对30分 钟时间点分选的精子实施了存活/死亡染色。分选精子的存活力显著高于储备精子样品； 41.0±0.45%(储备精子），91.32±3.43%(3以111]\^55芯片），89.83±5.82%(54111]\^55芯 片），91·59±4·44%(3μπι MMSS芯片）。
[0082]样品稀释对精子活动力和回收的影响
[0083]为了考察精子样品稀释对活动力和回收率的影响，本发明人在使用MMSS芯片处理 之前，使用HTF+1 %BSA以1:4的比例将储备精子样品稀释。分选精子的活动力在四个时间点 (15、30、45和60分钟）均显著高于储备精子样品；45.8±1.5%(储备精子），彡95.0±5.0% (3μπι MMSS芯片），彡93·7±4·7%(5μπι MMSS芯片），彡90·7±2·5%(8μπι MMSS芯片），其与使 用未稀释精子样品的情况没有区别，如图5A所示。然而，如果使用稀释的精子样品替代未稀 释的储备精子，则精子回收率增加，如图5B所示。发现30分钟时间点后的8μπι芯片具有最高 的精子回收率，为52.68±4.97%。在稀释的样品中，精子在碰到另一个精子之前的平均自 由程得到增加。该现象可能有助于精子更快地到达并穿过过滤器微孔。第二，过滤器具有固 定数量的孔（<14%的孔隙率）。由于稀释样品中尝试通过过滤器孔的精子数量更少，对各 个精子而言，发现空余的孔并转移通过该孔的可能性更高。
[0084]精子速度分析
[0085]分析了各种精子速度参数，即曲线速度（VCL)、直线速度（VSL)和平均通路速度 (VAP)。显示这些速度定义的精子径迹的代表性图像示于补充图3。给出原始精子视频作为 补充影像1，其中产生有图3的径迹。使用MMSS芯片分选的精子呈现了显著高于储备精子样 品的精子速度，如图6所示。具体而言，平均精子VCL由52.7 ± 6. Ομπι/秒(储备精子)分别增加 至59 · 9 ± 3 · 5μπι/秒（3μπι的MMSS芯片），75 · 3 ± 3 · Ιμπι/秒（5μπι的MMSS芯片），和75 · 6 ± 4 · 5μπι/ 秒(8μπι的MMSS芯片），如图6Α所示。平均精子VSL由44 · 4 ± 5 · 6μπι/秒(储备精子)分别增加至 52 · 1 ± 3 · 5μπι/秒（3μπι的芯片），63 · 4 ± 3 · 5μπι/秒（5μπι的芯片），和64 · 1 ± 3 · 9μπι/秒(8μπι的芯 片），如图6Β所示。平均精子VAP由48.4± 5.8μπι/秒(储备精子)分别增加至54.1 ± 3.4μπι/秒 (3μπι的芯片），68 · 0 ± 2 · 9μπι/秒(5μπι的芯片），和67 · 5 ±4 · Ιμπι/秒(8μπι的芯片），如图6C所示。 更高的精子速度表明分选精子比储备精子更为健康。当本发明人比较使用三种不同的MMSS 芯片分选的精子的速度时，发现使用5和8μπι MMSS芯片分选的精子比使用3μπι过滤器芯片分 选的精子具有更高的VCL、VSL和VAP速度。这可能是由于大部分未成熟精子的头部尺寸小于 3微米且能够穿过3μηι微孔。这种情况的唯一例外在于，其中2个或多个3μηι孔结合在一起形 成了更大的孔的过滤器区域。
[0086]精子形态分析
[0087]用Spermac染色剂对精子染色，以进行形态分析。基于WHO定义的严格标准认定精 子的形态正常。认为任何具有>4%的形态正常精子的精子样品是正常的。本发明人发现使 用5μπι的MMSS芯片分选的精子在整体形态上未提高精子的质量，即使分选的精子是活动的。 相对于储备精子和使用5μπι的MMSS芯片分选的精子，使用8μπι的MMSS芯片分选的精子呈现了 显著改善的形态；30·0±7·6%(8μπι MMSS芯片），17·0±3·2%(5μπι MMSS芯片）和 17.6土 〇.5%(储备精子）。
[0088]精子核成熟度分析
[0089] 使用苯胺蓝将精子染色并用于分析核成熟度。苯胺蓝染色可区别未成熟精子的富 赖氨酸核以及成熟精子的富精氨酸/半胱氨酸核。未成熟精子的核被苯胺蓝染色并在核与 顶体之间呈现对比色。被苯胺蓝染色的精子的代表性图像以及它们的评价标准示于图7。使 用5μπι芯片分选的精子相对于储备精子在核成熟度方面未呈现任何改进。然而，使用8μπι过 滤器芯片分选的精子呈现比储备精子样品更高的核成熟度，如图8所示;40.8±5.1%(8μπι MMSS芯片），25±4·6%(5μπι MMSS芯片）和26·9±5·8%(储备精子）。
[0090] R0S产生分析
[0091] 对分选的精子进行R0S产生分析。本发明人比较了清洗方法、常规上游方法和MMSS 芯片后的精子中的R0S产生。本发明人发现，由MMSS芯片分选的精子相比上游和清洗方法产 生明显更少的R0S (图9)。精子清洗和上游方法产生分别占精子10.1%±0.3%和10.6%土 1.1 %的R0S，然而使用MMSS芯片分选的精子仅产生占精子0.8% ±0.4% (3ym MMSS芯片）， 0 · 7% ±0 · 1 % (5μπι MMSS芯片）和1 · 0% ±0 · 1 % (8μπι MMSS芯片）的R0S。未分选的精液样品 产生占精子1.8% ±0.6 %的R0S，其清楚地表明上游方法和清洗方法中增加的R0S产生来自 离心步骤。
[0092] DNA片段化分析
[0093]精子DNA片段化的分析能够区分可育男性和不可育男性，具有更高DNA片段化水平 的精子样品导致IVF/ICSI中的受精率更低，损害胚胎发展并降低怀孕率。对使用MMSS芯片 分选的精子进行〇财片段化分析。0财片段化（％)为1.1%±0.3%(841111^33)，2.1%± 0.7%(5ym MMSS芯片），3·4%±0·8%(3μπι MMSS芯片），3·7%±1·2%(上游方法)和31.2% ± 1.2% (未分选精液）。使用5μπι和8μπι芯片分选的精子相较于未分选精液样品和使用上游 方法分选的精子，呈现明显更低的DNA片段化（％ )(图10)。
[0094] 讨论
[0095]理想的精子分选技术应当（i)快速且高性价比，（i i)劳动密集程度更低，（i i i)处 理更大量的精子，（iv)具有更高的回收效率以将活动精子与死亡/非活动精子分离，（v)分 离具有更快速度的精子，（vi)分离形态正常和成熟的精子，（vii)通过略去分离步骤而减少 R0S产生和形态损伤，（viii)降低精子DNA片段化的百分比。这些参数在本发明的任何精子 分选装置和系统中均为普遍所需的特性，本发明提供具有这些特性的平台。
[0096] 在本文的一个具体实施例中，用于制作一枚芯片的材料总成本小于1美元(过滤器 50美分，PMMA和DSA不到50美分KMMSS芯片迅速(约30分钟)将活动精子与非活动精子分离， 相较于上游技术（<20% )具有更高的回收率(从储备精子中回收28.58±2.81 %)。通过使 用稀释的样品将回收率进一步提高至52.68±4.97% (8μπι过滤器）。尽管精子稀释使得健康 精子的回收率更高，但是其降低了能够一次处理的实际储备精子的体积。储备精子可按需 要进行稀释，然后经处理用于（i)低体积射出，和（ii)以极低精子计数射出。MMSS芯片设计 是高度可扩展的，可通过使用更大的过滤器来处理大量的精液(例如多1.5ml)。需要处理大 量的精液样品以回收足够的精子用于IVF步骤。进一步，高处理容量对于精子密度低或精子 活动力低的样品而言是非常重要的。
[0097] 具有更高速度参数的精子能够增加 ICSI受精率。与储备精子相比，由MMSS芯片分 选的精子呈现显著增强的速度参数(VCL，VSL和VAP)，表明分选的精子具有更高的质量。精 子形态是成功受精的另一个重要指标。形态正常的精子在IVF步骤中增加受精率。使用8μπι 的MMSS芯片分选精子将精子形态提高了 1.7倍，这是显著的提高，如图7所示。还值得注意的 是精子活动力和形态之间的关联。本发明人发现，形态正常的精子还呈现更快的速度，其表 明这两个功能性参数(精子速度和形态)之间是相关的。
[0098]精子核成熟度与男性可育性呈现关联。由核成熟度描述的染色质致密性是IVF结 果的另一个重要预测参数。使用8μπι的MMSS芯片分选的精子呈现了显著高于储备样品的精 子成熟度，如图8所示。本发明人还检查了人类精子的R0S产生。R0S产生是用于评价精子质 量及其凋亡状态的重要考察工具。存在许多导致精子R0S产生的路径和原因，例如精子形成 过程中的分化不良、不良的染色质紧密度、暴露于重金属环境、热或电磁辐射、延长的体外 培养、R0S产生细胞的附近存在精子。常规技术采用离心步骤分选健康的精子是R0S产生的 另一个原因，因为这些技术离心精子与R0S产生细胞(例如白细胞）。本发明人发现使用三种 MMSS芯片分离的精子呈现显著低于储备精子的R0S产生。
[0099] DNA片段化是男性可育性的另一个非常重要的指标。根据一些报告，精子DNA完整 度可认为是受精的一个独立标记。与未分选的精液样品相比，使用MMSS芯片分选的精子呈 现了显著改善的DNA片段化，如图10所示。目前，认为精子上游方法是以低DNA片段化分选精 子的标准。值得注意的是，使用5μπι和8μπι的丽SS芯片分选的精子呈现比上游方法更低的DNA 片段化。本发明人认为基于这些功能性评价，与传统方法相比，使用8μπι的MMSS芯片分选的 精子具有更好的质量。对形态正常、成熟、活动且功能性的精子进行分选可能改善IVF/ICSI 结果。
[0100] 现在参照图11，提供了用于分选精子的方法的一些示例步骤100。步骤100起始于 进程块102,包括将精子样品接收至微流体系统的入口，如上所述。之后，在进程块104中，使 样品中的精子朝向出口穿过微流体系统中的流通通路，所述出口提供通往微流体系统的路 径以从微流体系统收集被分选的精子。进程块106中，在精子到达出口之前将其供于过滤 器。如所述，过滤器具有多个微孔，并以限制精子利用重力运动穿过过滤器的方式进行取 向。因此，进程块108中，将被分选的精子供于出口。分选的精子包括:穿过所述过滤器并克 服重力而通过所述出口的精子。
[0101] 因此，本公开提供用于以下方面的系统和方法：（i)开发无化学品和不需流动的系 统以分选健康的精子，分析活动力、速度和形态，（ii)分离被分选的健康精子，以及(iii)发 展对精子排空（exhaustion)和整体运动的更好的理解。该平台是优于现有临床方法的创 新，例如上游技术和微滴技术。针对已经报告的基于微流体的精子分选装置而言，该平台也 是新型的，因为其使用了开创性的知识(空间受限通道中的排空)来分选和分析精子。考虑 到临床生殖医学一直以来是劳动密集型的挑战性的领域，这种易于使用的微芯片能够带来 改善的健康精子的选择并减少对操作技能的依赖，推进可重复的和可靠的操作步骤。
[0102]已通过一个或多个优选的实施方式描述了本发明，但应理解除了明确描述的那些 方案之外，许多等同方案、替代方案、变化方案和修改方案是可能实现的并在本发明范围 内。
【主权项】
1. 一种用于分选精子的系统，所述系统包括： 壳体； 由壳体支撑的微流体系统； 入口，所述入口提供通往微流体系统的路径以将精子输送至微流体系统； 出口，所述出口提供通往微流体系统的路径以从微流体系统收集被分选的精子； 其中，所述微流体系统提供精子从入口到出口的流通通路，其包括： 至少一个从入口延伸至出口的通道，以使通过入口被输送至微流体系统的精子沿着流 通通路向出口流动;和 过滤器，所述过滤器包含多个微孔且设置在流通通路中，以使沿着流通通路运行的精 子移动穿过过滤器并克服重力以到达出口。2. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，对所述多个微孔的尺寸进行设置以使精子头 部能够穿过所述微孔。3. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述多个微孔包括尺寸至少为Imi的微孔。4. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述多个微孔包括尺寸低于IOmi的微孔。5. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述多个微孔包括形状为球形的微孔。6. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述过滤器包括聚碳酸酯过滤器。7. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，还包括设置于出口的收集腔室。8. 如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述收集腔室包括两个子腔室。9. 如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述过滤器设置在两个子腔室中的一个内。10. 如权利要求8所述的系统，其特征在于，对所述两个子腔室中的第一个进行配置以 收集缔合有精子的新鲜精液，对所述两个子腔室中的第二个进行配置以使活动精子输送至 出口并限制非活动精子。11. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，还包括用于对流通通路中的精子进行成像 的成像系统。12. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，还包括成像系统，所述成像系统包括至少一 个配置成照亮流通通路中的精子的光源和靠近流通通路配置以对精子进行成像的成像传 感器。13. 如权利要求11所述的系统，其特征在于，所述成像传感器包括电荷耦合装置(CCD) 或互补金属氧化物半导体(CMOS)成像传感器中的至少一种。14. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述微流体系统包括聚二甲基硅氧烷 (PDMS)基底或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)基底中的至少一种。15. 如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述至少一个通道包括多个通道，所述多个 通道具有各自不同的通道长度。16. -种用于分选精子的方法，所述方法包括： 将精子的样品输送至与微流体系统连接的入口； 使精子样品中的精子沿流通通路运行穿过微流体系统朝向出口，所述出口提供通往微 流体系统的路径以从微流体系统收集被分选的精子； 在到达出口之前利用具有微孔的过滤器以及重力对精子进行过滤，以限制精子移动穿 过所述过滤器；以及 穿过所述过滤器并克服重力之后对运行至所述出口的精子进行收集。17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，还包括:利用所述过滤器和重力来限制非 活动精子到达出口。18. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，还包括：利用所述过滤器、另一个过滤器、 和重力来限制非活动精子到达出口。19. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，还包括:对微流体系统中的精子进行成像。20. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，还包括:使用至少一种光学成像系统对微 流体系统中的精子进行成像。
【文档编号】C12Q1/02GK105960463SQ201480073593
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2014年11月19日
【发明人】U·德米尔奇, W·阿斯加尔
【申请人】布里格姆女子医院有限公司