十六元环大环内酯类化合物及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明提供了十六元环大环内酯类化合物及其制备方法与应用，属于农药技术领域。本发明中化合物的结构式如下：本发明的化合物是由冰城链霉菌突变菌株Streptomyces bingchenggensis BC-120-4经扩大培养后，发酵液经过滤后，用甲醇浸提，乙酸乙酯萃取，浓缩后硅胶柱层析，RP-18柱层析后所得到的化合物。所述化合物在制备杀螨虫药、杀线虫药中的应用。本发明的化合物具有较强的杀螨杀线虫活性。
【专利说明】
十六元环大环内酯类化合物及其制备方法与应用
技术领域
[0001 ]本发明属于农药技术领域，具体涉及一类具有杀虫活性的大环内酯类抗生素，及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 1967年，日本Sankyo 公司从Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus的发酵液中发现米尔贝霉素，研究至今，已分离到米尔贝霉素20余 种。在长期的研究中，通过对米尔贝霉素的多个组分进行化学结构修饰，形成了一系列的衍 生物。目前商品化最多的是米尔贝霉素A3/A4、莫西克汀、米尔贝肟。该类药物在农牧业上对 寄生虫类有较好的防治效果，且具有广谱杀虫活性，如螨类、蚜虫、黄褐天幕毛虫、肠道寄生 虫及其他危害农业及畜牧业的寄生虫。其作用特点包括用量少，反应强烈且对人安全、无毒 害，不污染环境，对天敌无害，也不易产生抗性。作为抗寄生虫药，米尔贝霉素作用机制是， 其作为一种T-氨基丁酸(GABA)的激动剂，进而引发突触前的GABA释放，影响Cr通道的通 透性，进而阻断神经递质的传导，从而引起虫体神经肌肉麻痹至死。
[0003] 冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis是本实验室从土壤中分离得到的米 尔贝霉素产生菌。与其它米尔贝霉素产生菌Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus 和 Streptomyces griseochromo genes 一样，冰城链霉菌 Streptomyces bingchenggensis除了产生米尔贝霉素A3/A4外，还产生其它米尔贝霉素系 列化合物及其它的次级代谢产物。通过对Streptomyces bingchenggens i s进行常温常压等 离子诱变，我们获得了一株米尔贝霉素A3/A4高产菌株Streptomy ces bingchenggensis BC-12〇-4(Hai-Yan ffang,Ji Zhang,Yue-Jing Zhang,Bo Zhang,Chong-Xi Liu,Hai-Rong He,Xiang-Jing ffang,ffen-Sheng Xiang.Combined application of plasma mutagenesis and gene engineering leads to 5-〇xomilbemycins A3/A4 as main components from Streptomyces bingchenggensis[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014, 98:9703-9712)。因此，对该突变菌株发酵代谢产物的分离纯化可以发现新型、更高生物活 性的米尔贝霉素结构类似物，为米尔贝霉素生物合成机制的研究提供新的视角，也为新型 米尔贝霉素的药物开发提供丰富的实验材料。
【发明内容】
[0004] 本发明主要涉及由冰城链霉菌突变菌株（Streptomyces bingchenggensis BC-120-4)得到的新的米尔贝霉素类化合物，及它们的制备方法和应用。
[0005] 本发明的目的是提供一类具有强杀虫活性的十六元环大环内酯类化合物。
[0006] 本发明的另一个目的是提供这类十六元环大环内酯类化合物的制备方法。
[0007] 本发明中十六元环大环内酯类化合物的结构式为：
[0009]上述十六元环大环内酯类化合物的制备方法是将冰城链霉菌突变菌株经扩大培 养后再分离纯化;其中所述扩大培养依次分为斜面培养、种子培养及最后的发酵三个步骤。 [0010] 其中，所述的冰城链霉菌突变菌株为Streptomyces bingchenggensis BC-120。
[0011] 所述的斜面培养为:斜面培养基组成:葡萄糖l〇-12g/L，麦芽糖3-4g/L，酵母抽提 粉3-48/1，1(2耶04.31120 0.5-0.68/1，]\^504.71120 0.5-0.68/1，似(：10.5-0.68/1， KN031.0-1.2g/L，琼脂粉20-25g/L，pH 7.0-7.2，用去离子水配制，灭菌，接菌后置于28°C培 养箱中，培养8-9天，将培养得到的孢子用无菌水配置成lOtloSc.f.u.mr 1的孢子悬液备 用。
[0012] 所述的种子培养为：种子培养基组成：葡萄糖5-6g/L，麦芽糊精5-6g/L，可溶性淀 粉1.0-1.2g/L，酵母粉5-6g/L，牛肉膏 1.0-1.2g/L，酪蛋白胨1.0-1.2g/L，pH 7.0-7.2，用蒸 馏水配制，灭菌，取斜面培养所得107-108c. f. u. mr1孢子悬液接种于种子培养基中，置于旋 转式摇床，28 °C培养46-52h。
[0013]所述的发酵:发酵培养基组成:葡萄糖10_12g/L，乳糖25-30g/L，棉籽饼粉25-30g/ L，CaC03 0.3-0.4g/L，pH 7.0-7.2，用蒸馏水配制，灭菌，将种子培养所得种子液接入到发 酵培养基中，置旋转式摇床，28 °C发酵培养7-8天。
[0014]所述的分离纯化的方法为:发酵液经100~200目筛网过滤后，滤渣用3-4倍体积甲 醇提取，提取液浓缩后用等体积乙酸乙酯萃取3-4次，将萃取液浓缩后依次进行硅胶柱层析 和RP-18柱层析后，得到两种白色粉末状化合物1和化合物2。
[0015]所述的硅胶柱层析用到的填料是100~200目的硅胶，流动相为石油醚：乙酸乙酯 =(100:0)-(50:50)(￥八)进行梯度洗脱，流速10-201111/1^11，依次收集洗脱液，薄层层析 (TLC)检测合并相同组分;所述的RP-18柱层析使用混合溶剂，即甲醇:水=(80:20)-(95:5) (V/V)进行梯度洗脱，流速3-5ml/min，薄层层析(TLC)检测合并相同组分。
[0016] 所述的十六元环大环内酯类化合物在制备杀螨虫药、杀线虫药中的应用。
[0017] 本发明得到了十六元环大环内酯类化合物对朱砂叶螨及松材线虫有较强的杀虫 活性，可用于杀虫剂的开发。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0018] 一:本实施方式使用的发酵菌种是冰城链霉菌突变菌株，该菌株是 公开于Hai-Yan Wang,Ji Zhang，Yue-Jing Zhang,Bo Zhang,Chong-XiLiu,Hai-Rong He, Xiang-Jing Wang,ffen-Sheng Xiang.Combined application of plasma mutagenesis and gene engineering leads to 5-〇xomilbemycins A3/A4 as main components from Streptomyces bingchenggensis
【具体实施方式】 [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014, 98:9703-9712的冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis BC_12〇-4〇
[0019] 十六元环大环内酯类化合物的制备方法是按下述步骤进行的：
[0020] -、扩大培养：
[0021] (1)斜面培养：培养基组成（g/L):葡萄糖10，麦芽糖3，酵母抽提粉3，K2HP〇4 ? 3H2〇0.5，MgS〇4.7H20 0.5，NaCl 0.5，KN031，琼脂粉20，pH 7.0,用去离子水配制，于 121°C 下灭菌20min。接菌后置于28°C培养箱中，培养8天。
[0022] (2)种子培养:种子培养基组成(g/L):葡萄糖5,麦芽糊精5,可溶性淀粉1，酵母粉 5,牛肉膏1，酪蛋白胨l，pH 7.0,用蒸馏水配制，于121°C下灭菌20min。向菌种斜面上加入 10ml无菌水，用已灭菌的接种环刮下孢子制成孢子悬液，使其浓度为lOi.f.u.mr1。然后取 2ml孢子悬液接种于种子培养摇瓶中，种子摇瓶装液量为25ml/250ml，置于250rpm旋转式摇 床，28°C培养46h。
[0023] (3)发酵:发酵培养基组成（g/L):葡萄糖10,乳糖25,棉籽饼粉25，CaC03 0.3，pH 7.0-7.2，用蒸馏水配制，于121°(：下灭菌201^11。按8%(￥八)接种量，将种子液接入到11发酵 摇瓶中，发酵摇瓶的装液量为l〇〇ml/L。置于250rpm旋转式摇床，28°C发酵培养8天。
[0024] 2、化合物分离：
[0025] 30L发酵液经200目筛网过滤得到菌丝体滤饼3L。滤饼用去离子水洗后再用10L工 业甲醇浸泡过夜，过滤得甲醇提取液。所得提取液在45°C减压浓缩去除甲醇相直至剩余约 2L，然后用等体积乙酸乙酯分别萃取三次得乙酸乙酯萃取液，萃取液在减压条件下浓缩至 干，得到25g油状物质。
[0026]将所得的油状物质上硅胶柱(粒径100~200目）进行层析，用石油醚：乙酸乙酯= 100:0-50: 50(V/V)进行梯度洗脱，流速10ml/min，用250ml锥形瓶依次收集洗脱液，每份 250ml，经薄层层析(TLC)检测(石油醚：乙酸乙酯= 2:1)后合并相同组分，得到组分一 (RF = 0.72-0.78)、组分二（1^ = 0.63-0.71)、组分三（1^ = 0.48-0.62)。将组分二上1^-18柱进行 层析，用甲醇与水=80:20-95:5(V/V)进行梯度洗脱，流速3ml/min，用10ml试管依次收集洗 脱液，每份l〇ml，薄层层析(TLC)检测(石油醚：乙酸乙酯= 2:1)，合并RF = 0.66的组分得到 化合物1:7.6mg，合并RF = 0.70的组分得到化合物2:9.3mg。
[0027] 3、结构鉴定
[0028] 化合物1
[0029]性状：白色粉末
[0030] 溶解性:易溶于氯仿、丙酮、甲醇，不溶于水
[0031] 分子式：C33H44〇7
[0032] 比旋度：[0cF-5(c 0.16，Et0H)
[0033] 高分辨质谱(HRESI-MS):553.3142[M+H] + (calcd C33H45〇7for 553.3160)
[0034] 紫外吸收光谱（UV absorption spectrum)Xmax(EtOH)nm(loge) :260(4.44)，200 (4.34)
[0035] 红外吸收光谱（IR absorption spectrum)Vmaxcm-1:3348，2977，1710，1613，1456， 1268,1182,1099,1029,907
[0036] 化合物2 [0037]性状：白色粉末
[0038] 溶解性:易溶于氯仿、丙酮、甲醇，不溶于水
[0039] 分子式：C32H40〇7
[0040] 比旋度：[ap+72(c 0.04，Et0H)
[0041] 高分辨质谱（HRESI-MS):537.2827[M+H] + (calcd C32H4i〇7for 537.2847)
[0042] 紫外吸收光谱（UV absorption spectrum)Xmax(EtOH)nm(loge): 363(4 ? 24)，274 (4.33),218(4.35),200(4.40)
[0043] 红外吸收光谱（IR absorption spectrunOVmaxcm-SsSASjgeOjgseaTTLnil， 1609，1455，1364，1209，1068，984
[0044] 化合物1和化合物2的1H和13C NMR(⑶Cl3)数据见表1。
[0045] 表1化合物1和化合物2的1H和13C NMR(⑶Cl3)数据
[0049]化合物2的结构式为：
[00511 4、杀虫活性测定
[0052] (1)杀螨虫活性
[0053]将含lg/ml单个纯化合物的甲醇溶液用含0.01 % (w/v)表面活性剂烷基酚聚氧乙 烯醚的水稀释10倍，制成l〇〇mg/ml的溶液，再经稀释制成0 ? 1，0 ? 05，0 ? 025，0 ? 01，0 ? 005mg/l 的稀释溶液作为样品溶液。将对有机磷类杀虫药敏感的朱砂叶螨接种到5工豆的初生叶上。 接种一天后，将豇豆的叶子浸泡在样品溶液中l_2s。将叶子在25°C放置3天后，用显微镜观 察存活成虫的个数，计算死亡率（％)。
[0054] (2)杀线虫活性
[0055]将含lg/ml单个纯化合物的甲醇溶液用水稀释10倍，制成lOOmg/ml的溶液，再依次 稀释得到1，0.5，0.25，0.1和0.05mg/ml的溶液。取上述不同浓度溶液各10yl分别加入到90y 1含活松材线虫水悬液中。混合液震荡后在25°C放置15h。在显微镜下计数不动线虫的数量 和测试线虫的总数。计算测试线虫的死亡率（％ )。
[0056]化合物1和化合物2具有较强的杀螨和杀线虫活性，见表2。
[0057]表2化合物1和化合物2的杀螨和杀线虫活性
[0059] a米尔贝霉素 A3和A4混合(30:70)
[0060]实验结果表明，化合物1和2表现了较高的杀虫活性，具有潜在的开发价值。
[0061]【具体实施方式】二:本实施方式使用的发酵菌种是冰城链霉菌突变菌株，该菌株是 公开于Hai-Yan Wang,Ji Zhang，Yue-Jing Zhang,Bo Zhang,Chong-XiLiu,Hai-Rong He, Xiang-Jing Wang,ffen-Sheng Xiang.Combined application of plasma mutagenesis and gene engineering leads to 5-〇xomilbemycins A3/A4 as main components from Streptomyces bingchenggensis[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014, 98:9703-9712的冰城链霉菌Streptomyces bingchenggensis BC_12〇-4〇
[0062]十六元环大环内酯类化合物的制备方法是按下述步骤进行的：
[0063] -、扩大培养：
[0064] (1)斜面培养：培养基组成（g/L):葡萄糖12,麦芽糖4,酵母抽提粉4，K2HP〇4 ? 3出00.6，]\%504.71120 0.6，恥(：10.6，1(勵3 1.2，琼脂粉20印117.2，用去离子水配制，于121 °C下灭菌20min。接菌后置于28°C培养箱中，培养8天。
[0065] (2)种子培养:种子培养基组成(g/L):葡萄糖6,麦芽糊精6,可溶性淀粉1.2,酵母 粉6，牛肉膏1.2，酪蛋白胨1.2 4117.2，用蒸馏水配制，于121°(：下灭菌2〇1^11。向菌种斜面上 加入l〇ml无菌水，用已灭菌的接种环刮下孢子制成孢子悬液，使其浓度为lOi.f.u.mr 1。然 后取2ml孢子悬液接种于种子培养摇瓶中，种子摇瓶装液量为25ml/250ml，置于250rpm旋转 式摇床，28°C培养46h。
[0066] (3)发酵:发酵培养基组成（g/L):葡萄糖12，乳糖30，棉籽饼粉30，CaC03 0.4，pH 7.2，用蒸馏水配制，于121°(：下灭菌2〇1^11。按8%(￥八)接种量，将种子液接入到11发酵摇瓶 中，发酵摇瓶的装液量为l〇〇ml/L。置于250rpm旋转式摇床，28°C发酵培养8天。
[0067] 2、化合物分离
[0068] 30L发酵液经200目筛网过滤得到菌丝体滤饼3L。滤饼用去离子水洗后再用12L工 业甲醇浸泡过夜，过滤得甲醇提取液。所得提取液在45°C减压浓缩去除甲醇相直至剩余约 2L，然后用等体积乙酸乙酯分别萃取四次得乙酸乙酯萃取液，萃取液在减压条件下浓缩至 干，得到25g油状物质。
[0069]将所得的油状物质上硅胶柱(粒径100~200目）进行层析，用石油醚：乙酸乙酯= 100:0-50: 50(V/V)进行梯度洗脱，流速20ml/min，用250ml锥形瓶依次收集洗脱液，每份 250ml，薄层层析（TLC)检测（石油醚：乙酸乙酯= 2:1)合并相同组分，得到组分一（RF = 0.72-0.78)、组分二（1^ = 0.63-0.71)、组分三（1^ = 0.48-0.62)。将组分二上1^-18柱进行 层析，用甲醇与水=80:20-95:5 (V/V)进行梯度洗脱，流速5ml/min，用10ml试管依次收集洗 脱液，每份l〇ml，薄层层析(TLC)检测(石油醚：乙酸乙酯= 2:1)，合并RF = 0.66的组分得到 化合物1:8. Omg，合并RF = 0.70的组分得到化合物2:9. Omg。
【主权项】
1. 十六元环大环内醋类化合物，其特征在于该化合物的结构式为：2. 十六元环大环内醋类化合物，其特征在于该化合物的结构式为：3. 如权利要求1或2所述的十六元环大环内醋类化合物的制备方法，其特征在于所述化 合物的制备方法是将冰城链霉菌突变菌株经扩大培养后再分离纯化。4. 根据权利要求3所述的十六元环大环内醋类化合物的制备方法，其特征在于所述的 冰城链霉菌突变菌株为Streptomyces bingchenggensis BC-120,所述扩大培养依次分为 斜面培养、种子培养及最后的发酵Ξ个步骤。5. 根据权利要求4所述十六元环大环内醋类化合物的制备方法，其特征在于所述的斜 面培养为:斜面培养基组成：葡萄糖l〇-12g/L，麦芽糖3-4g/L，酵母抽提粉3-4g/L，K2HP〇4 · 3此0 0.5-0.6邑/1，]\%504.7出0 0.5-0.6邑/1，胞(：10.5-0.6邑/1，脚03 1.0-1.2邑/1，琼脂粉 20-25g/L，pH 7.0-7.2，用去离子水配制，灭菌，接菌后置于28°C培养箱中，培养8-9天，将培 养得到的抱子用无菌水配置成107-108c. f. U. mri的抱子悬液备用。6. 根据权利要求4所述十六元环大环内醋类化合物的制备方法，其特征在于所述的种 子培养为:种子培养基组成:葡萄糖5-6g/L，麦芽糊精5-6g/L，可溶性淀粉1.0-1.2g/L，酵母 粉5-6g/L，牛肉膏1.0-1.2g/L，酪蛋白腺1.0-1.2g/L，pH 7.0-7.2，用蒸馈水配制，灭菌，取 斜面培养所得107-108c.f.u.mri抱子悬液接种于种子培养基中，置于旋转式摇床，28°C培 养46-5化。7. 根据权利要求4所述十六元环大环内醋类化合物的制备方法，其特征在于所述的发 酵：发酵培养基组成：葡萄糖10-12g/L，乳糖25-30g/L，棉巧饼粉25-30g/L，CaC〇3 0.3- 0.4g/L，抑7.0-7.2，用蒸馈水配制，灭菌，将种子培养所得种子液接入到发酵培养基中，置 旋转式摇床，28 °C发酵培养7-8天。8. 根据权利要求3所述的十六元环大环内醋类化合物的制备方法，其特征在于所述的 分离纯化的方法为:发酵液经100~200目筛网过滤后，滤渣用3-4倍体积甲醇提取，提取液 浓缩后用等体积乙酸乙醋萃取3-4次，将萃取液浓缩后依次进行硅胶柱层析和RP-18柱层析 后，得到两种化合物。9. 根据权利要求8所述的十六元环大环内醋类化合物的制备方法，其特征在于所述的 硅胶柱层析用到的填料是100~200目的硅胶，流动相为石油酸：乙酸乙醋= (100:0)~巧0: 50KV/V)进行梯度洗脱，流速10-20ml/min，依次收集洗脱液，薄层层析检测合并相同组分； 所述的RP-18柱层析使用混合溶剂，即甲醇:水=(80:20)~(95:5)(V/V)进行梯度洗脱，流 速3-5ml/min，薄层层析检测合并相同组分。10. 权利要求1或2所述的十六元环大环内醋类化合物在制备杀蛾虫药、杀线虫药中的 应用。
【文档编号】A01P5/00GK105968122SQ201610311954
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】向文胜, 张继, 王继栋, 李建宋, 王相晶
【申请人】东北农业大学