一种鱼源抗菌肽pleurocidin突变体及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种鱼源抗菌肽pleurocidin突变体及其应用。本发明通过分析鱼源抗菌肽pleurocidin的氨基酸序列，将原始25个氨基酸中的3处氨基酸进行突变（K8R、V16K和L21R），同时为了保证抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N。将鱼源抗菌肽pleurocidin突变体基因进行毕赤酵母偏爱密码子优化后人工合成，克隆于毕赤酵母中表达，结果重组表达的鱼源抗菌肽pleurocidin突变体与原始抗菌肽相比抗菌效力获得显著提高。将重组菌株发酵规模放大到发酵罐水平，发酵液进一步纯化后可制成抗菌肽制剂，用于水产动物疾病的预防和治疗。
【专利说明】
一种鱼源抗菌肽PI euroc i d i n突变体及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种鱼源抗菌肽pleurocidin突变 体及其应用。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽（Antibacterial peptide，ABP)是生物体经诱导产生的一类具有多种生 物活性的小分子多肽，是宿主免疫防御系统的一个重要组成部分，具有广谱抗菌、无耐药性 及毒副作用等优点。近年来，人们发现抗菌肽存在多种动物体内，且具有抑菌机制独特、抑 菌谱广、抑菌活性高以及宿主不产生抗性等优点，应用前景广阔。鱼类抗菌肽是一类小分子 蛋白质，其结构与组成复杂多样，从已报道的序列来分析，它们并没有很高的同源性，但存 在一些共同特征，如含有较多精氨酸或赖氨酸而使分子带正电;含有较多疏水氨基酸，可使 分子折叠成疏水或双亲性a螺旋结构等。鱼类抗菌肽是鱼体非特异性免疫系统的重要组成 部分，当鱼体受到损伤或病原微生物侵袭时，能迅速产生抗菌肽以预防和杀伤病原微生物 的入侵，其合成速度快，在体内扩散迅速、灵活的特点是其他大分子蛋白质(如抗体等)和免 疫细胞所不具备的，在防御海水性细菌和病毒入侵方面起着重要作用。
[0003] 抗菌肽在水产养殖中替代抗生素的应用前景非常广阔，但在工业化应用方面存在 很多问题需要解决。如抗菌肽的来源问题，由于抗菌肽在动物体内含量很低，直接从动物体 内提取成本太高;天然抗菌肽抑菌效果较差，直接应用效果不理想;天然抗菌肽带有一定的 细胞毒性，需要重新设计其结构才具有临床应用价值等。以其空间结构的模拟为基础，天然 抗菌肽的结构优化的一种方式是通过抗菌肽亲水性和疏水性氨基酸替换来调整抑菌活性 的高低，另一种方式是将不同抗菌肽的活性部位进行杂合，合成一种新的杂合抗菌肽来提 高其抑菌活性，降低其毒性。随着基因工程技术的发展，原核、真核表达系统的成熟应用也 为抗菌肽的规模化生产提供了可能。
[0004] 鱼源抗菌肽pleurocidin是由25个氨基酸残基组成的多肽，是从美洲拟蝶皮肤分 泌液中分离得到的，与树娃的抗菌肽dermaseptin和地中海果绳的抗菌肽ceratotoxin具有 序列同源性。鱼源抗菌肽pleurocidin的抑菌机理是通过形成两亲性的a螺旋结构，穿透细 菌的细胞膜来行使抑菌功能的。鱼源抗菌肽pleurocidin带有较高的阳离子电荷，这些结构 与其起始的细胞膜结合相关。本发明通过氨基酸替换的方法对鱼源抗菌肽pleurocidin进 行改造，获得一种新型鱼源抗菌肽pleurocidin突变体，大大提高了其抑菌活性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种鱼源抗菌肽pleurocidin突变体，即通过生物软件对鱼 源抗菌肽pleurocidin(GenBank登录号:AAF17252)的氨基酸序列进行空间结构分析，分别 将鱼源抗菌肽pleurocidin的25个氨基酸中的3处氨基酸进行突变(K8R、V16K和L21R)，同时 为了保证抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，使其抗菌效力获得显著提高。 [000 6]本发明首先提供一种鱼源抗菌肽pleurocidin突变体，其编码蛋白的氨基酸序列 为SEQ ID N0:1; 上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2; 本发明还提供一种鱼源抗菌肽pleurocidin突变体的重组毕赤酵母的制备方法，其制 备步骤如下： 1) 根据鱼源抗菌肽突变体的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因 序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒； 2) 将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达鱼源抗菌肽突变体的重组基 因工程酵母菌;用该重组基因工程菌高密度发酵表达出鱼源抗菌肽突变体； 3) 对重组表达的鱼源抗菌肽突变体进一步浓缩、纯化后，测定效价达12000U/ml。稀释 分装，即为抗菌肽制剂。
[0007] 本发明利用基因工程技术构建了能表达一种鱼源抗菌肽突变体的重组酵母菌株。 将重组鱼源抗菌肽突变体制备成抗菌肽制剂，其抑菌效价高、抑菌谱广，具有广阔的市场前 景和开发价值。
【具体实施方式】
[0008] 下面结合【具体实施方式】来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或 替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
[0009] 实施例1新型鱼源抗菌肽突变体及其基因的获得 1、鱼源抗菌肽pleurocidin(GenBank登录号:AAF17252)是由25个氨基酸残基组成的抗 菌肽，与树娃的抗菌肽dermaseptin和地中海果绳的抗菌肽ceratotoxin具有序列同源性。 为了进一步提高其抑菌活性，通过生物软件对鱼源抗菌肽pleurocidin的氨基酸序列进行 空间结构分析，分别将鱼源抗菌肽pleurocidin的25个氨基酸中的3处氨基酸进行突变 (K8R、V16K和L21R)，同时为了保证抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，使其 抗菌效力获得显著提高，获得一种新型鱼源抗菌肽突变体，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
[0010] 2、根据获得的新型鱼源抗菌肽突变体的氨基酸序列SEQ ID NO: 1，按照毕赤酵母 基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型鱼源抗菌肽突变体的核苷酸序列SEQ ID N0:2。并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入Xhol和Xbal酶切位点，以便于克隆入毕赤酵 母表达载体中。
[0011] 实施例2基因工程鱼源抗菌肽突变体表达载体的构建与工程菌的获得 1、将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XAol和Zhl双酶切，酶切产物回收并 连接，进行PCR鉴定、测序。
[0012] 2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均 匀涂布于含l〇〇yg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30°C孵育3 -5天。待YPDS平板上的阳性转 化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200yg/mL、500yg/mL、1000yg/mL的YPDS选 择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
[0013] 3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100yg/mL Zeocin的Yro培养液中，28°C 振摇培养18个小时。取此菌液按5%体积比转接于5mL BMGY培养基中，28°C摇振培养18-24h 左右，0D值约为5-6。培养物直接转接于25mL BMMY培养基中，28°C继续摇振培养。为了维持 诱导表达，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%。4811后，4°C 5000r/min离心10min，收集上 清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新型鱼源抗菌肽突变 体的阳性菌株，命名为YA株。
[0014]实施例3新型鱼源抗菌肽突变体的发酵、纯化制备 1、发酵工艺 1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1%_1〇%接种量接种于三角瓶，28-30°C，200r/min 摇床培养16-24h后以5%-20%接种量接入10L发酵罐（实装培养基7L)，温度28-30°C，转速 500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1. OVVM( 1L发酵液lmin通入的氧气量），溶 氧>20%情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇 至发酵结束，整个发酵持续48-72h。
[0015] 2)发酵结束后原罐蒸汽100°C灭菌10_20min，放料，5000r/min离心10min，收集发 酵上清即为抗菌肽半成品。
[0016] 3)新型抗菌肽制剂 抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后 得到液体制剂。
[0017] 上述基因工程抗菌肽可开发成水产动物饲料添加剂或水产动物疾病的预防和治 疗制剂。
[0018] 实施例4新型鱼源抗菌肽突变体的最小抑菌浓度测定(MIC) 1、试验菌株 金黄色葡萄球菌(CowanI)、鳗弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌。
[0019] 2、菌株处理:将菌种复苏，在固体培养基中划线，在28°C培养箱中过夜培养。将过 夜培养的细菌挑单菌落于含有25mL液体培养基的三角瓶中，将三角瓶放于摇床28°C培养 12-18h。将培养后的菌液在600nm处测其吸光度值，用培养基调节菌液浓度，使其处于0.6-0.8之间。之后将菌液稀释成浓度为5 X 105CFU/mL，依次取90yL加入到96孔板的各孔内。
[0020] 3、抗菌肽定量后用培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肽各取10此依次加入 到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100此。96孔板盖盖后，28°C振荡培养24h 后，观察并用酶标仪测量〇D_值并记录实验结果。抗菌肽样品经过二倍稀释后，成一系列浓 度，以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度(MIC)。菌液和培养基分别用来做阴性 和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100%。同时设立鱼源抗菌肽pleurocidin标准品试验组 作为对照，用于观察抗菌肽改造前后的抑菌活性变化。
[0021 ] 4、用微量稀释法测定重组鱼源抗菌肽pleurocidin及其突变体对多种细菌的最低 抑菌浓度，结果表明其对水产常见病害菌均有显著的抑制效果，特别是改造的新型鱼源抗 菌肽突变体与鱼源抗菌肽pleurocidin标准品相比，对暢弧菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏 菌的抑菌能力均得到广泛提高，显示了本发明对鱼源抗菌肽pleurocidin的氨基酸突变效 果显著。
[0022]表1抗菌肽对多种水产病害菌的最低抑菌浓度
【主权项】
1 · 一种鱼源抗菌肽pleurocidin突变体，其特征在于，所述的鱼源抗菌肽pleurocidin 突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。2. -种核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段用于编码权利要求1所述的鱼源抗 菌肽pleurocidin突变体。3. 如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID N0:2〇4. 权利要求1所述的鱼源抗菌肽pleurocidin突变体在制备水产动物饲料添加剂或疾 病的预防和治疗制剂中的应用。
【文档编号】A23K50/80GK105968179SQ201610363295
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】侯竹美
【申请人】青岛农业大学