一种动物用多效多克隆抗体、其制备方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种动物用多效多克隆抗体，其按照如下方法制备：A、免疫原采用群组化的多元免疫原多肽，其至少包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的免疫原多肽或者通过取代、缺失、和/或添加一个或几个氨基酸从SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的序列中衍生的具有免疫原性的序列；B、动物免疫，用步骤A的免疫原多肽免疫目标动物，取抗血清；C、多克隆抗体的获得，分离并提纯步骤B所得抗血清免疫球蛋白，得多克隆抗体。本发明的多克隆抗体在制备禽畜疾病综合防治药剂和禽畜免疫增强药剂中具有广泛应用。
【专利说明】
一种动物用多效多克隆抗体、其制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是一种利用多元化的群组抗原制备的多克隆抗体 及其应用。
【背景技术】
[0002] 抗原上可以引起机体产生抗体的分子结构为抗原决定簇，一个抗原上可以有若干 个不同的抗原决定簇使机体产生不同的抗体，最终产生出抗体是浆细胞。只针对一个抗原 决定簇起作用的浆细胞群就是一个纯系，即克隆。单克隆抗体是指由一种抗原决定簇刺激 机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体。
[0003] 与单克隆抗体相对应的是多克隆抗体，由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产 生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的 抗体就是多克隆抗体;除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体 产生以6、1811、184、18￡和以0等五类具有中和毒素和病毒、凝集和沉淀抗原、激活补体及通 过特异的膜受体等功能的抗体。
[0004]近年来，以美国陈建明教授为代表的学者进一步发展了多元化抗原诱发的多克隆 抗体，其具有更加广泛的抗体效价和良好的应用前景。目前国内尚未见相关研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种动物用多效多克隆抗体、其制备方法及其应 用，此多克隆抗体具有更加宽泛的抗病谱系和适用范围。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
[0007] -种动物用多效多克隆抗体，其按照如下方法制备：
[0008] A、免疫原采用群组化的多元免疫原多肽，其至少包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID NO: 3所示的免疫原多肽或者通过取代、缺失、和/或添加一个或几个氨基酸从SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3的序列中衍生的具有免疫原性的序列；
[0009] B、动物免疫，用步骤A的免疫原多肽免疫目标动物，取抗血清；
[0010] C、多克隆抗体的获得，分离并提纯步骤B所得抗血清免疫球蛋白，得多克隆抗体。
[0011] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，所述免疫原多肽按照如下方法制备： 首先通过PCR方法扩增免疫原多肽的结构基因，通过限制性内切酶将免疫原多肽的结构基 因与表达载体整合形成重组表达载体，将重组表达载体转入宿主细胞诱导表达获得免疫原 多肽；
[0012] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，用步骤A的多元免疫原多肽作为免疫 原免疫新西兰大白兔，得抗血清。
[0013] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，通过辛酸-硫酸氨盐析法联合阴离子 交换层析法对步骤B所得抗血清进行提取和纯化，得多克隆抗体。
[0014] 上述的多克隆抗体在制备禽畜疾病综合防治药剂和禽畜免疫增强药剂中的应用。
[0015] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
[0016] 本发明制备的动物用多效多克隆抗体具有更加宽泛的抗病谱系，用于禽畜疾病综 合防治和禽畜免疫增强，能够增强禽畜机体免疫力，识别、中和、清除病原微生物及毒素，提 高抗病能力。经过生产试用，其可以有效的避免免疫失败、免疫抑制、免疫麻痹、免疫应激的 发生，可广泛的应用于禽流行性感冒、新城疫、法氏囊、鸡痘、传支、传喉、小鹅瘟、鸭病毒性 肝炎、猪瘟、圆环病毒病、蓝耳病、传染性胃肠炎、犊牛腹泻等禽畜疾病的预防和治疗。
[0017] 本发明的作用机理在于:①多克隆抗体肽能直接黏附于病原体的细胞壁上，改变 病原细胞的完整性，直接抑制病原体的生长，也可黏附于病原体细胞的菌毛上，使之不能黏 附于肠道黏膜上皮细胞，一部分基因肽在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段 含有抗体的可变为小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病 原体黏附因子结合，使病原体不能黏附易感细胞而失去致病性，而基因肽的稳定区（Fe部 分）留在肠内。②多克隆抗体肽能与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变了该抗原的 状态或活性，另外基因肽可通过调理作用，促进分叶核细胞或巨噬细胞对细胞的吞噬，能与 病毒结合，改变病毒的构象，阻止病毒吸附于易感细胞，同时形成的病毒基因肽免疫复合物 被巨细胞吞_。
[0018] 本发明与通用禽畜生物制剂的差异化优势在于:①与聚肌胞相比见效快，本发明 用药24h后能达到血药浓度高峰并产生疗效，而聚肌胞是一种干扰素诱导剂，见效慢;②与 干扰素相比，多克隆抗体肽不会引起使用对象发热、发烧、过敏等不良反应;③转移因子等 其他生物制剂需要低温冷冻保存，而多克隆抗体肽可常温保存，冷藏保存保质期更长;④不 影响疫苗免疫，可与疫苗同时使用，填补免疫空白，提高抗体滴度。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市 售产品，均能够通过市场购买直接获得。
[0020] 实施例1、动物用多效多克隆抗体的制备和应用
[0021] A、多元化群组免疫原的制备：采用群组化的多元免疫原多肽，其至少包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的免疫原多肽;其制备方法为:首先通过PCR方法扩增 免疫原多肽的结构基因，通过限制性内切酶将免疫原多肽的结构基因与表达载体整合形 成重组表达载体，将重组表达载体转入宿主细胞诱导表达获得免疫原多肽;也可提供序列 委托上海生工、Novagen等公司通过生物工程方法进行制备；
[0022] B、动物免疫，用步骤A的免疫原多肽免疫目标动物，取抗血清;具体包括如下步骤： [0023]①重组蛋白疫苗的制备
[0024] 将石蜡油和羊毛脂按3.7 :1的比例混合，加热溶解，高温灭菌，制成不完全弗氏佐 剂，每毫升不完全佐剂中加入lmg卡介苗制成弗氏完全佐剂。用前将弗氏完全佐剂或不完全 佐剂与抗原液体等体积混合，冰浴超声波乳化，检查乳化效果标准：以将乳化的佐剂乳化抗 原滴于冷水表面出现完整又不扩散的圆形油滴即为乳化完全。
[0025] ②免疫程序如下
[0027] 免疫前一天对家兔进行抽血，分离血清作为阴性对照，四免后颈动脉放血，收集血 液。37 °C放置30分钟，4 °C冰箱过夜。第二天析出血清，血凝块以转速为5000转/分钟离心15 分钟，再次收集血清，-20 °C保存。
[0028] C、多克隆抗体的获得，分离并提纯步骤B所得抗血清IgG，得多克隆抗体，具体步骤 包括：
[0029]①辛酸-硫酸铵粗提，具体操作如下：
[0030] a.用4倍体积的醋酸钠缓冲液(60mmo 1 /L，pH4.0)稀释兔抗血清，调pH4.5。
[0031] b.将辛酸(33yl/mL样品）逐滴慢慢加入血清样品中，边加边搅拌，加完后继续搅 拌30分钟，4°C静置2小时，10000g离心30分钟，除去白蛋白等杂质蛋白。
[0032] c ?每10体积的上清加1体积的10 XPBS(pH7 ? 4)，用NaoH调pH至7 ? 4。
[0033] d.上清冷至4°C，加硫酸铵(0.277g/mL，使最终饱和度为45% )，搅拌30分钟，静置4 小时，5000转/15分钟，弃上清，将沉淀悬浮于少量PBS中。
[0034] e.悬浮液用100倍体积的PBS于4°C透析过夜，每3小时换液一次，直至0.1 %的奈氏 试剂检测透析液中无棕红色沉淀产生为止。
[0035]②High-Q阴离子交换层析纯化
[0036] 取阴离子交换填料High-Q处理后装柱平衡，用20mmol/L的Tris-Cl缓冲液平衡直 至柱床pH和体积不变为止。根椐考马斯亮蓝法测出粗提抗体的浓度，将粗提抗体的浓度稀 释到60mg/mL，加样后在中高压蛋白质层析系统上平衡三倍的柱体积，然后用0.5mol/L的 NaCl按照梯度洗脱程序，分离纯化抗体。洗脱完毕后，参考洗脱曲线，收集抗体蛋白峰，用聚 乙二醇进行浓缩至需要体积，4°C或-20°C保存，经鉴定纯度合格，得成品。
[0037] D，多效过克隆抗体的应用
[0038] 上述步骤C制备的多克隆抗体可以应用到制备禽畜疾病综合防治药剂和禽畜免疫 增强药剂上，具有更加宽泛的抗病谱系，用于禽畜疾病综合防治和禽畜免疫增强，能够增强 禽畜机体免疫力，识别、中和、清除病原微生物及毒素，提高抗病能力。经过生产试用，其可 以有效的避免免疫失败、免疫抑制、免疫麻痹、免疫应激的发生，可广泛的应用于禽流行性 感冒、新城疫、法氏囊、鸡痘、传支、传喉、小鹅瘟、鸭病毒性肝炎、猪瘟、圆环病毒病、蓝耳病、 传染性胃肠炎、犊牛腹泻等禽畜疾病的预防和治疗。如下为在
【申请人】的养殖基地进行的对 比试验：
[0039] 临床试验1
[0040] 在河北维尔利动物药业中央研发基地，从内蒙古赤峰市鸡场购买的2000只北京AA 肉鸡，27日鸡龄时发病，病鸡约占 42%，病鸡表现为采食量下降，精神欠佳，羽毛松乱，鸡粪 含有未完全消化的黄色饲料。剖检显示腺胃乳头水肿，腺胃壁增厚呈球形，临床及剖检诊断 为腺胃炎。随机将鸡群分为2组，每组1000只，两组间差异不明显。第一组使用本发明制备的 药液饮水治疗（lOOOmL兑水200kg)，第二组采用西药常规青霉素+雷尼替丁饮水治疗(按20 万单位/kg ?日给药）。4天后统计结果，应用本发明的制剂比对照组治愈率提高了25.4%， 死亡率较对照组降低了33.4%;治愈率=(总只数-未治愈只数-死亡只数）/总只数X 100%，死亡率=死亡只数/总只数X 100%。
[0041 ]临床试验2
[0042]石家庄藁城区一养殖基地1540只，27日龄时发病，肉鸡表现为羽毛蓬乱，精神不 振，采食和饮水量均有明显下降，鸡粪呈白色或绿色，偶见未消化的饲料颗粒。剖检显示鸡 纤维肿大呈乒乓球状，腺胃硬，切开可见腺胃壁增厚，水肿，肠道表现出黏连。经诊断为腺胃 炎。随机将肉鸡分为2组，每组770只，两组间无明显差异。第一组为治疗组，采用本发明制备 的药物制剂进行拌料（1000ml拌料100kg)。第二组为对照组采用中国专利201510102336.3 的中药口服液拌料治疗。5天后统计结果，应用本发明的制剂比对照组治愈率提高了 6.3%， 死亡率较对照组降低了 6.6%;治愈率=(总只数-未治愈只数-死亡只数)/总只数X 100%， 死亡率=死亡只数/总只数X 100%。
[0043] 综上，本发明的多克隆抗体肽能与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变抗 原的状态或活性，同时本发明的多克隆抗体肽还具有一定的调理作用，对于预防和治疗特 定动物疾病具有较好的效果。
[0044] 上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一 限制条件。
【主权项】
1. 一种动物用多效多克隆抗体，其特征在于:其按照如下方法制备： A、 免疫原采用群组化的多元免疫原多肽，其至少包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3所示的免疫原多肽或者通过取代、缺失、和/或添加一个或几个氨基酸从SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3的序列中衍生的具有免疫原性的序列； B、 动物免疫，用步骤A的免疫原多肽免疫目标动物，取抗血清； C、 多克隆抗体的获得，分离并提纯步骤B所得抗血清免疫球蛋白，得多克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的动物用多效多克隆抗体，其特征在于:步骤A中，所述免疫原多 肽按照如下方法制备:首先通过PCR方法扩增免疫原多肽的结构基因，通过限制性内切酶将 免疫原多肽的结构基因与表达载体整合形成重组表达载体，将重组表达载体转入宿主细胞 诱导表达获得免疫原多肽。3. 根据权利要求1所述的动物用多效多克隆抗体，其特征在于:步骤B中，用步骤A的多 元免疫原多肽作为免疫原免疫新西兰大白兔，得抗血清。4. 根据权利要求1所述的动物用多效多克隆抗体，其特征在于:步骤C中，通过辛酸-硫 酸氨盐析法联合阴离子交换层析法对步骤B所得抗血清进行提取和纯化，得多克隆抗体。5. 权利要求1-4所述的多克隆抗体在制备禽畜疾病综合防治药剂和禽畜免疫增强药剂 中的应用。
【文档编号】A61K39/395GK105968194SQ201610355105
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】刘明, 陆安, 王晔娜, 贺丙强, 贾永兵
【申请人】河北普德动物药业有限公司