一种两亲性聚肽共聚物、自组装体及制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种新型两亲性聚肽共聚物，所述两亲性聚肽共聚物由油溶性聚肽和水溶性聚肽组成，是一种生物相容性好的两亲性物质。本发明还公开了所述两亲性聚肽共聚物的制备方法，以化学改性后的两种氨基酸衍生物为单体，通过N?羧基?α氨基酸酐开环聚合法(NCA?ROP)得到溶解性不同的两种均聚肽；再通过点击化学过程将两种均聚肽连接形成所述两亲性聚肽共聚物。本发明还公开了由所述两亲性聚肽共聚物制备得到的自组装体。本发明的制备方法操作简单、易行；制备的嵌段共聚物在药物释放、组织功能材料等领域有着巨大的应用前景。
【专利说明】
一种两亲性聚肽共聚物、自组装体及制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物材料、自组装材料技术领域，涉及一种新型两亲性聚肽共聚物及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]共聚物（copolymer)是指由两种或两种以上聚合物单元组成的大分子聚合物，又 称为共聚体。对于两嵌段共聚物来说，两个嵌段在溶剂中溶解能力具有较大差别的，称为两 亲性嵌段共聚物或双亲性嵌段共聚物。其中以亲水链段(Hydrophilic Chain)和疏水链段 (Hydrophobic Chain)组成的"亲水-亲油"型两嵌段共聚物最为常见，具有这种结构的聚合 物在水溶液中，往往会形成以亲油链段为核，以亲水链段为壳的有序结构，这是一种良好的 自组装材料，在药物的输送和释放、诊断影像学、纳米反应器等方面有着广泛的应用。
[0003] 聚肽是由氨基酸单体，通过羧基与氨基脱水缩合得到的一类高分子聚合物。根据 组成成分的不同，可将聚肽分成聚肽均聚物和聚肽嵌段共聚物。均聚物聚肽已经被广泛地 研究和报道，但嵌段聚肽的合成直到近几十年才逐渐被报道，可能是聚合方法限制了对复 杂结构聚肽的构建。嵌段聚肽又可以分成：1.嵌段均为聚肽结构的嵌段聚肽（block copolypepdite) ;2?嵌段中含有聚肽链段的杂化聚肽嵌段聚合物(polypeptide hybrid)。 从聚肽的结构上来看，由于肽链上存在着强烈的氢键作用，使得聚肽链能形成独特的二级 结构(a-螺旋或者折叠），赋予了聚肽许多优异的性能，在生物材料、自组装材料、组织功 能材料等领域有着巨大的应用前景。
[0004] 然而，受聚合方法、聚合物结构等的限制，在聚肽共聚物的合成中，往往以杂化嵌 段聚肽居多，而嵌段聚肽的报道并不多见，而且得到的产物分布指数宽，分子量较小，这限 制了嵌段聚肽的发展。
【发明内容】
[0005] 为克服现有技术的上述缺陷，本发明提出了一种两亲性嵌段聚肽及其制备方法， 本发明的方法简便易行，充分利用点击化学的优点，得到的两亲性嵌段聚肽的分布指数较 窄。本发明还提出了由所述两亲性聚肽共聚物制备的自组装材料，所述自组装材料具有有 序结构。
[0006] 本发明目的在于：1.提供一种新的制备方法，用其合成出一类新型结构的两亲性 聚肽共聚物，该类聚合物在生物材料、自组装材料、组织功能材料等领域的应用提供新的一 类两亲性聚肽共聚物材料。2.利用得到的两亲性聚肽共聚物制备了具有有序结构的聚肽自 组装材料，该类材料在药物的输送和释放等领域的应用提供新的一类自组装材料。
[0007] 本发明提出的两亲性聚肽共聚物，由油溶性聚肽嵌段(末端带有炔基的均聚肽： PBLG)和水溶性聚肽嵌段(末端带有叠氮基的均聚肽:PCysPEGMA)组成，即，由一个嵌段为油 溶性的聚肽，另一个嵌段为水溶性的聚肽组成，其化学结构如式(I)所示：
[0009]式（I)中，聚乙二醇的聚合度X为3-5;n = 20-80;m=10-30。
[0010] 优选地，聚乙二醇的聚合度x为4;n = 30;m=15
[0011]所述油溶性聚肽为聚(L-谷氨酸苄酯），结构如式(a)所示，
[0013] 其中，n = 2〇-8〇,优选地，n = 30。
[0014] 所述水溶性聚肽嵌段为聚半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，结构如式(b)所 示，
[0016] 其中，聚乙二醇的聚合度x为3-5;m=10-30;
[0017] 优选地，聚乙二醇的聚合度x为4;m=15。
[0018] 本发明的两亲性聚肽共聚物以化学改性后的两种氨基酸衍生物为单体，通过N-羧 基-a-氨基酸酐开环聚合法(NCA-R0P)得到了溶解性不同的两种均聚肽(均聚物），即式(a) 所示的油溶性聚肽和式(b)所示的水溶性聚肽;再通过点击化学过程(click chemistry)将 两种聚肽连接而形成两亲性嵌段聚肽材料。现有的制备氨基酸多肽的技术，主要通过分步 添加单体逐步开环聚合的方法。对比现有技术，本发明的实质性特点和优点在于：1.选择性 高，对于设计具有特定聚合度的两亲性聚氨基酸多肽具有较高的应用价值。在聚肽的合成 中，产物聚合度的控制往往较难。对于均聚物，通常利用NCA单体和引发剂的摩尔比来控制。 但是，对于多嵌段聚氨基酸多肽而言，现有技术需要先合成末端带有氨基的均聚肽，再以此 作为大分子引发剂，引发另一个氨基酸NCA单体聚合。在这个过程中，聚肽大分子引发剂的 量难以控制，因此难以控制另一个聚肽单元的聚合度。本发明提供的方法，可分别通过控制 小分子引发剂与NCA单体的摩尔比，设计得到具有特定聚合度的两种均聚肽，再通过点击化 学将两者结合，以得到特定聚合度的嵌段聚氨基酸多肽。2.产物的多分散指数(PDI)窄。相 比分步添加单体逐步开环聚合法，点击化学法制备的嵌段多肽PDI分布更窄。图2是利用本 发明方法制备的两亲性嵌段多肽凝胶渗透色谱(GPC)测试的数据，PDI = 1.30;图3是利用分 步添加单体逐步开环聚合的方法制备的两亲性聚氨基酸多肽的GPC测试数据，PDI = 1.65。 对比两者可知，利用本法制备的产物，分散指数明显变窄。3.适用性广。通过改变炔丙胺与 BLG-NCA单体的比例，1-叠氮-3-氨基丙烷与CysPEGMA-NCA单体的比例，可制备得到不同聚 合度的均聚肽PBLG/PCysPEGMA，再通过点击化学反应，得到不同聚合度组成的两亲性聚肽 共聚物。4.操作简单。在聚肽的合成过程中，NCA单体极易发生水解，因此对操作的要求特别 高，尤其在分步添加单体的过程中。本发明方法为合成两亲性聚肽共聚物提供了一种简便、 有效的方法。所述两亲性嵌段聚肽的分布指数较窄、生物相容性好。本发明两亲性聚肽共聚 物在自组装材料、组织功能材料、生物材料等方面存在着广泛的应用前景。
[0019] 本发明提出的两亲性聚肽共聚物的制备方法，包括均聚合和点击化学改性两个反 应：
[0020] (1)均聚合反应
[0021] i)所述油溶性聚肽制备过程为：
[0023]其中，n = 2〇-80;优选地，n = 30。
[0024]以L-谷氨酸苄酯-N羧基-a氨基酸酐为原料，在有机溶剂中，以炔丙胺为引发剂，反 应温度控制在60~80°C，反应时间为72-96小时，得到式(a)所示的油溶性聚肽。优选地，所 述反应温度为75°C ;所述反应时间为72小时。
[0025]其中，所述原料L-谷氨酸苄酯-N羧基-a氨基酸酐、炔丙胺的摩尔比为20-80:1;优 选地，为30:1。
[0026]所述有机溶剂选自四氢呋喃、二氧六环、N，N_二甲基甲酰胺或二甲亚砜溶剂;优选 地，为N，N-二甲基甲酰胺。
[0027] ii)所述水溶性聚肽制备过程为：
[0029] 其中，聚乙二醇的聚合度x为3-5;m=10-30。
[0030] 优选地，聚乙二醇的聚合度x为4;m=15。
[0031]以L-半胱氨酸(聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)-N羧基-a氨基酸酐为原料，在有机溶 剂中，以1-叠氮-3-氨基丙烷为引发剂，反应温度控制在45~75°C，反应时间为72-84小时， 得到式(b)所示的水溶性聚肽。优选地，所述反应温度为65°C;所述反应时间为72小时。 [0032]其中，所述原料L-半胱氨酸（聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)-N羧基-a氨基酸酐、1-叠氮-3-氨基丙烷的摩尔比为10-30:1;优选地，为15:1。
[0033]其中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、二氧六环、N，N_二甲基甲酰胺或二甲亚砜;优 选地，为四氢呋喃。
[0034] (2)点击化学反应
[0036] 其中，聚乙二醇的聚合度x为3-5 ;m= 10-30 ;n = 20-80。
[0037] 优选地，聚乙二醇的聚合度x为4;n = 30;m=15。
[0038]向有机溶剂中加入步骤(1)制备的油溶性聚肽和水溶性聚肽，除去体系中的氧，再 加入由溴化亚铜、N，N，Y，V，N〃 -五甲基二乙基三胺组成的催化体系，反应温度控制在40~ ll〇°C，反应时间为20-70小时，得到所述两亲性聚肽共聚物。
[0039]其中，所述催化体系的组成为溴化亚铜，N〃_五甲基二乙基三胺的摩尔 比为1:1~1.5;优选地，两者的摩尔比为1:1.2。
[0040]其中，步骤（1)制备的油溶性聚肽和水溶性聚肽、催化体系的摩尔比为1:1~1.5:1 ~1.5;优选地，为1:1.2:1.2。
[0041]其中，所述有机溶剂选自四氢呋喃、二氧六环或N，N-二甲基甲酰胺;优选地，为N，N 二甲基甲酰胺。
[0042]本发明反应机理:本发明分别以两种不同的氨基酸衍生物为原料，以两种特定的 伯胺为引发剂，利用N-羧基-a氨基酸酐开环聚合法(NCA法)制备了末端带有炔基的均聚肽 PBLG和末端带有叠氮基的均聚肽PCysPEGMA。其次，利用"炔基-叠氮基"点击化学反应，选择 性的使用溴化亚铜、，N〃-五甲基二乙基三胺为催化体系，制备两亲性聚肽共聚物 PBLG-b-PCysPEGMA。
[0043]现有的制备氨基酸多肽的技术，主要通过分步添加单体逐步开环聚合的方法。对 比现有技术，本发明的实质性特点和优点在于：1.选择性高，对于设计具有特定聚合度的两 亲性聚氨基酸多肽具有较高的应用价值。在聚肽的合成中，产物聚合度的控制往往较难。对 于均聚物，通常利用NCA单体和引发剂的摩尔比来控制。但是，对于多嵌段聚氨基酸多肽而 言，现有技术需要先合成末端带有氨基的均聚肽，再以此作为大分子引发剂，引发另一个氨 基酸NCA单体聚合。在这个过程中，聚肽大分子引发剂的量难以控制，因此难以控制另一个 聚肽单元的聚合度。本发明提供的方法，可分别通过控制小分子引发剂与NCA单体的摩尔 比，设计得到具有特定聚合度的两种均聚肽，再通过点击化学将两者结合，以得到特定聚合 度的嵌段聚氨基酸多肽。2.产物的多分散指数(PDI)窄。相比分布添加单体逐步开环聚合 法，点击化学法制备的嵌段多肽PDI分布更窄。相比分布添加单体逐步开环聚合法，点击化 学法制备的嵌段多肽PDI分布更窄。如下图所示：图2是利用本发明方法制备的两亲性嵌段 多肽凝胶渗透色谱(GPC)测试的数据，PDI = 1.30;图3是利用分步添加单体逐步开环聚合的 方法制备的两亲性聚氨基酸多肽的GPC测试数据，PDI = 1.65。对比两者可知，利用本法制备 的产物，分散指数明显变窄。3 .适用性广。通过改变炔丙胺与BLG-NCA单体的比例，1-叠氮-3_氨基丙烷与Cy sPEGMA-NCA单体的比例，可制备得到不同聚合度的均聚肽PBLG/ PCysPEGMA，再通过点击化学反应，得到不同聚合度组成的两亲性聚肽。4.操作简单。在聚肽 的合成过程中，NCA单体极易发生水解，因此对操作要求特别高，尤其在分步添加单体的过 程中。本发明方法为合成两亲性聚氨基酸多肽提供了一种简便、有效的方法。
[0044]在一具体的实施方式中，所述两亲性嵌段聚肽共聚物的制备方法为：以化学改性 后的两种氨基酸衍生物为单体，通过N-羧基_a氨基酸酐开环聚合法(NCA-R0P)得到了溶解 性不同的两种均聚肽;再通过点击化学过程(click chemistry)将两种聚肽连接而形成两 亲性嵌段聚肽材料。
[0045] 氮气保护下，将L-谷氨酸苄酯3.018，（12.6臟〇1)、三光气1.328，（4.2111111〇1)和乙酸 乙酯90ml加入到装有冷凝回流管干燥的250ml三口瓶中，于85°C的油浴中回流搅拌反应至 体系澄清透明，反应时间大约5小时左右。停止反应并冷却至室温后，用冰水及冰碳酸氢钠 溶液洗至中性并用无水硫酸钠干燥。用石油醚重结晶，真空干燥，得到白色固体L-谷氨酸苄 酯-N-羧基内酸酐(BLG-NCA)产率48%。
[0046] 在干燥的50ml双口瓶中加入1.6(^(6.1111111〇1)81^-%六单体以及161111干燥的01^溶 剂，通氮除氧60mins。加入5yl的炔丙胺，引发聚合。避光反应72hours。反应结束后，甲醇沉 淀，重复操作3遍，得到白色固体聚(L-谷氨酸苄酯），产率80 %。
[0047] 在100ml带有磁子的单口瓶中加入6.0g(50mmol)L-半胱氨酸并溶于60ml去离子 水，用lmol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至6~9。向体系中加入聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸 酯(Mn = 300)16.12g(53mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，乙酸乙酯萃取并保留水层产物。 冷冻干燥，得到白色膏状固体L-半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯（CysTOGMA)，产率 90% 〇
[0048] 氮气保护下，将CysPEGMA 7 ? 41g( 18 ? 6mmol)、三光气 1 ? 81g，（6 ? 2mmol)和 150ml干 燥的THF加入到装有冷凝回流管干燥的250ml三口瓶中，于60°C的油浴中回流搅拌反应至体 系澄清透明，反应时间大约8小时左右。停止反应并冷却至室温后，用正己烷沉淀并真空干 燥，得到黄褐色膏状固体L-谷氨酸苄酯-N-羧基内酸酐(PCysPEGMA-NCA)5.62g，产率71 %。
[0049] 在100ml带有磁子的双口烧瓶中，加入5.04g(l 1.9mmol)CysPEGMA-NCA并溶于50ml 干燥的THF溶剂，通氮除氧60mins。使用微量进样器向体系中加入22yl的1-叠氮-3氨基丙烷 引发聚合。避光通氮反应72h 〇Urs。反应结束后，提浓，用正己烷沉淀，得到黄色粗产物。真空 干燥后将粗产品溶于水，透析3天。最后，使用"冷冻干燥法"得到黄色固体聚(L-半胱氨酸聚 乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯），产率82 %。
[0050] 在20ml干燥的试管中，依次加入已经制备好的PBLG 0.20g(lequiv)，PCysPEGMA 0.25g(l .4equiv)，提纯过的溴化亚铜44mg(lequiv)，并溶于5ml干燥的DMF中。通氮除氧 30mins后加入配体N，N，Y，N〃-五甲基二乙基三胺(PMDETA)6.4yl并密封试管，转入50°C 的油浴锅，避光反应70hourS。反应结束后，淬冷。产物用甲醇沉淀并抽滤。重复操作3遍以后 真空干燥1 OOhours，得到淡黄色固体颗粒，产率70 %。
[0051]本发明的制备方法简便易行，充分利用点击化学的优点；现有的制备氨基酸多肽 的技术，主要通过分步添加单体逐步开环聚合的方法。对比现有技术，本发明的实质性特点 和优点在于：1.选择性高，对于设计具有特定聚合度的两亲性聚氨基酸多肽具有较高的应 用价值。在聚肽的合成中，产物聚合度的控制往往较难。对于均聚物，通常利用NCA单体和引 发剂的摩尔比来控制。但是，对于多嵌段聚氨基酸多肽而言，现有技术需要先合成末端带有 氨基的均聚肽，再以此作为大分子引发剂，引发另一个氨基酸NCA单体聚合。在这个过程中， 聚肽大分子引发剂的量难以控制，因此难以控制另一个聚肽单元的聚合度。本发明提供的 方法，可分别通过控制小分子引发剂与NCA单体的摩尔比，设计得到具有特定聚合度的两种 均聚肽，再通过点击化学将两者结合，以得到特定聚合度的嵌段聚氨基酸多肽。2.产物的多 分散指数(PDI)窄。相比分布添加单体逐步开环聚合法，点击化学法制备的嵌段多肽PDI分 布更窄。相比分布添加单体逐步开环聚合法，点击化学法制备的嵌段多肽roi分布更窄。如 下图所示：图2是利用本发明方法制备的两亲性嵌段多肽凝胶渗透色谱(GPC)测试的数据， PDI = 1.30 ;图3是利用分步添加单体逐步开环聚合的方法制备的两亲性聚氨基酸多肽的 GPC测试数据，PDI = 1.65。对比两者可知，利用本法制备的产物，分散指数明显变窄。3.适用 性广。通过改变炔丙胺与BLG-NCA单体的比例，1-叠氮-3-氨基丙烷与CysPEGMA-NCA单体的 比例，可制备得到不同聚合度的均聚肽PBLG/PCysPEGMA，再通过点击化学反应，得到不同聚 合度组成的两亲性聚肽。4.操作简单。在聚肽的合成过程中，NCA单体极易发生水解，因此对 操作要求特别高，尤其在分步添加单体的过程中。本发明方法为合成两亲性聚氨基酸多肽 提供了一种简便、有效的方法。
[0052]本发明还提出了一种自组装体，所述自组装体是具有有序结构的自组装材料，由 上述的两亲性聚肽共聚物自组装形成，具有亲水-亲油结构;为碗状胶束、柱状胶束、梭型片 层胶束。与现有的技术相比，其特点在于：1.自组装材料通常由两亲性小分子(如十二烷基 硫酸钠等)或两亲性的嵌段共聚物(如PE〇-b-PS等)构成。以两亲性聚氨基酸多肽为自组装 前体，能够形成有序自组装材料却并不多见。2 .对于自组装体，尤其是胶束，具有特殊的亲 水-亲油结构，是一种良好的潜在药物载体材料。然而，目前常见的非聚肽类自组装前体材 料存在着生物相容性差，毒性大等缺点，限制了这种材料的发展。聚肽，作为构成生命物质 蛋白质的重要组成部分，具有其它材料所不具备的优异的生物相容性，以其作为自组装前 体材料，有望解决其在药物载体等应用领域的难题。
[0053]本发明还提出了由所述两亲性嵌段聚肽共聚物制备得到的自组装体的制备方法， 包括:将所述两亲性嵌段聚肽共聚物溶解在有机溶剂中，形成共聚物的稀溶液，向其中滴入 共聚物的稀溶液的1~2倍体积的水，滴加速率为1~5ml/min;加过量的超纯水淬灭;通过透 析将多余有机溶剂除去，得到所述自组装体。所述自组装体是具有有序结构的自组装材料： 有机溶剂为四氢呋喃时，所述自组装体为碗状胶束，球形的胶束的某一面塌陷而形成了碗 型的胶束结构，经过测量，自组装体的平均粒径为55nm，碗型胶束的塌陷方向不一;有机溶 剂为N，N-二甲基甲酰胺时，所述自组装体为柱状胶束，管状胶束之间相互连接、重叠，并含 有镂空部分，形成了类似于空间网状结构;有机溶剂为1，4_二氧六环时，所述自组装体为梭 型片层胶束，其结构中间宽，两头窄，并在两端有较为突出的毛刺状，经测量，胶束的平均长 度为600nm，宽度平均为200nm。其中，所述"过量"是指聚合物稀溶液加水自组装后，溶液体 积的5~10倍。
[0054]其中，所述"透析"的条件为选择透析袋的截留分子量为3500Da，材质为再生纤维 素酯。
[0055]其中，所述两亲性嵌段聚肽共聚物、有机溶剂的质量比：1000-3000:1;优选地，为 2000:1〇
[0056]其中，所述有机溶剂选自四氢呋喃，N，N_二甲基甲酰胺或1，4_二氧六环溶剂。
[0057] 1~5ml/min的滴加速率是非常重要的技术手段，若速率超出这一范围，难以得到 有序的自组装结构。如图6所示，是溶解在THF中的嵌段多肽，以8ml/min的速率滴加超纯水 所得到自组装体的TEM图，其结构并不规整。图8是溶解在Dioxane中的嵌段多肽，以10ml/ min的速率滴加超纯水所得到自组装体的TEM图，其结构并不规整。
[0058]本发明还提出了式（I)所示的两亲性聚肽共聚物在制备自组装材料、组织功能材 料、生物材料中的应用。其中，所述自组装材料、组织功能材料、生物材料用于药物的输送和 释放。
[0059] 本发明还提出了式(I)所示的两亲性聚肽共聚物或所述的自组装体在药物的输送 和释放中的应用。
[0060] 本发明还提出了制备的自组装体在药物的输送和释放等方面存在着广泛的应用 前景。
【附图说明】
[0061 ]图1为新型两亲性聚肽共聚物(PBLG-b-PCysPEGMA)的核磁共振氢图。
[0062] 图2为新型两亲性聚肽共聚物(PBLG-b-PCysPEGMA)的GPC图谱
[0063] 图3为利用分步添加单体逐步开环聚合的方法制备的两亲性聚氨基酸多肽的GPC 测试数据，PDI = 1.65。
[0064] 图4为溶解在N，N_二甲基甲酰胺中的新型两亲性聚肽共聚物形成的自组装体的透 射电镜图。
[0065] 图5为溶解在四氢呋喃中的新型两亲性聚肽共聚物形成的自组装体的透射电镜 图。
[0066] 图6为溶解在四氢呋喃中的新型两亲性聚肽共聚物形成的自组装体的透射电镜 图；滴加超纯水的速率为8ml/min，其为不规整结构。
[0067] 图7为溶解在1，4_二氧六环中的新型两亲性聚肽共聚物形成的自组装体的透射电 镜图。
[0068] 图8为溶解在1，4_二氧六环中的新型两亲性聚肽共聚物形成的自组装体的透射电 镜图。
[0069] 滴加超纯水的速率为10ml/min，其为不规整结构。
【具体实施方式】
[0070] 结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、 条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发 明没有特别限制内容。
[0071] 实施例1两亲性聚肽共聚物的制备
[0072]通过三光气法将L-谷氨酸苄酯转变成单体L-谷氨酸苄酯-N-羧基内酸酐，以炔丙 胺为引发剂、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，通过溶液开环聚合法，制备聚（L-谷氨酸苄 酯），即PBLG。通过"巯基-乙烯"点击化学反应将L-半胱氨酸与聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯 反应，得到L-半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(CysPEGMA)，再通过三光气法将其转变 为单体L-半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯-N-羧基内酸酐，以1 -叠氮-3-氨基丙烷为引 发剂，四氢呋喃为溶剂，通过开环聚合法，制备聚（L-半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸 酯），即PCysPEGMA。再将均聚物PBLG和PCysPEGMA溶于DMF中，除去体系中的氧，加入由溴化 亚铜、N，N，NW，N〃 -五甲基二乙基三胺(PMDETA)组成的催化体系后，通过"点击化学"反应 得到新型两亲性聚肽共聚物。
[0073] 氮气保护下，将L-谷氨酸苄酯3.018，（12.6臟〇1)、三光气1.328，（4.2111111〇1)和乙酸 乙酯90ml加入到装有冷凝回流管干燥的250ml三口瓶中，于85°C的油浴中回流搅拌反应至 体系澄清透明，反应时间大约5小时左右。停止反应并冷却至室温后，用冰水及冰碳酸氢钠 溶液洗至中性并用无水硫酸钠干燥。用石油醚重结晶，真空干燥，得到白色固体L-谷氨酸苄 酯-N-羧基内酸酐(BLG-NCA)产率48%。
[0074] 在干燥的50ml双口瓶中加入1.6(^(6.1111111〇1)81^-%六单体以及161111干燥的01^溶 剂，通氮除氧60mins。加入5yl的炔丙胺，引发聚合。避光反应72hours。反应结束后，甲醇沉 淀，重复操作3遍，得到白色固体聚(L-谷氨酸苄酯），产率80 %。
[0075] 在100ml带有磁子的单口瓶中加入6.0g(50mmol)L-半胱氨酸并溶于60ml去离子 水，用lmol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH至6~9。向体系中加入聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸 酯(Mn = 300)16.12g(53mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，乙酸乙酯萃取并保留水层产物。 冷冻干燥，得到白色膏状固体L-半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯（CysTOGMA)，产率 90% 〇
[0076] 氮气保护下，将CysPEGMA 7 ? 41g( 18 ? 6mmol)、三光气 1 ? 81g，（6 ? 2mmol)和 150ml干 燥的THF加入到装有冷凝回流管干燥的250ml三口瓶中，于60°C的油浴中回流搅拌反应至体 系澄清透明，反应时间大约8小时左右。停止反应并冷却至室温后，用正己烷沉淀并真空干 燥，得到黄褐色膏状固体L-谷氨酸苄酯-N-羧基内酸酐(PCysPEGMA-NCA)5.62g，产率71 %。
[0077] 在100ml带有磁子的双口烧瓶中，加入5.04g(l 1.9mmol)CysPEGMA-NCA并溶于50ml 干燥的THF溶剂，通氮除氧60mins。使用微量进样器向体系中加入22yl的1-叠氮-3氨基丙烷 引发聚合。避光通氮反应72h 〇Urs。反应结束后，提浓，用正己烷沉淀，得到黄色粗产物。真空 干燥后将粗产品溶于水，透析3天。最后，使用"冷冻干燥法"得到黄色固体聚(L-半胱氨酸聚 乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯），产率82 %。
[0078] 在20ml干燥的试管中，依次加入已经制备好的PBLG 0.20g(lequiv)，PCysPEGMA 0.25g(l .4equiv)，提纯过的溴化亚铜44mg(lequiv)，并溶于5ml干燥的DMF中。通氮除氧 30mins后加入配体N，N，Y，N〃-五甲基二乙基三胺(PMDETA)6.4yl并密封试管，转入50°C 的油浴锅，避光反应70hourS。反应结束后，淬冷。产物用甲醇沉淀并抽滤。重复操作3遍以后 真空干燥1 OOhours，得到淡黄色固体颗粒，产率70 %。
[0079]如图1所示，图1是两亲性聚肽共聚物一聚L-谷氨酸苄酯-聚(L-半胱氨酸聚乙二醇 甲醚甲基丙烯酸酯），即TOLG-b-PCysPEGMA的核磁共振氢谱，其特征峰（7.25，5.06，3.75， 3.50，1.25，0.15ppm)及其对应的积分面积比证明了 PBLG-b-PCysPEGMA共聚物的成功合成。
[0080] 如图2所示，图2是两亲性聚肽共聚物一聚L-谷氨酸苄酯-聚(L-半胱氨酸聚乙二醇 甲醚甲基丙烯酸酯），即PBLG-b-PCysPEGMA的GPC图谱，通过图谱可以看出聚合物具有较窄 的分布指数(PDI = 1.30)。
[0081] 图3是利用分步添加单体逐步开环聚合的方法制备的两亲性聚氨基酸多肽的GPC 测试数据，PDI = 1.65。对比两者可知，利用本发明方法制备的产物，分散指数明显变窄。所 述"分布添加单体逐步开环聚合的方法"是指：以L-半胱氨酸（聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸 酯)-N羧基-a氨基酸酐（g卩Cy sPEGMA-NCA)为单体，以正丁胺为引发剂，通过NCA开环聚合法 制得末端含有氨基的均聚肽PCysPEGMA-NH 2。然后，以此作为大分子引发剂，引发L-谷氨酸 苄酯-N-羧基内酸酐（即BLG-NCA)单体聚合，得到两嵌段聚肽PBLG-b-PCysPEGMA。如下所示：
[0083] 具体步骤如下：
[0084]首先使用正丁胺作为小分子引发剂，引发CysPEGMA-NCA开环聚合得到均聚物 PCy sPEGMA。将 1 ? 31 g (3 ? 09mmo 1) Cy sPEGMA-NCA溶于 13ml 干燥的 THF溶剂中，通氮除氧 30mins。使用微量进样器，向体系中加入6111(0.06181111]1〇1)的正丁胺引发聚合。通氮避光条 件下反应12hours。其次，使用PCysPEGMA-NH 2作为大分子引发剂，引发聚合BLG-NCA单体。在 Cy sPEGMA-NCA 开环聚合反应至 12hour s时，称量 BLG-NCA 单体 1.22g (4.6mmo 1)，溶解在 12ml 干燥的THF中，通氮除氧后，迅速从CysPEGMA-NCA开环聚合的反应体系中取3ml液体加入本 体系，引发BLG-NCA聚合。室温避光反应72hourS。反应结束后，甲醇沉淀，得到浅黄色絮状沉 淀，抽滤得到粗产品。将粗产品用THF溶解后，甲醇沉淀。重复操作两次，进一步提纯产物。真 空干燥，得到黄色固体颗粒，产率56 %。
[0085]实施例2两亲性聚肽共聚物自组装材料的制备
[0086] 将实施例1制备的两亲性聚肽共聚物TOLG-b-PCysPEGMA以0.5mg/ml的浓度分别溶 解在01^、1'册、1，4-01(?&116中。将一定量的水以11111/111111的速率滴加到配置好的聚合物的稀 溶液中。滴加完成后，快速滴加大量的超纯水淬灭。透析3天后收集产品。
[0087]图4是由溶解在DMF中的聚合物制备的自组装材料，其结构是规则的管状胶束，管 状胶束之间相互连接、重叠，并有镂空部分出先，形成了类似于空间网状结构。图5是溶解在 四氢呋喃(THF)中的聚合物制备的自组装材料，其结构是规则的碗状胶束，为球形的胶束的 某一面塌陷而形成了碗型的胶束结构，经过测量，自组装体的平均粒径为55nm，碗型胶束的 塌陷方向不一。
[0088]其他条件相同，两亲性聚肽共聚物TOLG-b-PCysPEGMA溶解在四氢呋喃中，当滴加 超纯水的速率为8ml/min时，图6为两亲性聚肽共聚物形成的自组装体的透射电镜图，由图 可知，其为不规整结构，其包括部分碗装结构以及部分模糊的尚未形成有序排列的自组装 体。
[0089]图7是溶解在l，4-Dioxane中的聚合物制备的自组装材料，其结构是规则的梭型片 状胶束，其结构中间宽，两头窄，并在两端有较为突出的毛刺状;经测量，胶束的平均长度为 600nm，宽度平均为200nm。
[0090] 其他条件相同，两亲性聚肽共聚物PBLG-b-PCySPEGMA溶解在1，4_二氧六环中，当 滴加超纯水的速率为l〇ml/min时，图8为两亲性聚肽共聚物形成的自组装体的透射电镜图， 由图可知，其为不规整结构，包括4个相互连接的、衬度较高的、类似于球形的结构，但由于 其结构模糊，尚未能形成完整的胶束；同时，在其周围有类似于针形的片层结构，但是其并 不完整、独立，分布也不均一，亦未能形成有序的自组装体。
[0091] 本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本 领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保 护范围。
【主权项】
1. 一种两亲性聚肤共聚物，其特征在于，所述两亲性聚肤共聚物包括油溶性聚肤嵌段 和水溶性聚肤嵌段，其结构如式(I)所示：式（I)中，聚乙二醇的聚合度X为3-5;m=10-30;n = 20-80。2. 根据权利要求1所述的两亲性聚肤共聚物，其特征在于，所述两亲性聚肤共聚物W化 学改性后的两种氨基酸衍生物为单体，通过N-簇基-α-氨基酸酢开环聚合法得到溶解性不 同的两种均聚肤;再通过点击化学过程将两种均聚肤连接形成所述两亲性聚肤共聚物。3. -种两亲性聚肤共聚物的制备方法，其特征在于，包含均聚合反应、点击化学改性反 应： (1)均聚合反应： i) 油溶性聚肤的制备： 谷氨酸节醋-N簇基-α氨基酸酢为原料，在有机溶剂中，W烘丙胺为引发剂，反应溫 度控制在60~80°C，反应时间为72-96小时，得到式(a)所示的油溶性聚肤，如反应式（1)所 示；其中，n = 20-80; ii) 水溶性聚肤的制备： Wレ半脫氨酸（聚乙二醇甲酸甲基丙締酸醋）-膊多基-α氨基酸酢为原料，在有机溶剂 中，W1-叠氮-3-氨基丙烷为引发剂，反应溫度控制在45~75 °C，反应时间为72-84小时，得 到式(b)所示的水溶性聚肤，如反应式(2)所示；其中，聚乙二醇的聚合度X为3-5;m=10-30; (2)点击化学改性反应： 向有机溶剂中加入步骤（1)制备的油溶性聚肤和水溶性聚肤，除去体系中的氧，再加入 由漠化亚铜、N，N，N/，沪，N"-五甲基二乙基Ξ胺组成的催化体系，反应溫度控制在40~110 °C，反应时间为20-70小时，得到所述两亲性聚肤共聚物，如反应式(3)所示；其中，聚乙二醇的聚合度X为3-5;m=10-30;n = 20-80。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)油溶性聚肤的制备中，所 述原料k谷氨酸节醋-N簇基-α氨基酸酢、烘丙胺的摩尔比为20~80:1。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)水溶性聚肤的制备中，所 述原料心半脫氨酸（聚乙二醇甲酸甲基丙締酸醋)-膊多基-曰氨基酸酢、1-叠氮-3-氨基丙烷 的摩尔比为10-30:1。6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述油溶性聚肤和水 溶性聚肤、催化体系的摩尔比为1:1~1.5:1~1.5。7. -种自组装体，其特征在于，所述自组装体由如权利要求1所述的两亲性聚肤共聚物 自组装形成，具有亲水-亲油结构;为碗状胶束、柱状胶束、梭型片层胶束结构。8. -种自组装体的制备方法，其特征在于，将如权利要求1所述的两亲性聚肤共聚物溶 解在有机溶剂中，形成共聚物的稀溶液，向其中滴入共聚物的稀溶液的1~2倍体积的水，滴 加速率为1~5ml/min;加过量的超纯水泽灭;通过透析将多余有机溶剂除去，得到如权利要 求7所述的自组装体。9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述自组装体，具有有序结构的自组 装材料，当有机溶剂为N，N-二甲基甲酯胺时，得到的自组装体为柱状胶束；当有机溶剂为四 氨巧喃时，得到的自组装体为碗状胶束；当有机溶剂为1,4-二氧六环时，得到的自组装体为 梭型片层胶束。10. 根据权利要求1或2所述式（I)所示的两亲性聚肤共聚物在制备自组装材料、组织功 能材料、生物材料中的应用。11. 根据权利要求1或2所述式（I)所示的两亲性聚肤共聚物或根据权利要求7所述的自 组装体在药物的输送和释放中的应用。
【文档编号】A61K47/42GK105968367SQ201610303977
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】贺小华, 陈宇翔, 张盈, 姬翠红, 林雪
【申请人】华东师范大学