一株具有耐铅能力的棘孢木霉的制作方法
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，涉及到了一株从重金属污染土壤中分离得到的一株对重金属铅具有耐受能力的菌株，对其从形态学及分子生物学角度进行鉴定后，确定其为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，并将其命名为ZZY，于2016年01月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.12071，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。除此以外，还用固体发酵的方法对菌株进行固体发酵，得到发酵产物后，利用发酵产物对其降低植物中重金属铅含量的功能进行了研究。CGMCC No.1207120160114
【专利说明】
一株具有耐铅能力的棘孢木霉
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及到了一株从重金属污染土壤中分离得到的一株 对重金属铅具有耐受能力的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，并研究了其修复铅污染 土壤、降低植物中铅含量的功能。
【背景技术】
[0002] 铅是重金属污染土壤中分布较广、具强蓄积性的环境污染物。土壤中铅的天然来 源是风化岩石中的矿物。多年来，尽管人们对三废(废气、废水、废渣）的排放已采取严格的 控制措施，然而，由于频繁的人类活动，随着矿山开采、金属冶炼加工、IT制造、生活污水排 放、污水灌溉、污泥使用以及含铅汽油的使用，铅已成为土壤污染的主要元素之一。目前，已 有许多学者对铅污染状况进行了多年研究。我国各个地区均有不同程度的铅污染现象，铅 中毒事件也频频发生。大气、水体和土壤等环境要素中均存在铅污染的情况，但相比于大气 和水体而言，土壤中铅污染现象更为普遍。全国土壤背景值基本统计量的结果表明，我国土 壤铅含量最高可达1143yg/g，最低为0.68yg/g，平均可达到26yg/g。进入土壤中的铅大多存 在于表土层，几乎不向下移动。铅在土壤中易与有机物结合，极不易溶解。过量的铅会阻滞 作物生长发育，主要表现为叶绿素下降，阻碍植物的呼吸及光合作用，从而降低产量和质 量。铅具有强累积性，通过食物链的富集，人体中的铅能与多种酶结合从而干扰有机体多方 面的生理活动，严重损害人的神经、消化、免疫和生殖系统，对人类健康造成威胁。研究表 明，人体中约80%的铅来自饮食吸收。在甲田善生的重金属毒性表中，铅排在常见的具有潜 在毒性元素的第三位。此外，铅还可能是一种致癌物质。根据对铅致癌性的动物实验和人群 研究，美国环保局认为铅是"可能的人类致癌物"。土壤铅污染具有隐蔽性、长期性和不可逆 性等特点，已经受到广泛关注，铅污染土壤的高效修复技术一直是研究的热点与难点。土壤 铅污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性等特点，已经受到广泛关注，铅污染土壤的高效修复 技术一直是研究的热点与难点。目前，铅污染土壤的修复技术大体可分为两类:物理化学修 复技术和生物修复技术。生物修复又可分为微生物修复法和植物修复法。利用微生物来减 轻或消除重金属污染，国内外已有许多相关报道。铅污染土壤的微生物修复是利用微生物 对铅的吸附、沉淀、氧化和还原等作用，降低土壤中铅的毒性。
[0003] 木霉菌在生物防治和环境保护领域具有巨大的应用前景，对多种病原微生物引起 的病害具有很好的防治效果，是目前研究较多、应用较广泛的生防菌之一。其中棘孢木霉是 一株在生物防治功能方面研究较多的一种菌。公开号CN 102911878 A的发明公开了一株 对辣椒疫霉菌具有显著拮抗作用的棘孢木霉，该菌株可以明显寄生于辣椒疫霉菌，能有效 降解辣椒疫霉菌的菌丝体，用该菌制备得到的生防制剂，可有效防治辣椒疫病。公开号CN 102888350 A的发明公开了一株拮抗土传病害的棘孢木霉，用它生产生物农药，能够有效防 治土传病害，保证农作物、蔬菜产量的稳定生长。除了生物防治功能以外，棘孢木霉还具有 其他方面的功能。公开号为CN 104450530 A的发明，涉及一株高产复合纤维素降解酶的棘 孢木霉，该菌株生长速度快，产孢能力强，可以以多种纤维素类材料为底物，将其应用于有 机垃圾中可减少垃圾堆肥产生的渗透压，提高垃圾中纤维素类物质的降解效率，提高垃圾 堆肥产品的质量。公开号CN 102191180 A的公布了一株从砷污染土壤样品中分离得到的一 株耐砷的棘孢木霉，这一菌株制成微生物制剂，应用于污染土壤和环境中后，可以通过菌株 的富集和挥发作用，能在一定程度上降低土壤中砷的含量。但是目前为止，对于棘孢木霉对 重金属铅有耐受能力的发明还鲜有公开。
[0004] 本发明主要涉及一株对重金属铅具有耐受能力的棘孢木霉，这一菌株分离湖南省 怀化市洪江区被重金属污染的土壤，且所用土壤是由赤红壤发育而来的菜地土壤。所分离 的菌株对重金属铅具有优良的耐受和吸附能力，可以降低植物中铅的含量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是对从重金属污染的土壤中分离得到的一株对重金属铅有耐受能 力的菌株进行了生物学鉴定，并对其修复铅污染土壤并减少植物中铅含量方面的应用进行 了研究。
[0006] 本发明涉及的菌株，对重金属铅具有耐受性。该菌株具有以下性质:PDA培养基上 28-30 °C培养4d，菌落直径30-40mm，菌落稍隆起，菌落中心绿色，边缘白色，质地絮状，边缘 不整齐，有明显的放射状皱纹，表面无渗出液，反面与正面同色，培养7d，菌落直经50-55mm， 菌落中心绿色，边缘浅绿色，边缘不整齐，质地絮状，表面无渗出液，反面与正面同色孢子以 弹射的方式向外扩散，在培养基上形成同心环。光学显微镜下显示其营养菌丝壁光滑，直径 1.5-3. Ιμπι，菌丝有隔和分枝，分生孢子梗光滑，基部膨大，顶部锥形变细，分生孢子自顶向 下呈圆形或椭圆形，（2.0-2.3)μπιΧ (1.6-2.7)μπι; ITS序列进化分析显示该菌株为棘孢木霉 (Trichoderma asperellum)，因此将其命名为棘孢木霉ZZY，于2016年01月14日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 12071，保藏单位 地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 用上述棘孢木霉ZZY，经固体发酵得到固体发酵产物，将发酵产物混合于铅污染土 壤中，并在其中种植小白菜，收获小白菜后分别检测小白菜地下根部及地上可食部分的干 重和铅含量。实验结果得出棘孢木霉ZZY不仅可以提高铅污染土壤中所种植植物的生物 量，而且还可以降低植物中的铅含量。
【附图说明】
[0008] 图1是具有耐铅能力的棘孢木霉的菌落形态。
【具体实施方式】
[0009] 实施例1:棘孢木霉的分离与鉴定
[0010] PDA固体培养基：马铃薯200.00g，蔗糖20 ·00g，琼脂15·00-20 ·00g，蒸馏水1000mL， pH自然，121°C高压灭菌20min。瞭凉后分装于平皿中，待用。
[0011] Pb(N03)2溶液:采用分析纯Pb(N03)2试剂，准确称取48.0000g的硝酸铅粉末，用去 离子水定容至30.0000g/L的硝酸铅母液，然后过0.22um的滤膜，于4°C箱保存备用，此溶液 用于加入PDA固体培养基中制备不同Pb2+浓度的含铅培养基。
[0012] 1)筛选和驯化微生物
[0013] 准确称取10g被重金属污染的土样加入到90mL加有玻璃珠的无菌水中，150r/min 充分振荡lOmin，待孢子分散后，静置5min取上清液，经过梯度稀释后分别涂布到含Pb2+质量 浓度为200mg/L的PDA固体培养基中，每个平板做三个平行。培养温度为28-30°C，培养3-5d。 菌种经过培养后再依次接种于含Pb 2+质量浓度更高的固体培养基中（400mg/L、600mg/L、 800mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L、3000mg/L 和 3500mg/L)，继续培养。如此 通过不断提高培养基中的Pb2+质量浓度，从而对土壤中的耐受重金属的菌株进行逐级驯化。
[0014] 2)菌株的分离与纯化
[0015] 采用对Pb2+耐受性最高的菌株，在无菌操作条件下，挑取单个菌落的边缘在无重金 属的固体培养基上划线分离，培养5d后，观察菌落形态。为了使菌株更加纯化，用平板培养 基再转接分离3次。
[0016] 3)微生物的富集培养与保存
[0017] 为了使菌株能更好更长久地保持活性，取平板上分散的单菌落，在无菌操作下，用 接种环挑取少量菌种接种在PDA试管斜面富集培养基中，置于28-30°C生化培养箱中培养5d 后，保存在4°C冰箱中，以备后续研究使用。
[0018] 4)菌株的鉴定
[0019]在光学显微镜下，对纯化的菌株进行形态观察。用ITS鉴定法对其从分子学角度进 行鉴定。
[0020] 菌株PDA培养基上28-30°C培养4d，菌落直径30-40mm，菌落稍隆起，菌落中心绿色， 边缘白色，质地絮状，边缘不整齐，有明显的放射状皱纹，表面无渗出液，反面与正面同色， 培养7d，菌落直经50-55_，菌落中心绿色，边缘浅绿色，边缘不整齐，质地絮状，表面无渗出 液，反面与正面同色孢子以弹射的方式向外扩散，在培养基上形成同心环。光学显微镜下显 示其营养菌丝壁光滑，直径1.5-3. Ιμπι，菌丝有隔和分枝，分生孢子梗光滑，基部膨大，顶部 锥形变细，分生孢子自顶向下呈圆形或椭圆形，（2 · 0-2 · 3 )μπι X (1 · 6-2 · 7 )μπι; ITS序列为：
[0021 ] 经过鉴定，确定该菌株为棘孢木霉（Trichoderma asperellum)，命名为ΖΖΥ， GenBank 的登录号为 KU375549。
[0022] 5)菌株的保藏
[0023]棘孢木霉ZZY的保藏：该菌株于2016年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.12071。
[0024] 实施例2:棘孢木霉ZZY的固体发酵
[0025] PDA固体培养基：马铃薯200 · 00g，蔗糖20 · 00g，琼脂15 · 00-20 · 00g，蒸馏水1000mL， pH自然，分装于试管中。
[0026] PDA液体培养基：马铃薯200 · OOg，蔗糖20 · OOg，蒸馏水lOOOmL，pH自然，以每瓶 100mL的装瓶量分装于250mL三角瓶中。
[0027]固体培养基:稻糠20.0(^，葡萄糖2.0(^，蒸馏水1011^，？!1自然，放置于2501^三角瓶 中。
[0028] 所有培养基121Γ高压灭菌20min。
[0029] 将本发明使用的菌种棘孢木霉ZZY接种在PDA固体培养基斜面上，于28-30°C下恒 温培养4-6d，成熟后，用无菌水制成孢子悬浮液，调节孢子悬液浓度为10 7-108个/mL，待用。
[0030] 将上述孢子悬液以0.5%-1.5%的接种量接种到roA液体培养基中，培养条件为： 温度28-30 °C，转速150-180r/min，培养时间4-6d。得到种子液，待用。
[0031 ] 将种子液以5%-15%的接种量，接种到固体培养基中，培养8-15d，在40-60°C下干 燥至恒重，得到固体发酵产物。
[0032]实施例3:棘孢木霉修复铅污染土壤，降低植物中含铅量
[0033]将采自湖南省怀化市洪江区被重金属污染的土壤(铅含量为124.5mg/kg)，采用高 温灭菌的方式将其灭菌，121°C高压灭菌20min。实验组将实施例2所得的固体发酵产物以 0.2%的比例与灭菌土壤混合;对照组不加入任何物质。分别以2kg/盆的装盆量将两组土壤 装入花盆中，播种小白菜种子"上海青"，每组设置三个平行，放入18-20°C的温室中培养。在 培养过程中，定期浇水，并利用0.5%-0.6%的尿素水进行追肥。长出菜苗后，进行间苗，每 盆留下一定数量的植株大小、健壮程度相似的菜苗，其余菜苗全部拔出。培养20d后终止培 养。分别将实验组和对照组的小白菜地上可食部分和地下根部收集烘干至恒重，并记录;两 组土壤烘干至恒重。分别测定实验组和对照组小白菜地上可食部分和地下根部的重金属含 量。
[0034] 土壤中重金属铅的含量利用文献"火焰原子吸收分光光度法测定污染土壤中5种 重金属"中火焰原子吸收分光光度计法测定。
[0035]植物中重金属铅含量利用"GB 5009.12-2010食品中铅的测定"中火焰原子吸收光 谱法测定。
[0036]实验结果如表1所示。结果得出添加棘孢木霉ZZY固体发酵产物后的实验组的各项 指标与对照组相比都有显著差异，证明棘孢木霉ZZY不仅可以提高铅污染土壤中所种植植 物的生物量，而且还可以降低植物中的铅含量。
[0037]表1小白菜种植实验结果
[0038]
【主权项】
1. 一株具有耐铅能力的木霉菌株，其特征在于：所述木霉菌株为棘孢木霉 (Trichoderma asperellum)ZZY，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， CGMCC No.12071。2. 如权利要求1所述的具有耐铅能力的棘孢木霉ZZY，其形态特征是:PDA培养基上28-30°C培养4d，菌落直径30-40mm，菌落稍隆起，菌落中心绿色，边缘白色，质地絮状，边缘不整 齐，有明显的放射状皱纹，表面无渗出液，反面与正面同色，培养7d，菌落直经50-55mm，菌落 中心绿色，边缘浅绿色，边缘不整齐，质地絮状，表面无渗出液，反面与正面同色孢子以弹射 的方式向外扩散，在培养基上形成同心环。光学显微镜下显不其营养菌丝壁光滑，直径1.5-3. Ιμπι，菌丝有隔和分枝，分生孢子梗光滑，基部膨大，顶部锥形变细，分生孢子自顶向下呈 圆形或椭圆形，（2.0-2.3)μπιΧ( 1.6-2.7)μπι。3. 如权利要求1所述的具有耐铅能力的棘孢木霉ΖΖΥ，其ITS序列为： AATTGGTTTGGAAACGGTTTAACCAAATCTTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCG GAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAG CAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC GATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCG GGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACAC GGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGA GCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAA CTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG 〇4. 如权利要求1所述的具有耐铅能力的棘孢木霉ZZY在铅污染土壤治理及降低铅在作 物及农产品中积累方面的应用。
【文档编号】B09C1/10GK105969668SQ201610058943
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年1月26日
【发明人】朱振元, 孙会轻, 李启祥, 董海燕, 宋巧英
【申请人】天津科技大学