一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明以E.coli Origami(DE3)为宿主，构建了高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌pET?32a(+)?treZ/E.coli Origami(DE3)。以该菌株为生产菌株在发酵罐进行发酵产酶，酶活力可达204.0U·mL?1，约为摇瓶发酵的4.9倍。本发明降低了麦芽寡糖基海藻糖水解酶生产成本，为实现海藻糖的工业化生产奠定了基础。
【专利说明】
一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌及其应用，属于基因 工程和发酵工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 海藻糖(Trehalose)是由两个P比喃环葡萄糖以1，1-糖苷键连结而成，是一种稳定 的非还原性二糖，它有3种光学异构体，即αα型、αβ型和邱型。
[0003] 海藻糖是一种安全的非还原性二糖，广泛存在于自然界中，具有保湿性，抗冻抗干 燥性，热酸稳定性等特殊的生物学功能，对生物大分子有着非特异性的保护作用，因此在医 学、农业、化妆品、食品等行业应用潜力巨大。自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖生 理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。
[0004] 酶法转化生产海藻糖是上世界90年代逐渐兴起的方法，主要有磷酸化酶法、海藻 糖合成酶法和双酶法这三种方法。当前以淀粉为底物经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽 寡糖基海藻糖水解酶的共同作用生成海藻糖，即双酶法生产海藻糖，受到广泛关注。以该方 法生产海藻糖的转化率高达80%以上，在一定程度上降低了海藻糖的生产成本并极大的推 动了海藻糖的工业化生产进程。
[0005] 麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalose trehalohydrolase, EC3.2.1.141)由基因 treZ编码，是双酶法生产海藻糖的其中一种酶。淀粉经过高温液化后 加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精，麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α， α-l，4-糖苷，产生α，α-1，4-糖苷键到α，α-1，1-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成中间产物 麦芽寡糖基海藻糖。麦芽寡糖基海藻糖水解酶则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海 藻糖相连的α，α-1，4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖， 减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行，两种 酶反应就可以将麦芽寡糖转化成海藻糖为主，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。
[0006] 双酶法生产海藻糖以淀粉为底物，转化率高达80%以上，具有低成本的优点，但是 麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在宿主菌中的可溶性表达很低，产生较多的包涵体，酶活力 低，不利于其工业化应用。
【发明内容】
[0007] 本发明第一个目的是提供一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌，该基 因工程菌是以pET-32a( + )载体，以E.coli 0rigami(DE3)为表达宿主，表达Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶。
[0008] 所述Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖水解酶 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种所述的基因工程菌的构建方法是:将核苷酸序列 为SEQ ID N0.1的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因连接到表达载体pET-32a( + )上，然后再转 化到大肠杆菌E.coli Origami(DE3)中，筛选正确的转化子，即得到基因工程菌pET-32a (+)-treZ/E.coli 0rigami(DE3)〇
[0010] 本发明的第三个目的是提供一种所述基因工程菌发酵生产麦芽寡糖基海藻糖水 解酶的方法。
[0011] 所述的方法包括：⑴分批发酵阶段:将种子液以8%-10%接种量接种于发酵罐 中，控制温度36-38°(：、初始转速180-200印111、初始通气量717111丨11、溶氧28-32%、？!16.8-7.2; (2)补料发酵阶段:待溶氧上升至80-100%，以控制比生长速率以=0.21^的指数流加的 方式进行补料培养，控制温度36-38°C、溶氧28-32%、pH 6.8-7.2;(3)诱导培养阶段：当菌 体细胞浓度达到〇D6QQ为30-50时，以流速0.1-0.8g · I/1 · 1Γ1流加乳糖诱导产酶，控制温度 25-35°C、溶氧28-32 %、pH 6 · 8-7 · 2，诱导0-27h。
[0012]在本发明的一种实施方式中，诱导培养阶段是当菌体细胞浓度达到0D6QQ为40时， 开始流加乳糖诱导产酶。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，诱导培养阶段是以流速0.2g · I/1 · 1Γ1流加乳糖诱 导产酶。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，诱导培养阶段是控制温度30°C。
[0015] 本发明所述诱导产酶的时间，无特殊说明的，是指从第一次加入诱导剂开始算起。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] (1)本发明将Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖 水解酶与硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx)融合表达，构建基因工程菌pET-32a( + )-treZ/ E · col i Origami (DE3)。与对照pET-24a( + )-treZ/E · coli BL21 (DE3)相比，融合蛋白在宿主 菌中的可溶性表达有一定程度的提高，融合蛋白Trx-MTHase摇瓶发酵酶活为42.0U · mL一1， 是对照的4.0倍(MTHase 10.4U · mL-3。用肠激酶（Enterokinase)切除N-端Trx蛋白后， MTHase酶活为切除前的1.31倍，为对照的5.2倍。
[0018] (2)本发明构建的基因工程菌pET-32a( + )-treZ/E.coli 0rigami(DE3)，具有高产 麦芽寡糖基海藻糖水解酶的性质，用于发酵罐生产，最高酶活力可达204.0U · ml/1，能够解 决现有发酵工艺中酶活力较低、生产成本高的问题，在尽量不影响麦芽寡糖基海藻糖水解 酶酶学性质和转化率的基础上提高其可溶性表达，为其工业化生产创造条件。
【附图说明】
[0019] 图1、50D重组菌发酵破壁上清及破壁沉淀(摇瓶)SDS-PAGE电泳图。
[0020] M:分子量标准蛋白；1 :E · coli BL21 (DE3)/pET-24a( + )-treZ细胞破壁上清；2 : E.coli Origami (DE3)/pET-32a( + )-treZ 细胞破壁上清；3 :E. coli BL21(DE3)/pET-24a (+) -treZ细胞破壁沉淀;4: E · co 1 i Origarni (DE3) /pET-32a(+) -treZ细胞破壁沉淀.
[0021]图2、不同诱导时间，重组菌3.6L发酵罐发酵产酶曲线。
[0022 ]图3、不同诱导温度，重组菌3.6L发酵罐发酵产酶曲线。
[0023]图4、不同乳糖流加速度，重组菌3.6L发酵罐发酵产酶曲线。
[0024]图5、重组菌3L罐发酵破壁上清SDS-PAGE电泳图，下划线部分为目的蛋白。
[0025] M:分子量标准蛋白；1:诱导Oh细胞破壁上清;2-10:诱导3-27h细胞破壁上清.
【具体实施方式】 [0026] 培养基：
[0027] (1)LB固体培养基的组成为：分子级蛋白胨9-llg/L，分子级酵母粉4_6g/L，NaCl 9-1 lg/L，琼脂粉 1.5-2 %。
[0028] (2)LB液体培养基的组成为：分子级蛋白胨9-1 lg/L，分子级酵母粉4-6g/L，NaCl 9-llg/L，pH 6·8-7·2。
[0029] (3)ΤΒ发酵培养基的组成为：甘油4-6g/L，工业级酵母粉23-25g/L，工业级蛋白胨 11 -13g/L，KH2P〇42 · 2-2 · 4g/L，K2HPO416-17g/L。
[0030] (4)种子培养基：（工业级蛋白胨10g/L，工业级酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，100mg/L 卡那霉素 ，pH 7.00)
[0031] (5)发酵培养基为：甘油8g/L，蛋白胨 12g/L，酵母粉24g/L，（NH4)2HP〇44 · Og/L， KH2P〇4l3.5g/L，柠檬酸 1.7g/L，MgS〇4 · 7H20 1.4g/L，微量元素液 10mL/L。还可以添加 100μ g/mL卡那霉素。
[0032] (6)微量元素液为：FeS〇4 · 7H20 10.0g/L，ZnS〇4 · 7H20 5.3g/L，CuS〇4 · 5H20 3.0g/L，MnS〇4.4H20 0.5g/L，Na2B4〇7· IOH2O 0.23g/L，CaCl22.0g/L，（NH4)6M〇7〇24〇.lg/L〇
[0033] (7)补料培养基为:蛋白胨 12g/L，酵母粉24g/L，MgS〇4 · 7H20 15g/L，甘油300g/L。
[0034] 实施例l:pET-32a( + )-treZ/E·coli0rigami(DE3)的构建
[0035] PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因 treZ(核苷酸序列是SEQ ID N0.1)，将所得 到的treZ基因片段与经EcoR I和Hind III酶切纯化后的载体pET-32a( + )，用T4DNAligase 4°C连接16h。连接产物转化克隆宿主E.coli JM109涂布LB固体培养基(含100yg .1111/1氨苄 青霉素），37°C培养箱培养8h，挑取单菌落，经LB液体培养基(含100yg ?ml/1氨苄青霉素)37 °C培养8h后，收集菌体抽提质粒，酶切验证，然后对验证正确的重组质粒测定DNA序列，得到 重组质粒pET-32a( + )-treZ。pET-32a( + )载体含有硫氧还蛋白（TrxA)融合标签，硫氧还蛋白 (thioredoxin A，TrxA)是一种序列保守的小分子蛋白，分子量约为12kDa。
[0036] 将重组质粒pET-32a( + )-treZ化转表达宿主E.coli 0rigami(DE3)，涂布LB固体培 养基(含lOOyg · ml/1氨苄青霉素），37°C培养箱培养12h，挑取单菌落，经LB液体培养基(含 100yg · ml/1氨苄青霉素)37°C培养8h后保甘油菌。
[0037] PCR扩增treZ基因所用引物：
[0038] F:5 '-CGGAATTCATGTTTAGCTTTGGCGGCAA-3' 28bp
[0039] R:5 '-CCAAGCTTATTCCAGTTGATACACGC-3' 26bp
[0040] 实施例2摇瓶发酵产酶
[0041 ] 1、将以pET-24a( + )为载体、E.coli BL21(DE3)为宿主构建的重组菌pET-24a( + )_ treZ/E.coli BL21(DE3)和pET-32a( + )-treZ/E.coli 0rigami(DE3)，用移液枪吸取 10μ1 菌 液分别接种于10mL LB液体培养基（加入终浓度30yg · ml/1卡那霉素或100yg · ml/1氨苄青 霉素）中，置于37 °C恒温摇床，200r · mirT1，培养8-10h，作为种子液。
[0042]将培养好的种子液以4%的接种量接入40mL TB培养基（加入终浓度30yg · mL-1卡 那霉素或l〇〇yg · mL-1氨苄青霉素）中，置于37°C恒温摇床，转速200r · min-S培养2h;加入 终浓度0.05-0.4mmol · L-hPTGJSr，转速200r · min-1，培养24-48h。发酵液离心去上清， 收集菌体，用等体积20mmol · I^pH 8.0 Tris-HCl缓冲液复溶，经超声波细胞粉碎机破碎细 胞，离心取上清液，得到粗酶液。
[0043] 2、麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活力分析
[0044] (1)酶活单位定义
[0045]采用3,5_二硝基水扬酸法(DNS法)测定麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活时，每分钟 转化麦芽三糖基海藻糖生成lymol海藻糖所需的酶量作为一个活力单位。
[0046] (2)酶活力测定步骤
[0047] 预热:取0.49mL的1 %麦芽五糖溶液(50mM pH5.5磷酸盐缓冲液)于试管中，置于60 °C水浴锅中预热1 Omin。
[0048]反应:加入0.05mL麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶液，振荡均匀，60°C反应lh，沸水浴 煮沸lOmin终止反应，冷却;加入0.05mL麦芽寡糖基海藻糖水解酶发酵胞内粗酶液，振荡均 匀，准确计时lOmin，加入lmL DNS振荡均匀，沸水浴煮沸7min，冷却。
[0049] 测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至10mL，混匀。在540nm波长下测定吸 光值并计算酶活力。
[0050] 3、图1为摇瓶发酵24h时重组菌破壁上清的SDS-PAGE蛋白电泳图，蛋白电泳结果显 示在约59kDa和71kDa处有一条明显条带，与理论麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)和融合 表达麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Trx-MTHase)分子量相符。经酶活检测，融合表达麦芽寡糖 基海藻糖水解酶(Trx-MTHase)胞内酶活为42.0U ?mL-1(胞外未检测到酶活），为非融合表 达麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的4.0倍。用肠激酶(Enterokinase)切除N-端Trx蛋 白，麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活力提高，为切除前的1.31倍，为非融合表达时酶活5.2倍。 此时，麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活力为55.0U · ml/1。
[0051 ]实施例3不同诱导时间对重组菌发酵产酶的影响
[0052] 1、种子培养:将-80°C甘油管保存的pET-32a( + )-treZ/E.coli Origami(DE3)菌株 接入种子培养基中，使用恒温摇床进行培养，温度37°C，转速200rpm，培养8h。
[0053] 2、发酵产酶：
[0054]将种子液以8 %接种量接入发酵培养基。通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持 30%，控制温度为37°C，流加25 % (v/v)的氨水控制pH在7.0。待最初的甘油消耗完后，溶氧 上升至80-100%，则分批发酵培养结束。以比生长速率以=0.21^指数流加的方式补加补料 培养基。选择在菌浓OD600达到30、40和50时开始以0.4g · I/1 · 1Γ1流速恒速流加乳糖进行诱 导。在30°C下诱导产酶，溶氧维持在30%，pH控制在7.0左右。诱导24h左右。发酵培养结束 后，0D 6QQ等于40条件下诱导时，麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活最高，达到184.0U · ml/1(图 2)〇
[0055] 实施例4不同诱导温度对重组菌发酵产酶的影响
[0056] 1、种子培养:将-80°C甘油管保存的pET-32a( + )-treZ/E.coli Origami(DE3)菌株 接入种子培养基中，使用恒温摇床进行培养，温度37°C，转速200rpm，培养8h。
[0057] 2、发酵产酶：
[0058]将种子液以8 %接种量接入发酵培养基。通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持 30%，控制温度为37°C，流加25 % (v/v)的氨水控制pH在7.0。待最初的甘油消耗完后，溶氧 上升至80-100%，则分批发酵培养结束。以比生长速率以=0.21^指数流加的方式补加补料 培养基。当细胞浓度达到〇D6Q() = 40时，开始以0.4g · I/1 · IT1流速恒速流加乳糖进行诱导， 诱导温度分别35°C、30 °C、25 °C，溶氧维持在30 %，pH控制在7.0左右。诱导24h左右。发酵培 养结束后，30°C诱导24h，麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活力最高，达到193.0U · mL-1 (图3)。
[0059] 实施例5不同乳糖流加速度对重组菌发酵产酶的影响
[0060] 1、种子培养:将-80°C甘油管保存的pET-32a( + )-treZ/E.coli Origami(DE3)菌株 接入种子培养基中，使用恒温摇床进行培养，温度37°C，转速200rpm，培养8h。
[0061 ] 2、发酵产酶：
[0062]将种子液以8%接种量接入发酵培养基。通过控制搅拌转速和通风量使溶氧维持 30%，控制温度为37°C，流加25 % (v/v)的氨水控制pH在7.0。待最初的甘油消耗完后，溶氧 上升至80-100%，则分批发酵培养结束。以比生长速率以=0.21^指数流加的方式补加补料 培养基。当细胞浓度达到〇D_ = 40时，分别采用O.lg · I/1 · h'OJg · I/1 · h'Odg · L 一1 · h-So.Sg · L-1 · h-1恒速流加乳糖进行诱导。溶氧维持在30%，pH控制在7.0左右。诱导 24h左右。当乳糖流加速率为0.2g · I/1 · 1Γ1时，麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活达到最高值 204U · mL-1(图4)。
[0063]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种高产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌，其特征在于，以pET-32a( + )载体， 以E. coli Origami(DE3)为表达宿主，表达麦芽寡糖基海藻糖水解酶。2. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶 的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. -种构建权利要求1或2所述的基因工程菌的方法，其特征在于，将核苷酸序列为SEQ ID NO. 1的麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因连接到表达载体pET-32a( + )上，然后再转化到大 肠杆菌E · coli Origami (DE3)中，得到基因工程菌pET_32a(+ )_treZ/E · coli Origami (DE3)〇4. 一种应用权利要求1或2所述基因工程菌发酵生产麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法， 其特征在于，包括：（1)分批发酵阶段:将种子液以8%-10%接种量接种于发酵罐中，控制温 度36-38 °C、初始转速 180-200rpm、初始通气量7L/min、溶氧28-32 %、pH 6.8-7.2; (2)补料 发酵阶段:待溶氧上升至80-100%，以控制比生长速率以=0.21^的指数流加的方式进行补 料培养，控制温度36-38°(：、溶氧28-32%、？!16.8-7.2;(3)诱导培养阶段 ：当菌体细胞浓度 达到OD600为30-50时，以流速0.1-0.8g · I/1 · 1Γ1流加乳糖诱导产酶，控制温度25-35 °C、溶 氧28-32%、口!16.8-7.2，诱导0-2711。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，诱导培养阶段是当菌体细胞浓度达到0D_ 为40时，开始流加乳糖诱导产酶。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，诱导培养阶段控制温度30°C。7. 权利要求1或2所述的基因工程菌在生产海藻糖中的应用。
【文档编号】C12P19/12GK105969713SQ201610343218
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】吴敬, 宿玲恰, 吴世雄
【申请人】江南大学