一种类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因及应用
【专利摘要】本发明公开了一种万寿菊类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因Tagetes erecta violaxanthin de?epoxidase(TeVDE1)，特征是其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。在万寿菊花瓣组织中克隆获得了TeVDE1基因。实时定量分析和叶黄素含量测定结果表明TeVDE1基因在万寿菊花蕾中表达量较高，其表达水平与叶黄素含量相关。所述SEQ ID NO：1基因在叶黄素合成积累方面具有作用，本发明从色素万寿菊中克隆类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因能够用于提高叶黄素等类胡萝卜素色素含量。
【专利说明】
一种类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因及应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物遗传工程技术领域，具体涉及从色素万寿菊中克隆类胡萝卜素合 成途径紫黄质脱环氧化酶基因 TeVDEl，该基因的核苷酸序列、蛋白质序列，及利用该基因在 提高植物类胡萝卜素合成积累中的应用。
【背景技术】
[0002] 据《北方园艺》（2007年第1期44-46页）介绍，万寿菊（Tagetes erecta L.)是菊科 万寿菊属1年生草本植物，原产美洲墨西哥等地，因其花花形大、绚丽多彩、植株适应性强、 生产周期短，目前已在世界各地广泛引种。万寿菊花朵中可提取多种次生代谢产物。花瓣中 的黄色素主要为叶黄素酯、叶黄素及其它微量的类胡萝卜素。万寿菊花瓣可制成4种形式的 商品：花干粉、万寿菊油树脂、叶黄素脂以及叶黄素，万寿菊逐渐成为具有广阔市场前景的 花卉。据《中国食品添加剂》(2012年第3期238-239页)介绍，用于提取色素而栽种的色素万 寿菊在我国种植面积逐年增长，目前我国是世界万寿菊叶黄素主产地，万寿菊已成为一种 具有较好经济价值的植物资源。
[0003] 据《国外医学医学地理分册》（2011年第1期51-52页)介绍，叶黄素属于类胡萝卜素 类色素，是导致万寿菊花瓣呈现黄橙色的主要色素，占花瓣色素的90%。叶黄素在万寿菊等 植物中主要以脂的形式存在。人体不能合成叶黄素但可以利用叶黄素酯，使其在体内转化 成为游离叶黄素。由于叶黄素在人体不能合成，同时因其有多种异构体，也难采用化学方法 合成，需要从天然植物中提取。尽管叶黄素在多种水果和蔬菜中普遍存在，但其含量却极微 少，日常饮食摄人不足。因而富含这一成分的万寿菊成为提取天然叶黄素的重要植物资源。 叶黄素色泽鲜艳，高含量的叶黄素不仅可用作天然着色色素，还具有丰富的营养价值及药 用价值。1995年美国食品药品管理局(Food and Drug Administration)批准将叶黄素作为 食品补充剂，预防视网膜黄复病，缓解老年性视力衰退。同时，叶黄素还可以增强机体免疫 力，预防心血管疾病、以及癌症肿瘤的发生与发展。所以，叶黄素在医药、食品、禽类养殖、化 妆品中广泛应用，可用于药片糖衣、胶囊的着色、保健饮料着色、饲料添加，或以叶黄素酯作 为主料，制成硬胶囊、软胶囊、片剂、口服液等。据《新疆农垦经济》(2012年第6期52-55页)介 绍，虽然叶黄素价格昂贵有"软黄金"之称，但国内外对叶黄素的需求量仍逐年增加。我国已 是色素万寿菊主产地，而由于较国外起步晚，相应研究和产业化尚处于起步阶段，除少量自 用外，95%以上国产万寿菊浸膏出口国外，而国内所需绝大部分叶黄素制品及种子均依靠 进口。
[0004] 在基础研究方面，我国万寿菊育种进展缓慢，尚未选出能够真正替代欧美品种的 新品种，主要原因一方面是遗传资源匮乏，另一方面是对现有遗传资源了解不多。据《西北 农业学报》(2012年第5期174-178页)介绍，对万寿菊的遗传分析表明叶黄素含量性状以主 基因遗传效应为主，多基因效应为辅。叶黄素是类胡萝卜素中的含氧多萜类物质。在植物体 内，合成前体异戊烯基焦磷酸经多次缩合生成八氢番茄红素，再经脱氢、环化、羟基化、环氧 化等转变为其它类胡萝卜素，整个过程由多种酶催化完成。通过拟南芥、番茄等模式植物的 研究已经对这些类胡萝卜素生物合成途径基因有了比较多的了解，发现八氢番茄红素合成 酶(phytoene synthase，PSY)、八氢番前红素脱饱和酶(phytoene desaturase，PDS)、番前 红素环化酶（lycopene cyclase，LYC)、胡萝卜素脱饱和酶（carotene desaturase，ZDS)、紫 黄质脱环氧化酶(violaxanthin de_epoxidase，VDE)等在叶黄素等类胡萝卜素合成积累中 发挥重要作用。但作为叶黄素重要植物来源的万寿菊，其叶黄素合成途径的一些重要基因 尚未克隆分离。利用这些基因将可用于筛选培育高色素含量植物资源，满足食品、医药等领 域需求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种从色素万寿菊中克隆的类胡萝卜素合成途径紫黄质脱 环氧化酶基因 TeVDEl，该基因的核苷酸序列、蛋白质序列，以及利用该基因在提高植物类胡 萝卜素合成积累中的应用。
[0006] 本发明从色素万寿菊中克隆类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因，命名为 Tagetes erecta violaxanthin de-epoxidase(简称TeVDEl);其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0:1所示，所编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
[0007] 本发明从色素万寿菊中进行类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因的克隆： 根据对色素万寿菊的高通量转录组深度测序对TeVDEl基因进行数据组装;然后利用引物设 计软件Primer Premier 5 ·0设计2对巢式PCR特异引物，从万寿菊花瓣中提取总RNA，反转录 PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)克隆获得TeVDEl基因。
[0008] 本发明从色素万寿菊中克隆的类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因的用 途，通过万寿菊叶、不同发育时期花组织的实时定量分析和叶黄素含量测量结果，表明本发 明所述SEQ ID N0:1基因在类胡萝卜素色素合成积累方面具有作用，能够用于提高叶黄素等 类胡萝卜素色素含量。
[0009] 本发明从色素万寿菊克隆类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因的有益效果 是:为在植物中提高叶黄素等类胡萝卜素色素含量提供了一种新的基因资源，可用于高色素 营养品质植物材料的筛选、培育和改良。
【附图说明】
[0010]图1是色素万寿菊栽培品种菊王的叶、花蕾、成熟花中TeVDEl基因的定量表达及叶 黄素含量测定结果。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图通过实施例对本发明作进一步详细说明。
[0012] 下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规 条件，例如Sambrook Russell的分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0013] 实施例1:万寿菊高通量转录组测序
[0014] 由于万寿菊基因组尚未测定，为获得万寿菊功能基因转录本序列，利用色素万寿 菊栽培品种菊王组织样品，通过分别提取三个单株的叶片、花蕾、成熟花RNA各1份，进行高 通量转录组序列测定与组装注释。
[0015] 1、试剂
[0016] 植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于Takara公 司，RNA文库制备试剂盒(RNA Library Prep Kit)购于北京百迈客生物科技有限公司，其余 试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
[0017] 2、植物材料
[0018]色素万寿菊(Tagetes erecta L.)栽培品种菊王由赤峰鑫丼园艺公司繁育提供。
[0019] 3、方法 [0020] 3.1RNA 提取
[0021] 1)使用液氮研磨法破碎100mg植物组织，移至1.5mL离心管中，加入lml Trizol，剧 烈震荡，室温放置5min;
[0022] 2)离心管中加入200yL氯仿，振荡30s混匀，室温放置5min;
[0023] 3)4°C，12000rpm离心15min，RNA位于上清液，下侧有机相含有叶绿素等杂质；
[0024] 4)将上清液700yL移至1.5mL离心管中，下层有机相和中间层有蛋白质和其他杂 质，避免触及吸取；
[0025] 5)在上清液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min;
[0026] 6)4°C，12000rpm离心 15min，弃上清，RNA沉于管底；
[0027] 7)加入lmL 70%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
[0028] 8)4°C，12000rpm离心5min，弃上清；
[0029] 9)室温干燥 5-10min;
[0030] 10)加入50yL无 RNA酶水（RNase-free H2O)，溶解RNA;
[0031] 11)根据RNA溶液浓度取RNA 50yg，加入5yL 10X缓冲液(400mM Tris-HCL，pH 7.5， 80mM MgCl2,50mM)、5yL Dnase I、2yL RNA酶抑制剂，37°C反应30min;
[0032] 12)加入2.5yL 0.5M EDTA，80。C，2min失活Dnase;
[0033] 13)加入10yL 3M醋酸钠和250yL预冷的乙醇，-80°C放置20min;
[0034] 14)4°C，12000rpm 离心 10min，弃上清；
[0035] 15)加入lmL 70%乙醇清洗RNA;
[0036] 16)4°C，12000rpm离心5min，弃上清；
[0037] 17)室温干燥 5-10min;
[0038] 18)加入50yL无 RNA酶水，溶解RNA;
[0039] 19)检测RNA样品的纯度、浓度。
[0040] 3.2转录组测序组装与注释
[0041] 转录组测序利用RNA Library Prep Kit，通过北京百迈客生物科技有限公司 Illumina HiSeq高通量测序平台，按以下步骤进行：
[0042] 1)用带有01 i go (d t)的磁珠富集真核生物RNA，将mRNA进行随机打断；
[0043] 2)以mRNA为模版，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入dNTPs、RNA酶Η 和DNA聚合酶I合成第二条cDNA链，利用微珠(beads)纯化cDNA;
[0044] 3)纯化的双链cDNA再进行末端修复，并连接测序接头，然后用微珠进行片段大小 选择，通过PCR富集得到cDNA文库；
[0045] 4)对文库的浓度和插入片段大小进行检测；
[0046] 5)利用Illumina HiSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序，测序读长为PE125;
[0047] 6)将测序片段(reads)截除测序接头、引物序列，过滤低质量值数据后，获得高质 量的测序数据；
[0048] 7)利用Trinity组装软件将高质量测序read延伸成较长的片段(contig)，并利用 这些片段之间的重叠，得到片段集合(component)，最后利用De Bruijn图的方法获得转录 本序列(unigene);
[0049] 8)使用BLAST软件将转录本序列(unigene)与NR(NCBI非冗余数据库）、Swiss-Prot (欧洲生物信息学研究所维护数据库）、G0(Gene Ontology)、C0G(Clusters of Orthologous Groups)、K0G(euKaryotic Orthologous Groups)、KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)数据库比对；
[0050] 9)利用TransDecoder软件进行unigene的编码区序列及其对应氨基酸序列的预 测，使用HMMER软件与Pfam(Protein family)数据库比对，获得unigene的注释信息。
[0051] 4.结果
[0052] 通过上述将万寿菊组织材料进行RNA提取、建库、高通量转录组深度测序，然后对 测序序列进行组装和基因功能预测，获得万寿菊紫黄质脱环氧化酶Tagetes erectaviolaxanthin de_epoxidase(TeVDEl)基因的推测序列。
[0053] 实施例2:万寿菊TeVDEl基因的克隆
[0054]根据实施例1对万寿菊紫黄质脱环氧化酶基因 TeVDEl的数据组装，利用引物设计 软件Primer Premier 5.0设计PCR特异引物，从万寿菊花瓣中提取总RNA，反转录PCR (reverse transcription-PCR，RT_PCR)克隆获得TeVDEl基因。
[0055] 1、试剂
[0056] 植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于Takara公 司；反转录酶(TransScript Reverse Transcriptase)购于北京全式金生物技术有限公司； 高保真DNA聚合酶PrimeStar购于TaKaRa公司；克隆载体pEASY-Blunt SimpleCloning Vector购于北京全式金生物技术有限公司；引物由英潍捷基(上海）贸易有限公司合成，其 余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
[0057] 2、大肠杆菌菌株和植物材料
[0058] 大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a购于北京全式金生物技术有限公司；色素 万寿菊(Tagetes erecta L.)栽培品种菊王种子由赤峰鑫丼园艺公司繁育提供。
[0059] 3、培养基和溶液
[0060] LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0,高压灭 菌。
[0061 ] S0B培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L，100XMg2+ 10mL。用NaOH调pH至7 · 0，高压灭菌。
[0062] S0C培养基:方法同上述SOB培养基的配制，再加入2mL过滤除菌的lmol/L葡萄糖。
[0063] l〇〇XMg2+溶液：20.33g MgCl2.6H2〇和24.65g MgS〇4.7H20定容于 100mL H20,高压 灭菌。
[0064] 4、方法
[0065] 4.1万寿菊成熟花组织RNA提取
[0066]如实施例1中3.1所述操作步骤进行。
[0067] 4.2RT-PCR
[0068] 4.2.1RT
[0069] 1)取lyg总RNA与lyL polyTis(lOyM)引物混合，用RNase-free ddH20补足到 12·75μ L，轻轻混匀；
[0070] 2)65°C保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min;
[0071] 3)加入5 X 反应缓冲液4yL，10mM dNTP 2yL，RNA抑制剂0 · 25yL(40U/yL)， TransScript Reverse Transcriptase反转录酶lyL(100U/yL)，42°Clh，合成第一链cDNA; [0072] 4)95°C加热5min，失活反转录酶，终止反应。
[0073] 4.2.2PCR
[0074] 根据实施例1所述获得的TeVDEl基因推测序列，利用Primer Premier 5.0软件设 计引物序列如下：
[0075] TeVDElFl:5 'ACTTGGTGTCTTCCACTCATTTC 3 '
[0076] TeVDElRl:5'ATGTTCGATTCGAGTTTGTTAA 3'
[0077] TeVDElF2:5'ATGACCACCTTCGTGAATCTC 3'
[0078] TeVDElR2:5'CACATAAATCAGGCATCACTTG 3'
[0079] 取4.2.1所获万寿菊成熟花的CDNA，进行TeVDEl基因的克隆。将200μLEP管放置于 冰上，加入试剂： Primes tax 0. 5 μ L SXPrimeStar Buffer 10 μ L dJiTT Mixture (各 2_ 5mM ). 4 μ L
[0080] gBHA 1 μL TeVMlFl 1 μL TefDElRl 1 μ L ddH20 32. 5 μ L
[0081 ] 按以下程序进行扩增:98°C 2min(预变性）；98 °C 1 Os (变性），55°C20s(复性），72°C 90s (延伸），所述变性-复性-延伸30个循环;72°C 5min(总延伸）。
[0082] 以上述PCR产物为模板，以引物TeVDElF2和TeVDElR2进行第二轮PCR，复性温度56 °C，其它条件同上。
[0083] 通过上述操作，获得了TeVDEl基因 PCR扩增产物。
[0084] 4 · 3高保真PCR产物与克隆载体pEASY-Blunt连接
[0085] 将由上述4.2所述获得的TeVDEl基因 PCR扩增产物与克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector按摩尔分子数比1:4连接(25°C，15min)，连接体系如下：
[0086] pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(50yg/yL) 4yL
[0087] PCR 产物（~150yg/yL) lyL
[0088] 4.4大肠杆菌转化
[0089] 1)从液氮中取出大肠杆菌(Escherichia co 1 i)菌株DH5a感受态细胞冰浴解冻；
[0090] 2)将4.3所述连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min;
[0091] 3)42°C 热冲击 90s，立即冰浴 l-2min;
[0092] 4)加入0.8mL S0C，混匀，37°C温和振荡培养lh;
[0093] 5)室温13000rpm离心lmin，倒掉一部分上清液，留约200yL的上清液，用吸头将上 清液与细胞混匀，涂布于含有氨苄青霉素(l〇〇yg/mL)的LB平板，37 °C培养过夜。
[0094] 4.5快速裂解法鉴定重组克隆
[0095] 1)挑取单克隆接种于500yL含有氨苄青霉素（100yg/mL)的LB培养液中，37°C振荡 培养至A?为0.6~0.8;
[0096] 2)取200yL菌液至0.5mL EP管中，13000rpm离心lmin，去上清，留约20yL上清；
[0097] 3)加入20yL 2X快速裂解液(0.2M NaOH 50mL，SDS 0.5g，蔗糖27.2g，加双蒸水至 200mL)，剧烈振荡；
[0098] 4)13000rpm 离心 15min;
[0099] 5)取5yL上清直接电泳。与对照相比，电泳带滞后的即可能是重组载体。
[0100] 4.6菌落PCR鉴定重组质粒
[0101] 将4.5所述经快速裂解法鉴定的重组载体再进行菌落PCR鉴定，以确定插入片段是 目标片段，反应体系如下： 而A聚合酶 0· 2 μ L 10 X PCR Buf f er 2 μ L dNTP Mixture (各 2· 5mM) 1. ：6 μΙ
[0102] 菌液 1 μ L TeVDElF2 0. 5 μ L TeVDElR：2： 0, 5 μ L
[0103] ddH2：0 14. 2 μ L
[0104] 反应条件：94°C3min(预变性）；94°C 30s(变性），56°C 20s(复性），72°C90s (延伸）， 所述变性-复性-延伸26个循环;72°C 5min(总延伸）。
[0105] 对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pEASY-TeVDEl，进行测序。测序结果表明，获得 了连接于pEASY-Blunt Simple克隆载体的TeVDEl基因全长序列，基因序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
[0106] 实施例3: HPLC方法测定万寿菊花瓣叶黄素含量
[0107] 利用高效液相(HPLC)方法，对色素万寿菊栽培品种菊王不同组织中叶黄素的含量 进行测定。
[0108] 1、试剂
[0109] 叶黄素标准品购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其余试剂均为进口分装或 国产分析纯产品。
[0110] 2、方法
[0111] 取万寿菊叶片、花蕾及成熟花瓣样品，液氮研磨，称重〇.15g，加入lmL乙醇（含 0.1 % 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚），涡旋15s，加入400mL 50 %Κ0Η水溶液，涡旋15s，于60°C 水浴60min，每15min涡旋一次。用3.3mL正己烷提取3次，合并提取液，取50yL·滤液上样。色谱 条件：高效液相色谱仪(美国WATERS公司）；色谱柱SymmetryC18(250mmX4·6mm，5μm);流动 相：乙腈:二氯甲烧：甲醇为70:20:10(> :￥:￥);流速111117111；[11;检测波长47511111 ;柱温30<€。
[0112] 3、结果
[0113]根据叶黄素标准品标准曲线和HPLC测定结果，测得万寿菊栽培品种菊王叶片、花 蕾及成熟花瓣叶黄素含量平均值分别为1.30、12.99、8.85mg/g鲜重。
[0114] 实施例4:万寿菊TeVDEl基因组织表达分析
[0115]根据实施例2克隆获得的万寿菊紫黄质脱环氧化酶TeVDEl基因全长序列，利用引 物设计软件Primer Premier 5.0设计定量PCR引物，分别从万寿菊叶片、花蕾及成熟花中提 取总RNA，反转录获得cDNA，进行TeVDEl基因表达水平的定量分析。
[0116] 1、试剂
[0117]植物RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于Takara公 司；反转录酶(TransScript Reverse Transcriptase)购于北京全式金生物技术有限公司 公司；实时定量PCR试剂TransStart Green qPCR SuperMix购于北京全式金生物技术有限 公司；引物由英潍捷基(上海）贸易有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产 品。
[0118] 2、方法
[0119] 取万寿菊植株叶片、花蕾及成熟花样品，液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步 骤如实施例1中3.1、实施例2中4.2所述。
[0120] 以万寿菊Translation Initiation Factor 6(TIF6)为内参对照基因，进行 Te VDE1基因表达水平的定量PCR分析。Te VDE1基因引物为：Te VDE1F3和Te VDE1R3; TIF6基因 引物为:TIF6F和TIF6R。引物序列如下：
[0125] 实时定量PCR反应体系如下：
[0126] 正向引物（10 μ M) 0. 5 μ L 反向引.物（.10 μ J) Ο* 5 μ L Passive Reference Dye I 〇. 4 μL
[0127] 2 xTransStart Green qPCR SuperMix 10 μ L cDNA 3 μ L d￡iH20 5. 6 μL
[0128] 反应条件:95￡€308;951€58,60°(：158,72°(：108,40个循环。其中〇0嫩为实施例2中 4.2.1方法所述获得cDNA模板稀释30倍后用于定量PCR。扩增后，65°C5s，每个循环增加0.5 °C，60个循环，进行溶解曲线分析。每个样品重复三次。PCR反应在Bio-Rad CFX 96上运行。
[0129] 3、结果
[0130]图1是色素万寿菊栽培品种菊王的叶、花蕾、成熟花中TeVDEl基因的定量表达及叶 黄素含量测定结果。实时定量PCR分析结果显示，TeVDEl基因在色素万寿菊未成熟的花蕾组 织中表达量较高，且TeVDEl基因表达水平与相应组织中叶黄素含量呈正相关。所述SEQ ID NO: 1基因在叶黄素等类胡萝卜素色素合成积累方面具有作用，本发明从色素万寿菊中克隆 类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因能够用于提高叶黄素等类胡萝卜素色素含量。
【主权项】
1. 一种万寿菊类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因 Tagetes erecta violaxanthin de-epoxidase，简称TeVDEl，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。2. 如权利要求1所述万寿菊类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因，特征在于其氨 基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。3. 权利要求1所述万寿菊类胡萝卜素合成途径紫黄质脱环氧化酶基因的用途，其特征在 于:万寿菊紫黄质脱环氧化酶基因在叶黄素等类胡萝卜素色素合成积累中的应用。
【文档编号】C12N9/02GK105969781SQ201610585328
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月22日
【发明人】黄胜雄, 曹徐绿, 牛向丽, 刘建, 刘莹, 刘永胜, 刘国庆, 田丽
【申请人】合肥工业大学