同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以 ...的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman?LNA多重荧光定量PCR的方法。本发明利用序列相对较短但Tm较高的LNA探针序列，可在确保特异性的前提下，有效提高体系的稳定性，建立了一套多重荧光定量PCR检测体系，该体系能够同时检测牛、猪源性成分，可检测肉或肉制品中DNA含量低至0.05ng的牛源性成分和0.05ng的猪源性成分，相当于可检测含量约0.005%的对应动物成分。本发明的方法具有通量高、特异性强、灵敏度高、应用性好等优点，能较好应用于肉及肉制品中牛、猪源性成分的检测。
【专利说明】
同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光 定量PCR方法及引物探针以及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种同时检测肉或肉制品中牛 猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的方法和引物探针组。
[0002]
【背景技术】
[0003] 肉或肉制品的掺假一直是消费者关注的焦点问题之一，有些不法商家为了个人利 益，以低价肉制品假冒高价肉制品，或在高价肉制品中掺入低价肉，这严重损害了消费者的 权益。目前，打击肉制品掺假已成为监管部门关注的重点，而肉或肉制品的成分检测技术是 监管的基础。
[0004] 目前，动物源性成分的检测技术以检测DNA为基础的分子生物学方法应用最为广 泛，尤其是PCR技术以稳定、准确、快速等优势收到关注。其中，荧光定量PCR法在特异性、灵 敏度、重现性等方面具有巨大的优势，成为该领域的主要技术之一。Taqman荧光PCR技术虽 然克服了普通PCR的上述缺点，但在探针设计时，需要通过较长的探针序列来获得较高的Tm 值，在特异性目标基因序列较短的情况下，常常会因此难以找到理想的探针序列，无法获得 高效、特异的扩增效果，在检测中不时发现这些方法存在一定的假阳性或假阴性结果。
[0005] Taqman-LNA荧光探针是在Taqman探针的基础上，有目的地将探针的一些碱基修饰 成LNA碱基，通过提高探针的Tm值，缩短探针长度来增加探针的稳定性、特异性和设计的灵 活性。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种同时检测肉或肉制 品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的特异性引物探针组。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的 Taqman-LNA多重荧光定量PCR的方法； 本发明的另一个目的在于提供一种同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA 多重荧光定量 PCR 的试剂盒； 本发明的目的通过下述技术方案实现： 同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的引物探针组， 包括牛源性成分特异性引物和探针，猪源性成分特异性引物和探针，其核苷酸序列如表1所 示： 表1: Taqman-LNA多重荧光定量PCR的引物探针组 注:探针中的"C "为LNA修饰碱基，FAM和ROX为荧光基团，BHQ1和BHQ2为猝灭基团。
[0008] 同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的检测试 剂盒，包括表2成分： 表2: Taqman-LNA多重荧光定量PCR的试剂盒组成
同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR的方法，包括以 下步骤： (1)待检样品DNA的提取。将样品与水按照1:4的比例(M/V)进行匀浆，取制备的悬浊液 50yL，采用试剂盒法提取DNA，但将DNA的定容体积改为100yL。试剂盒可选用Wizard Genomic DNA purification kit (Promega，A1120)、核酸提取试剂盒（达安基因，DA-Z146)、动物组织基因组DNA提取试剂盒(迪奥生物，??04)等DNA提取试剂盒。
[0009] (2)多重荧光定量PCR。反应体系见表3,荧光定量PCR反应条件为:95°C 30 s;95°C 5 s，59°C 25 s，35个循环，在每个循环的59°C阶段结束后收集FAM和R0X的荧光信号。
[0010]表3:多重荧光定量PCR的反应体系
(3 )结果判断:根据FAM和R0X两个通道下的循环阈值(Ct值)进行判断，其中FAM通道下 是牛源性成分的检测，ROX通道下是猪源性成分的检测。若阳性对照Ct值<18,阴性对照无 Ct值或Ct多30，则试验有效；当样品Ct值<25时判为阳性，即样品中含有牛源性成分(FAM 通道)和/或猪源性成分(R0X通道）；当样品Ct值多30或无 Ct值时判为阴性，即样品中不含 有牛源性成分(FAM通道)和/或猪源性成分(R0X通道）；当25<样本Ct值<30时须复检，复检 结果与原结果一致的判为弱阳性，提示样品中含有微量(被污染）的牛源性成分(FAM通道） 和/或猪源性成分(R0X通道）。
[0011] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： (1)通量高。本发明可通过一次实验同时检测牛、猪源性成分。
[0012] ⑵特异性强。本发明通过运用牛、猪、鸡、鸭、鹳、山羊、绵羊、驴、马、鹿等动物源性 成分样品进行实验，证明本发明的高特异性。
[0013] (3)灵敏度高。本发明可检测肉或肉制品中DNA含量为0.05ng的牛源性成分和 〇. 〇5ng的猪源性成分，相当于可检测含量约0.005%对应动物成分。
[0014] (4)应用性好。本发明考虑初始模板量及该引物探针组的扩增效率，引入弱阳性的 界定方法，可指示样本有无遭受微量被检动物成分的污染。
[0015]
【附图说明】
[0016] 图1是Taqman-LNA多重荧光定量PCR同时检测牛、猪源性成分。
[0017] 图2是本发明特异性测试。
[0018] 图3是本发明灵敏度测试。
[0019]
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0021] 下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制 造厂商所建议的实验条件。
[0022] 实施例1 (l)DNA的提取 称取相同重量的纯牛肉和纯猪肉样本，再与水按照1:4的比例(M/V)进行匀浆，取制备 的悬池液50yL，米用试剂盒法（Wizard Genomic DNA purification kit，A1120，Promega) 提取基因组DNA，最终DNA的定容体积为1 OOyL。
[0023] (2)Taqman_LNA 多重荧光定量 PCR 反应体系见表3,荧光定量PCR反应条件为:95°C 30 s;95°C 5 s，59°C 25 s，35个循 环，在每个循环的59° C阶段结束后收集FAM和R0X的荧光信号。
[0024] (3 )结果:FAM通道下Ct值为16.15，表明该样品中含有牛源性成分，R0X通道下Ct值 为16.88,表明该样品中含有猪源性成分。
[0025] 实施例2 用实施例1的方法分别对牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅血、山羊肉、绵羊肉、马肉、驴肉、鹿 肉样品进行试验。
[0026] 结果见表4,表明本发明具有很好的特异性，可明确区分所有的受试样本。
[0027]表4多重荧光定量PCR特异性实验结果
实施例3 称取相同重量的纯牛肉和纯猪肉样本，用实施例1方法提取DNA，按照10倍系列稀释，制 备DNA含量分别为500叫、50叫、51^、0.51^、0.05叫和0.005即（与肉类含量50%、5%、0.5%、 0.05%、0.005%和0.0005%相当）的灵敏度测试样本，并按照实施例1进行试验。
[0028]结果见表5，可见本发明具有较高的灵敏度，可检测DNA低至0.05ng的牛源性成分 和0.05ng的猪源性成分，相当于可检测含量约0.005%对应动物成分。
[0029] 表5多重荧光定量PCR灵敏度实验结果
实施例4 采用本发明检测市售鲜禽畜肉及火腿肠、肉丸等加工产品30份，并与《SN/T 2051-2008 食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》进行比较。结果显示:二者检 测情况完全一致，并发现5份阳性结果与商品的标识不符合，详见表6。
[0030] 表6多重荧光定量PCR应用检测结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限 制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均 应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重巧光定量PCR的引物探针 组，包括牛源性成分特异性引物和探针，猪源性成分特异性引物和探针，其中引物和探针W 及序列为： 牛源性成分的上游引物N-F 5'-ttgaattaggccatgaagca-3' ； 牛源性成分的下游引物N-R 5'-cgacttgtctcctctcatgtagc-3' ； 牛源性成分的探针T1 5'- FAM-cgcccgtcaCcctcctcaaata-BHQl-3'； 猪源性成分的上游引物Z-F 5'-aaccccgatagaccttaccaa-3' ； 猪源性成分的下游引物Z-R 5'-tcctttttagggtttgctgaag-3' ； 猪源性成分的探针T2 5'- Rox-tgccaattcagcctatataCCgcca-BHQ2-3'； 其中探针中的乂 "为LNA修饰碱基，FAM和ROX为巧光基团，BHQ1和BHQ2为巧灭基团。2. 同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的Taqman-LNA多重巧光定量PCR的检测试剂 盒，包括如下成分：3. 同时检测肉或肉制品中牛、猪源性成分的化qman-LNA多重巧光定量PCR的方法，包括 W下步骤： (1) 待检样品DNA的提取， 将样品与水按照1:4的比例(M/V)进行匀浆，取制备的悬浊液50化，采用试剂盒法提取 DNA，但将DNA的定容体积改为1 试剂盒可选用Wizard Genomic DNA purification kit、核酸提取试剂盒、动物组织基 因组DNA提取试剂盒等DNA提取试剂盒； (2) 多重巧光定量PCR，，巧光定量PCR反应条件为:95°C 30 s;95°C 5 s，59°C 25 s，35 个循环，在每个循环的59°邱介段结束后收集FAM和ROX的巧光信号;其反应体系如下所示：(3)结果判断:根据FAM和ROX两个通道下的循环阔值，该值为Ct值进行判断，其中FAM通 道下是牛源性成分的检测，R0X通道下是猪源性成分的检测； 若阳性对照Ct值《18，阴性对照无 Ct值或Ct>30，则试验有效；当样品Ct值《25时判 为阳性，即样品中含有牛源性成分一FAM通道和/或猪源性成分一R0X通道;当样品Ct值>30 或无 Ct值时判为阴性，即样品中不含有牛源性成分一FAM通道和/或猪源性成分一R0X通 道;当25<样本Ct值<30时须复检，复检结果与原结果一致的判为弱阳性，提示样品中含有 微量，即被污染的牛源性成分一 FAM通道和/或猪源性成分一 R0X通道。
【文档编号】C12N15/11GK105969839SQ201510212723
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年4月29日
【发明人】吴图扬, 许如苏, 段建发, 林宏, 梁希扬, 徐宁, 张杨, 其他发明人请求不公开姓名
【申请人】汕头市检测检验学会, 中华人民共和国汕头出入境检验检疫局