多重荧光pcr技术筛查和鉴定mll重排相关融合基因的引物及探针、组合物和方法
【专利摘要】本发明一种用多重荧光PCR技术筛查MLL重排相关融合基因的引物、探针、组合物和方法。所述筛查的MLL重排相关融合基因包括：MLL?AF9、MLL?AF6、MLL?AF4、MLL?AF1P、MLL?AF1Q、MLL?AF10、MLL?AF17、MLL?AFX1、MLL?ELL、MLL?ENL、MLL?SEPT6、MLL?CBP、dupMLL共计13种相对常见融合基因。本发明所述引物、探针、检测组合方式和检测方法方便、经济、快捷，特异性好，灵敏度高，通量大，适于大批量样本的临床检测。
【专利说明】
多重荧光PCR技术筛查和鉴定MLL重排相关融合基因的引物及 探针、组合物和方法
技术领域
[0001 ]本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种采用多重荧光PCR技术筛查MLL 重排相关融合基因的引物、探针、组合物和方法。
【背景技术】
[0002] MLL重排异常可见于约5-10 %的急性白血病(AL)患者。其中除MLL-AF9融合基因属 于中等预后指标外，其余伴MLL重排的异常都与预后差相关。在急性白血病的临床治疗中， 特别是针对AML的治疗会进行一个预后的评估分层，根据不同的预后分层选择不同的治疗 方案。同时还需要对治疗过程中融合基因的表达量进行监测，以预测疗效及复发的可能性。 因此，MLL重排相关融合基因的筛查显得尤为重要。
[0003] 由于MLL重排涉及的断裂位点多样，产生的融合基因种类也繁多，因此在临床检测 上存在一定的困难。目前用于MLL重排筛查的方法主要有:染色体核型分析，多重巢式PCR联 合电泳法。染色体核型分析通过肉眼观察判断，需对样本中的有核细胞进行培养，具有核分 裂相才能进行观察;而细胞培养增殖过程中，会出现某类细胞优势生长，"淹没"病变细胞的 可能，造成染色体核型正常的假象。其次，有些病例染色体的易位复杂且微小，无法靠肉眼 观察进行分析。再者，染色体核型分析灵敏度无法满足MRD(Minimal Residua Disease，微 小残留病灶)检测的需求。而多重巢式PCR联合电泳的方法耗时长，过程繁琐，易污染，结果 的判断较主观。且PCR反应体系多，成本高，不适用于高通量的样本检测。只能进行定性检测 的缺点，不能同时满足灵敏度高和特异性好的需求。
【发明内容】
[0004] 鉴于目前筛查MLL重排相关融合基因的方法学不能同时满足经济高效、结果准确 且能用于MRD监测等需求，故本发明设计出一套用于多重荧光PCR技术检测MLL重排常见融 合基因的引物、探针，并构思出一种灵敏度高，特异性好，检测通量大，快速且准确的筛查及 型别鉴定方案。
[0005] 一种用荧光PCR技术筛查及鉴定MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF4、MLL-AF1P、MLL-AF1Q、 MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、dupMLL这 13 种常见 MLL重排相关融合基因的引物及探针，采用多重荧光PCR技术，将存在于MLL基因的上游引 物、及其对应的探针配对不同的下游基因上的多条下游引物。其核苷酸序列如下：
[0057] (MLL基因参考序列：NM_001197104)
[0058] 筛查上述融合基因的引物探针还包括扩增作为内参的管家基因 ABL的引物和探 针，其核苷酸序列如下：
[0062]本发明的引物和探针的设计思路为：
[0063] 1.MLL基因发生重排时，断裂位点主要集中于内含子5-12,导致MLL外显子5-12与 其他基因发生融合;而其中又以6-9外显子发生融合最为常见。若要检测出5-12外显子的各 种融合型式，宜在每个外显子上设计一条上游引物;若要使PCR反应尽量减少相互干扰，则 一管PCR反应中的引物探针尽量单一越好。为兼顾上述两个条件，本发明选择在MLL第5、7和 第9外显子上各设计一条引物，将PCR扩增产物的长度尽量控制在350bp以内，以满足荧光 PCR技术的检测范围要求:其中第5外显子上的引物用于检测5外显子或6外显子融合;第7外 显子上的引物用于检测第7外显子或第8外显子融合;第9外显子上的引物用于检测第9外显 子或第10外显子甚至第11外显子融合。由于MLL重排产生的融合，每种融合基因均含有MLL 基因，故选择将检测探针与MLL上游引物配对，这样上游引物与探针可共用于检测13种融合 基因，减少成本。同时为了避免上下游引物探针之间的干扰，在第7和9外显子上各设计了两 对引物探针，可选择其中一组以最优化的组合方式与下游引物进行组对。MLL引物探针设计 方案见图1。
[0064] 2.上游MLL基因的断裂位点有6处之多，而下游各参与融合的基因其断裂位点也极 其繁多。其中AF9多以外显子3、4、5、6、9和10参与融合;AF6多第2外显子参与融合;AF4从外 显子6-13均可参与融合;AF1P多以外显子2、6和10参与融合;AF1Q以第2外显子参与融合； AF10以外显子4、6、8-16参与融合;AF17多以外显子7-9和11参与融合;AFX1第3外显子参与 融合;ELL多以外显子2、3、5和6参与融合;ENL以外显子2、4-7参与融合;SEPT6多第2外显子 参与融合;CBP多以外显子3和16参与融合;MLL基因内部部分序列的复制主要发生在MLL第 7-9外显子和MLL第3外显子产生融合。故本发明在下游引物设计时需兼顾各种融合方式能 检测到，又不宜使一个PCR反应体系中引物过于繁多，相互干扰。下游引物位置设计方案见 图1和图2。
[0065]各下游基因引物设置如下：
[0066] AF9基因：第5外显子上的引物用于检测第3或4或5外显子参与的融合;第6外显子 上的引物用于检测第6外显子参与的融合;第10外显子上的引物用于检测第9或10外显子参 与的融合。
[0067] AF6基因：第2外显子上的引物用于检测第2外显子参与的融合。
[0068] AF4基因：第7外显子上的引物用于检测第6或7外显子参与的融合;第9外显子上的 弓丨物用于检测第8或9外显子参与的融合;第13外显子上的引物用于检测第10或11或12或13 外显子参与的融合。
[0069] AF1P基因：第3外显子上的引物用于检测第2外显子参与的融合;第6外显子上的引 物用于检测第6外显子参与的融合;第10外显子上的引物用于检测第10外显子参与的融合。 [0070] AF1Q基因：第2外显子上的引物用于检测第2外显子参与的融合。
[0071] AF10基因：第6外显子上的引物用于检测第4或6外显子参与的融合;第10外显子上 的引物用于检测第8或9或10外显子参与的融合;第11外显子上的引物用于检测第11外显子 参与的融合;第15外显子上的引物用于检测第12或13或14或15外显子参与的融合;第16外 显子上的引物用于检测第16外显子参与的融合。
[0072] AF17基因：第9外显子上的引物用于检测第7或8或9外显子参与的融合;第11外显 子上的引物用于检测第11外显子参与的融合。
[0073] AFX1基因：第3外显子上的引物用于检测第3外显子参与的融合。
[0074] ELL基因：第3外显子上的引物用于检测第2或3外显子参与的融合;第6外显子上的 引物用于检测第5或6外显子参与的融合。
[0075] ENL基因：第2外显子上的引物用于检测第2外显子参与的融合;第6外显子上的引 物用于检测第4或5或6外显子参与的融合;第7外显子上的引物用于检测第7外显子参与的 融合。
[0076] SEPT6基因：第2外显子上的引物用于检测第2外显子参与的融合。
[0077] CBP基因：第3外显子上的引物用于检测第3外显子参与的融合;第16外显子上的引 物用于检测第16外显子参与的融合。
[0078] MLL基因：dupMLL检测的下游主要为第3外显子，故下游引物也设计在第3外显子。
[0079] 3.在上下游引物探针的组合方案上，本发明兼顾考虑引物二聚体，发夹结构等干 扰因素和均衡各组筛查引物的数量及经济效益，将各下游引物分别与5对上游引物及探针 进行逐一评估，确认最优组合，并将筛查方案设计如下：
[0080] 第一组:筛查MLL-AF9融合基因和检测内参ABL基因;MLL-AF9融合基因预后分层为 中等，区别于其他融合基因，单独进行筛查。MLL-AF9与ABL这两个基因通过不同的标记探针 "FAM"和"VIC"来进行区分。其引物探针序列如下：
[0093]第二组:筛查MLL-AF4和MLL-ENL融合基因。这两个融合基因较为常见，其引物探针 序列如下：
[0106] 第三组:筛查MLL-AF10和MLL-AF6融合基因。这两个融合基因较为常见，其引物探 针序列如下：
[0119] 第四组:筛查MLL-AF17，MLL-AF1Q，MLL-CBP和dupMLL融合基因。从检测情况来看这 四个融合基因相对少见，合并成一组进行筛查，其引物探针序列如下：
[0132] 第五组：筛查MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P和MLL-SEPT6融合基因。从检测情况来 看这四个融合基因相对少见，合并成一组进行筛查，其引物探针序列如下：
[0146] 综合上述因素，最终设计的引物探针及筛查分组方案如上所述。
[0147] 本发明还提供 了鉴定MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF4、MLL-AF1P、MLL-AF1Q、MLL-AF10、 MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、dupMLL这 13种融合基因的引 物探针，共用上游3组引物探针配对不同的下游引物进行检测。其引物探针序列如下：
[0148] 1.MLL-AF9融合基因检测引物探针：
[0242] 11 · MLL-SEPT6融合基因检测引物探针：
[0250] 12. MLL-CBP融合基因检测引物探针：
[0259] 13.dupMLL基因检测引物探针：
[0267]鉴定上述融合基因的引物探针还包括扩增作为内参的管家基因 ABL的引物和探 针，其核苷酸序列如下：
[0271] 本发明还提供了使用上述引物及探针筛查及鉴定MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF4、 MLL-AF1P、MLL-AF1Q、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、dupMLL这13种MLL重排相关融合基因的方法，包括以下步骤：
[0272] ⑴采用红细胞裂解液裂解红细胞的方法提取全血样本中的有核细胞。10 X红细胞 裂解液配方为：NH4C1 82g，NaHC038.4g，EDTA-Na2 3.72g，加 ddH20定容至 1000ml。⑵采用 TRI zo 1 RNA提取方法提取有核细胞中的总RNA，并将RNA反转录成cDNA。⑶以步骤2中的cDNA 为模版，进行MLL重排相关融合基因的初步筛查。筛查分第一组到第五组5个体系进行。反应 条件为:95°C预变性111^11 ;95°(：1〇8,581€5〇8，共40个循环;58°(：时采集荧光。(4)根据步骤3中 的检测结果，判断是第一到第五组中的哪一组为阳性。在内参ABL基因扩增正常(CT值彡32) 的情况下，各融合基因 CT值< 36判定为阳性。若第一组阳性，则为MLL-AF9融合基因阳性。在 临床应用中已经可以根据第一组阳性和非第一组阳性判断出预后的分层。第一组阳性预后 为中等，非第一组阳性则预后较差。非第一组阳性情况下，还可细分具体的融合基因：若第 二组阳性，则进一步鉴定MLL-AF4和MLL-ENL;若第三组阳性，则进一步鉴定MLL-AF10和MLL-AF6;若第四组阳性，则进一步鉴定MLL-AF17，MLL-AF1Q，MLL-CBP和dupMLL;若第五组阳性， 则进一步鉴定MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P，MLL-SEPT6 ;同时加入ABL基因作为内参。
[0273] 本发明还提供了一种用荧光PCR技术筛查及鉴定趾1^-4?9、11^?6、11^4?4、11^-AF1P、MLL-AF1Q、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、 dupMLL 13种常见MLL重排相关融合基因的组合物，其特征在于，所述组合物包括组合物1至 组合物5。组合物1包括筛查MLL-AF9融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列 包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF9-5R，AF9-6R，和 AF9-10R。组 合物2包括筛查MLL-AF4和MLL-ENL融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列 包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F1，MLL-7P1，MLL-9F2，MLL-9P2，AF4-7R，AF4-9R，AF4-13R，ENL-2尺4见-61^阳见-71?。组合物3包括筛查祖^-4?10和趾1^-4?6融合基因的引物和探针，所述 引物和探针的核苷酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2， 八卩10-61?，4?10-101?4?10-111?，4?10-151?4?10-161?和4?6-1?。组合物4包括筛查趾1^-4卩17， MLL-AF1Q，MLL-CBP和dupMLL融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列包括： MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF17-9R，AF17-11R，AF1Q-2R，CBP-3R，CBP-16R 和 dupMLL-R。组合物 5 包括筛查 MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P和MLL-SEPT6融合 基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7?2，11^-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，ELL-3R，ELL-6R，AFX1-3R，AF1P-2R，AF1P-6R，AF1P-10R和SEPT6-2R。
[0274] 本发明还提供了一种用荧光PCR技术筛查及鉴定趾1^-4?9、11^?6、11^4?4、11^-AF1P、MLL-AF1Q、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、 dupMLL 13种常见MLL重排相关融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括引物和探针，其核苷酸 序列包括：]?1^-5卩、]\11^-5?、]\11^-7卩1、]\11^-7?1、]\11^-7卩2、]\11^-7?2、]\11^-9卩1、]\11^-9?1、]\11^-9F2、MLL-9P2、AF9-5R、AF9-6R、AF9-10R、AF6-R、AF4-7R、AF4-9R、AF4-13R、AF1P-2R、AF1P-6R、AF1P-10R、AF1Q-2R、AF10-6R、AF10-10R、AF10-11R、AF10-15R、AF10-16R、AF17-9R、AF17-11R、AFX1-3R、ELL-3R、ELL-6R、ENL-2R、ENL-6R、ENL-7R、SEPT6-2R、CBP-3R、CBP-16R和 dupMLL-R。
[0275] 本发明的有益效果是:据统计，这13种MLL相关融合基因在AL中的发生率大概在5-10%，且在临床中对预后的评估具有重要意义。若采用多重巢式PCR进行筛查，则灵敏度、特 异性不能满足临床的要求，结果也不宜判断。若分管对各个融合基因都进行单独鉴定，则需 要进行13管检测，不仅要消耗病人更多的血样样本，同时增加试剂和人力成本。本发明利用 三对上游引物探针覆盖MLL基因98 %以上的断裂位点，对应多条下游引物覆盖对应基因> 99%的断裂方式，先进行筛查后进行鉴定，将筛查检查的反应体系缩减到5管，既节约了成 本，又增加了检测的通量，为大样本的筛查工作提供便利。同时将这种组合方式与荧光PCR 技术相结合，避免巢式PCR的开盖反应，提高了结果的准确性，避免污染的发生;也提高了结 果的易判断性，使检测结果更加客观易读。此外，在融合基因筛查和鉴定时引入"VIC"标记 的ABL探针，实现一管双检，又一步减少了反应体系。该方法利于临床结合骨髓检查、染色体 核型分析、免疫分型等结果综合评估疾病的发生发展及预后，同时有针对性地进行MRD的监 控，预测复发风险。该方法方便、经济、快捷，特异性好，灵敏度高，通量大，适于大批量样本 的临床检测。
【附图说明】
[0276] 图1和图2是本发明引物、探针设计区域示意图。
[0277] 图3是使用本发明引物探针及方法对第一个待检样本进行筛查及具体融合基因鉴 定的荧光扩增曲线图。
[0278] 图4是使用本发明引物探针及方法对第二个待检样本进行筛查的荧光扩增曲线 图。
[0279]图5是使用本发明引物探针及方法对第三个待检样本进行筛查及具体融合基因鉴 定的荧光扩增曲线图。
[0280]图6是使用本发明引物探针及方法对第四个待检样本进行筛查及具体融合基因鉴 定的荧光扩增曲线图。
[0281]图7是使用本发明引物探针及方法对第五个待检样本进行筛查及具体融合基因鉴 定的荧光扩增曲线图。
[0282] 图8是使用本发明引物探针及方法对第六个待检样本进行筛查及具体融合基因鉴 定的荧光扩增曲线图。
[0283] 图9是使用本发明引物探针及方法对第七个待检样本进行筛查的荧光扩增曲线 图。
【具体实施方式】
[0284] 实施例1:
[0285] 全血RNA的提取：在1.5ml离心管中加入lml IX红细胞裂解液，取待检全血样本 0.5ml，颠倒混匀。4000rpm离心3min，吸弃上清，加红细胞裂解液洗涤一次，得所需细胞;加1 ml Total RNA Isolation Reagent，反复吹吸直至无明显细胞团块，加入氯仿200μ1，漩祸 混匀30s，冰上静置1011^11。14,000印111，4°(：离心101^11。用移液器吸取上清液45(^1转移至另 一离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，颠倒混匀后在冰上静置lOmin。14，OOOrpm，4°C离心 10min。然后用75%的乙醇和无水乙醇分别洗涤离心一次。室温干燥5min，加入50μ1 DEPC-Η20溶解。
[0286] 实施例2:
[0287] 逆转录：取实施例 1 中RNA溶液4ul(浓度约200ng/ul)加 lul Primer mix(ReverTra Ace qPCR RT Kit)和 3ulDEPC-H20 混匀，70°C 预变性 5min;冰上骤冷 lmin 后加入 5*RT buffer4ul(ReverTra Ace qPCR RT Kit),Enzyme Mix lul(ReverTra Ace qPCR RT Kit), 并加 DEPC-H20 7ul至总体积为20111371:6011^11反应后98°C5min灭活，所得即为待检样本的 cDNA〇
[0288] 实施例3:
[0289] 多重荧光PCR筛查:根据下表所示各材料及用量配置筛查试剂。筛查试剂共含5个 反应管:第一组至第五组各一管;其中ABL为内参检测在第一组，用于判断RNA提取质量是否 符合要求。加入实施例2中所得cDNA各2ul。按如下程序进行检测:95°C预变性60s; 95°C 10s， 58°C 50s，共40个循环;58°C时采集荧光。所得结果如图3-A所示:筛查显示第二组阳性。 [0290]
[0293] 实施例4:
[0294] 根据实施例3所示结果，对第二组的各个融合基因进行分别鉴定。ABL内参基因与 MLL-ENL同一管反应体系进行检测。试剂配置如下表所示，并加入实施例2中所得cDNA各 2ul。检测程序同实施例3。所得结果如图3-B所示:融合基因鉴定为MLL-AF4阳性。该样本同 时进行染色体核型分析检测，确定为t(4;ll)(q21;q23)易位，两个方法学的结果相符合。
[0295]
[0296] 实施例5:
[0297] 对第二个待检样本按实施例1-3所述进行RNA提取，逆转录及多重荧光PCR筛查，所 得结果如图4所示:显示第一组阳性，则该样本为MLL-AF9融合基因阳性。该样本同时进行染 色体核型分析检测，确定20个细胞中15个细胞含有t (9; 11) (p22; q23)易位，两个方法学的 结果相符合。
[0298] 实施例6:
[0299] 对第三个待检样本按实施例1-3所述进行RNA提取，逆转录及多重荧光PCR筛查， 所得结果如图5-A所示:显示第三组阳性。对第三组的各个融合基因进行分别鉴定。ABL内参 基因与MLL-AF6同一管反应体系进行检测。试剂配置如下表所示，并加入实施例2中所得 cDNA各2ul。检测程序同实施例3。所得结果如图5-B所示:融合基因鉴定为MLL-AF6阳性。该 样本同时进行染色体核型分析检测，确定为t(6;ll)(q27;q23)易位，两个方法学的结果相 符合。
[0300]
[0301] 实施例7:
[0302]对第四个待检样本按实施例1-3所述进行RNA提取，逆转录及多重荧光PCR筛查，所 得结果如图6-A所示:显示第二组阳性。按实施例4对第二组的各个融合基因进行分别鉴定， 所得结果如图6-B所示:融合基因鉴定为MLL-ENL阳性。该样本同时进行染色体核型分析检 测，确定20个细胞中12个细胞含有t (11; 19)(q23;pl3.3)易位，两个方法学的结果相符合。 [0303] 实施例8:
[0304]对第五个待检样本按实施例1-3所述进行RNA提取，逆转录及多重荧光PCR筛查，所 得结果如图7-A所示：显示第四组阳性。对第四组的各个融合基因进行分别鉴定。ABL内参基 因与dupMLL同一管反应体系进行检测。试剂配置如下表所示，并加入实施例2中所得cDNA各 2ul。检测程序同实施例3。所得结果如图7-B所示:融合基因鉴定为MLL-AF1Q阳性。该样本同 时进行染色体核型分析检测，确定20个细胞中16个细胞含有t (1; 11) (q21; q23)易位，两个 方法学的结果相符合。
[0305]
[0307] 实施例9:
[0308] 对第六个待检样本按实施例1-3所述进行RNA提取，逆转录及多重荧光PCR筛查，所 得结果如图8-A所示:显示第四组阳性。按实施例8对第四组的各个融合基因进行分别鉴定， 所得结果如图8-B所示:融合基因鉴定为dupMLL阳性。由于dupMLL是染色体内的微小易位， 染色体核型分析无法识别。
[0309] 实施例10:
[0310] 对第七个待检样本按实施例1-3所述进行RNA提取，逆转录及多重荧光PCR筛查，所 得结果如图9所示:除内参ABL外，均无扩增曲线。经染色体核型分析结果确认为核型正常。
[0311] 各实施例结果总结如下：
[0312]
【主权项】
1. 一种用荧光 PCR 技术筛查及鉴定 MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF4、MLL-AF1P、MLL-AF1Q、 MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、dupMLL这13种MLL 重排相关融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列包括： MLL-5F:5 '-AGGTGCCTGAGGACTGTGGT-3 ' MLL-5P：5'-FAM-TTTGGTGGTCGCAATATAAAGAAGCAGTGC-TAMRA-3' MLL-7F1:5 '-CGCCTCAGCCACCTACTACAG-3 ' MLL-7P1:5 '-FAM-CGCCAAGAAAAGAAGTTCCCAAAACCACT-TAMRA-3， MLL-7F2:5 '-ACAGGACCGCCAAGAAAAG-3 ' MLL-7P2：5'-FAM-AAAGCAGCCTCCACCACCAGAATCAG-TAMRA-3' MLL-9F1：5'-AGGAGAATGCAGGCACTTTGA-3' MLL-9P1:5 '-FAM-CATCCTCAGCACTCTCTCCAATGGCAATA-TAMRA-3 ' MLL-9F2:5 '-GCAGGCACTTTGAACATCC-3 ' MLL-9P2：5'-FAM-TCAGCACTCTCTCCAATGGCAATAGTTCTAAG-TAMRA-3' AF9-5R:5 '-GCTGCTGCTGCTGGTATGAAT-3 ' AF9-6R:5 '-TGGCAGGACTGGGTTGTTC-3 ' AF9-10R:5 '-TAAGGTTCACGATCTGCTGC-3 ' AF6-R:5 '-GCGAGCGTTTCGATTACATC-3 ' AF4-7R:5 '-CTAGGCGTATGTATTGCTGTCA-3 ' AF4-9R:5 '-AGGTCGTCTTCGAGCATGGA-3 ' AF4-13R:5 '-TGCTGCCCTTACTCTCTGG-3 ' AF1P-2R:5 '-AGCCAACACCCTTCCAGTATT-3 ' AF1P-6R:5 '-AGGTTCCACTGATTAGCAAAGG-3 ' AF1P-10R:5 '-CTCCAATCCAGACACAAATCC-3 ' AF1Q-2R:5 '-GGCATCCTCCAGAAAAGAAAG-3 ' AF10-6R:5 '-TGTCATGCAAGCACCAGTG-3 ' AF10-10R:5 '-GAGGTGTGTGCAGAGACTTCCT-3 ' AF10-11R:5 '-TTTGAGCCCGCTTATATCCT-3 ' AF10-15R:5 '-GATCCCGAGCCAGATACTACA-3 ' AF10-16R:5 '-CCTGACTGAGAGAAGATCCAGA-3 ' AF17-9R:5，-AAGAGGAAGCCGAGGAGGA-3， AF17-11R:5 '-GAAGCAGAAGAGGAGGGGAG-3， AFX1-3R:5 '-CCTTGATGAACTTGCTGTGC-3 ' ELL-3R：5'-TTGGAGAGGTAGAAGGAGAACG-3' ELL-6R:5 '-GTAGCCAGGCCAGTCCTTCT-3 ' ENL-2R:5，-TCCAGTCGTGAGTGAACCC-3， ENL-6R:5 '-TCTTGCTGCTCTCCTTGTTG-3 ' ENL-7R:5 '-GGAGTTGGACGGGCTTGAC-3 ' SEPT6-2R：5'-GGACAGTTCGGCAACCTTC-3' CBP-3R：5'-CCAAATGGACTTGTGTTCCC-3' CBP-16R:5 '-CCACTTCCATTGGTTCTGATT-3 ' dupMLL-R:5 '-CACAGATGGATCTGAGAGGATAGC-3 '2. 根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于， 用于MLL-AF9融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF9-5R，AF9-6R和AF9-10R; 用于MLL-AF6融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2和AF6-R; 用于MLL-AF4融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F1，MLL-7P1，MLL-9F2，MLL-9P2，AF4-7R，AF4-9I^PAF4-13R ; 用于MLL-AF1P融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，AF1P-2R，AF1P-6R和AF1P-10R; 用于MLL-AF1Q融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1和AF1Q-2R; 用于MLL-AF10融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，AF10-6R，AF10-10R，AF10-11R，AF10-15R和AF10-16R; 用于MLL-AF17融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF17-9R和AF17-11R; 用于MLL-AFX1融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2和AFX1-3R; 用于MLL-ELL融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，ELL-3R 和 ELL-6R; MLL-ENL 融合基因检测的引物和探针的 核苷酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F1，MLL-7P1，MLL-9F2，MLL-9P2，ENL-2R，ENL-6R 和 ENL-7R； 用于MLL-SEPT6融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括^-5?^-5?，11^_ 7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2和SEPT6-2R; 用于MLL-CBP融合基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，CBP-3R和CBP-16R; 用于dupMLL基因检测的引物和探针的核苷酸序列包括:11^-5?肩1^-5?，11^-7?2，11^-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1和dupMLL-R。3. 根据权利要求1至2之一所述的引物和探针，其特征在于，还包括扩增作为内参的管 家基因 ABL的引物和探针，其核苷酸序列包括:ABL-F，ABL-R和ABL-P。4. 一种用荧光 PCR 技术筛查及鉴定 MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF4、MLL-AF1P、MLL-AF1Q、 MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、dupMLL 13 种常见 MLL重排相关融合基因的组合物，其特征在于，所述组合物包括组合物1至组合物5，其中： 组合物1包括筛查MLL-AF9融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列包 括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF9-5R，AF9-6R，和AF9-1OR; 组合物2包括筛查MLL-AF4和MLL-ENL融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷 酸序列包括：]?1^-5卩，]\11^-5?，]\1让-7卩1，]\11^-7?1，]\11^-9卩2，]\11^-9?2，八卩4-71?4卩4-91?4卩4-13R，ENL-2R，ENL-6R和ENL-7R; 组合物3包括筛查MLL-AF10和MLL-AF6融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷 酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，AF10-6R，AF10-10R， AF10-11R，AF10-15R，AF10-16I^PAF6-R; 组合物4包括筛查MLL-AF17，MLL-AF1Q，MLL-CBP和dupMLL融合基因的引物和探针，所述 引物和探针的核苷酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1， AF17-9R，AF17-11R，AF1Q-2R，CBP-3R，CBP-16R和dupMLL-R; 组合物5包括筛查MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P和MLL-SEPT6融合基因的引物和探针， 所述引物和探针的核苷酸序列包括:MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2， ELL-3R，ELL-6R，AFX1-3R，AF1P-2R，AF1P-6R，AF1P-1OR和SEPT6-2R。5. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，还包括扩增作为内参的管家基因 ABL的 引物和探针，其核苷酸序列包括ABL-F，ABL-R和ABL-P。6. 筛查及鉴定MLL重排相关融合基因的方法，其特征在于，包括以下步骤： ⑴采用红细胞裂解液裂解红细胞的方法提取全血样本中的有核细胞； ⑵采用TRI zo 1 RNA提取方法提取有核细胞中的总RNA，并将RNA反转录成cDNA; (3)以步骤2中的cDNA为模版，进行MLL重排相关融合基因的初步筛查，筛查分第一组到 第五组5个体系进行，反应条件为:95 °C预变性lmin; 95 °C 10s，58 °C 50s，共40个循环;58 °C时 米集焚光； ⑷根据步骤3中的检测结果，判断是第一到第五组中的哪一组为阳性，在内参ABL基因 扩增正常(CT值$32)的情况下，各融合基因 CT值<36判定为阳性;若第一组阳性，则为MLL-AF9融合基因阳性，在临床应用中已经可以根据第一组阳性和非第一组阳性判断出预后的 分层，第一组阳性预后为中等，非第一组阳性则预后较差，非第一组阳性情况下，还可细分 具体的融合基因：若第二组阳性，则进一步鉴定MLL-AF4和MLL-ENL;若第三组阳性，则进一 步鉴定MLL-AF10和MLL-AF6;若第四组阳性，则进一步鉴定MLL-AF17，MLL-AF1Q，MLL-CBP和 dupMLL;若第五组阳性，则进一步鉴定MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P，MLL-SEPT6;同时加入 ABL基因作为内参。 其中第一组至第五组检测用的引物和探针分别对应使用组合物1至组合物5中的引物 和探针，其中： 组合物1包括筛查MLL-AF9融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列包 括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF9-5R，AF9-6R，和AF9-10R; 组合物2包括筛查MLL-AF4和MLL-ENL融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷 酸序列包括：]?1^-5卩，]\11^-5?，]\1让-7卩1，]\11^-7?1，]\11^-9卩2，]\11^-9?2，八卩4-71?4卩4-91?4卩4-13R，ENL-2R，ENL-6R和ENL-7R; 组合物3包括筛查MLL-AF 10和MLL-AF6融合基因的引物和探针，所述引物和探针的核苷 酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，AF10-6R，AF10-10R， AF10-11R，AF10-15R，AF10-16I^PAF6-R; 组合物4包括筛查MLL-AF17，MLL-AF IQ，MLL-CBP和dupMLL融合基因的引物和探针，所述 引物和探针的核苷酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1， AF17-9R，AF17-11R，AF1Q-2R，CBP-3R，CBP-16R和dupMLL-R; 组合物5包括筛查MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P和MLL-SEPT6融合基因的引物和探针， 所述引物和探针的核苷酸序列包括:MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2， ELL-3R，ELL-6R，AFX1-3R，AF1P-2R，AF1P-6R，AF1P-1OR和SEPT6-2R。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，10 X红细胞裂解液配方为：NH4C1 82g， NaHC038 · 4g，EDTA-Na2 3 · 72g，加 ddH20定容至 1000ml。
【文档编号】C12Q1/68GK105969866SQ201610338956
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】邹媛, 杜翠, 陈红梅, 夏成青
【申请人】武汉艾迪康医学检验所有限公司