生产l-氨基酸的微生物及使用所述微生物生产l-氨基酸的方法
【专利摘要】公开了具有增强的L?氨基酸生产能力的重组微生物，其中所述重组微生物被转化而具有失活的其噬菌体受体，和使用所述重组微生物生产L?氨基酸的方法。重组微生物的使用可以使L?氨基酸能够以高度有效的方式生产。KCCM11501P20131213
【专利说明】
生产L-氨基酸的微生物及使用所述微生物生产L-氨基酸的 方法
技术领域
[0001]本发明涉及生产L-氨基酸的重组微生物和使用重组微生物生产L-氨基酸的方法。
【背景技术】
[0002] 已经使用各种使用微生物来大量生产有用代谢物，例如氨基酸的发酵方法，并且 此外，为了使用微生物进行成功的发酵，已经开发出许多技术，包括菌株开发、发酵条件的 建立，等等。特别地，为了开发用于大量生产有用的代谢物的宿主菌株，已经进行了许多尝 试以诱导特定基因的过表达或低表达。
[0003] 然而，在使用细菌的发酵生产中，有用的代谢物的生产可以由于噬菌体的污染而 降低。噬菌体的污染主要由能够使噬菌体附着于细菌表面的噬菌体受体引起，所述噬菌体 受体是蛋白质、脂质多糖，等等。在大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)的情况中，大肠杆 菌受到多种噬菌体攻击，因而，用于每种噬菌体的受体的研究已经获得相对成功。然而，噬 菌体受体和L-氨基酸生产之间的关系的研究仍然没有得到充分实施。
[0004]在这点上，本发明的发明人选择作为公知的噬菌体受体的基因，然后使基因中的 每种失活，以降低L-氨基酸生产降低的风险，该风险被认为是大肠杆菌的弱点。此后，确认 了对L-氨基酸生产的影响，并且对产L-氨基酸的菌株应用此类选择和基因的失活，从而完 成本发明。
[0005] 发明详述
[0006] 技术问题
[0007] 本发明提供了具有L-氨基酸生产能力和失活的噬菌体受体的重组微生物。
[0008] 本发明提供了使用微生物生产L-氨基酸的方法。
[0009] 技术方案
[0010]在一个方面中，本发明提供了生产L-氨基酸的重组微生物，其中NfrA和NfrB中的 至少一种是失活的。
[0011] 如本文中使用，术语"NrfA"指形成用于噬菌体N4的受体的蛋白质，并且可以是细 菌的膜蛋白。例如，NrfA可以是外膜蛋白的亚基。例如，NfrA可以包括SEQ ID N0:40的氨基 酸序列。例如，NfrA可以包括SEQ ID N0:40的氨基酸序列，或与SEQ ID N0:40的氨基酸具有 约80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多的序列同一性的氨基酸序列。编码 NfrA的基因的序列可以包括编码SEQ ID N0:40的氨基酸序列的多核苷酸序列。例如，编码 NfrA的基因的序列可以包括nfrA基因的序列(NCBI基因 ID: 12930896)。例如，编码NfrA的基 因的序列可以包括SEQ ID N0:39的多核苷酸序列，或与SEQ ID N0:39的多核苷酸序列具有 约80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多的序列同一性的多核苷酸序列。
[0012] 如本文中使用，术语"NfrB"指形成用于噬菌体N4的受体的蛋白质，并且可以是细 菌的膜蛋白。例如，NfrB可以是内膜蛋白的亚基。例如，NfrB可以包括SEQ ID N0:42的氨基 酸序列。例如，NfrB可以包括SEQ ID N0:42的氨基酸序列，或与SEQ ID N0:42的氨基酸具有 约80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多的序列同一性的氨基酸序列。编码 NfrB的基因的序列可以包括编码SEQ ID NO:42的氨基酸序列的多核苷酸序列。例如，编码 NfrB的基因的序列可以包括nfrB基因的序列（NCBI基因10:12933943)。例如，编码财池蛋白 的基因的序列可以包括SEQ ID N0:41的多核苷酸序列，或与SEQ ID N0:41的多核苷酸序列 具有约80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多的序列同一性的多核苷酸序 列。
[0013]另外，在生产L-氨基酸的重组微生物中，Tsx和FhuA中的至少一种可以是进一步失 活的。
[0014]如本文中使用，术语"Tsx"指形成核苷通道的蛋白质，即对核苷特异性的通道，并 且可以是形成用于噬菌体T6和大肠菌素 K的受体的组分。例如，Tsx可以包括SEQ ID N0:45 的氨基酸序列，或者与SEQ ID N0:45的氨基酸序列具有约80%或更多、85%或更多、90%或 更多、或95%或更多的序列同一性的氨基酸序列。编码基因 Tsx的基因的序列可以包含编码 SEQ ID N0:45的氨基酸序列的多核苷酸序列。例如，编码Tsx的基因的序列可以包括tsx基 因的序列（NCBI基因 ID: 12934188)。例如，编码Tsx的基因的序列可以包括SEQ ID N0:44的 多核苷酸序列，或与SEQ ID N0:44的多核苷酸序列具有约80%或更多、85%或更多、90%或 更多、或95%或更多的序列同一性的多核苷酸序列。
[0015] 如本文中使用，术语"FhuA"指转运(Fe3+)铁色素(ferrichrome)或抗生素，诸如阿 波霉素(albomycin)和利福霉素(rifamycin)的细菌外膜中的多功能蛋白，并且可以是菌 体T1、T5和phi80的受体。例如，FhuA可以包括SEQ ID N0:47的氨基酸序列，或与SEQ ID N0: 47的氨基酸序列具有约80 %或更多、85 %或更多、90 %或更多、或95 %或更多的序列同一性 的氨基酸序列。编码FhuA的基因的序列可以包括编码SEQ ID N0:47的氨基酸序列的多核苷 酸序列。例如，编码FhuA蛋白的基因的序列可以包括fhuA基因的序列（NCBI基因 ID : 12930751)。例如，编码FhuA的基因的序列可以包括SEQ ID N0:47的多核苷酸序列，或与SEQ ID N0:47的多核苷酸序列具有约80%或更多、85%或更多、90%或更多、或95%或更多的序 列同一性的多核苷酸序列。
[0016] 如本文中使用，术语"同一性"指两种氨基酸序列之间的相同性，其可以通过本领 域中公知的方法，例如BLAST 2.0算法测定，所述BLAST 2.0算法限定参数，诸如两种氨基酸 序列之间的得分、同一性、和相似性。
[0017] 如本文中使用，术语"重组微生物"指遗传修饰的微生物。重组微生物可以是遗传 工程化的微生物，并且例如，可以根据遗传工程方法将外源核酸导入微生物，或者可以转化 微生物中的内源基因的序列或位置。
[0018] 如本文中使用，术语"L-氨基酸"指构成生物体的机体并且具有与相同碳原子附着 的氨基基团和羧酸基团两者的蛋白质的基本结构单位。例如，L-氨基酸可以选自：L-亮氨 酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸和L-甲硫氨酸。例 如，L-氨基酸可以是L-色氨酸或L-苏氨酸。
[0019]如本文中使用，术语"酶或蛋白质是失活的"或"酶或蛋白质的失活"指上文描述的 蛋白质根本不在微生物中表达的情况、上文描述的蛋白质得到表达，但是没有任何活性的 情况、或上文描述的蛋白质得到表达，但是其活性与内在活性相比较弱的情况。如本文中使 用，术语"内在活性"指天然状态的微生物的活性，即最初存在于微生物中的活性，或者尚未 遗传修饰的蛋白质的活性。
[0020] 可以通过分别编码NfrA蛋白、NfrB蛋白、Tsx蛋白、和FhuA蛋白的基因的突变、缺失 或破坏引起NfrA蛋白、NfrB蛋白、Tsx蛋白、和FhuA蛋白的失活。如本文中使用，术语"基因的 突变、缺失或破坏"指突变、取代、缺失或用至少一个碱基插入部分或整个的基因或基因的 启动子或终止子区域上的调节因子，使得不表达基因或少量表达基因，或者在不显示酶促 活性的情况下或者在降低的酶促活性的情况下表达基因的情况。可以通过遗传操作，诸如 同源重组、诱变或分子进化实现基因的突变、缺失或破坏。当细胞包含多个相同基因或至少 两个同源基因时，可以在细胞中缺失或破坏一个或多个基因。为了失活本发明的一个实施 方案中提供的基因，可以实施使用lambda Red重组酶制备突变体的方法。
[0021] 重组微生物除去或降低本文中提供的每种蛋白质或组合的蛋白质的活性。因而， 与蛋白质活性没被失活的情况相比，重组微生物可以具有增强的L-氨基酸生产能力 (producibility)，并且因此，可以为了生产L-氨基酸的目的适当使用重组微生物。
[0022] 重组微生物可以是埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterbacter)、欧文氏 菌属（Erwinia)、沙雷菌属（Serratia)、普罗威登斯菌属（Providencia)、棒杆菌属 (Corynebacterium)、和短杆菌属(Brevibacterium)的微生物。例如，重组微生物可以是埃 希氏菌属的微生物。埃希氏菌属的微生物可以是大肠杆菌，例如大肠杆菌KCCM11501P。大肠 杆菌KCCM11501P是通过使用产苏氨酸的菌株(KCCM10910P)作为母本菌株，并且实施nfrA和 nfrB基因两者的缺失制备的KCCM10910PAnfrAB菌株。这里，发现了大肠杆菌KCCM11501P中 的糖消耗能力高于母本(KCCM10910P)中的。大肠杆菌KCCM11501P命名为"大肠杆菌CA03-8253P"，然后在布达佩斯条约下在2013年12月13日保藏于韩国微生物保藏中心(在下文，称 为 "KCCM"）。
[0023] 根据本发明的另一个方面，公开了生产L-氨基酸的方法，所述方法包括:培养生产 L-氨基酸的重组微生物;并且从培养产物中收集L-氨基酸。
[0024]生产L-氨基酸的重组微生物与上文的描述相同定义。
[0025] L-氨基酸可以选自：L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-异 亮氨酸、L-色氨酸和L-甲硫氨酸。例如，L-氨基酸可以是L-苏氨酸或L-色氨酸。可以使用适 当的培养基和根据本领域中公知的培养条件实现重组微生物的培养。另外，本领域普通技 术人员可以根据选定的微生物适当调节培养基和培养条件。培养方法可以包括分批培养、 连续培养、补料-分批培养、或其组合。
[0026] 培养基可以包含多种碳源、氮源和微量元素成分。
[0027] 例如，碳源可以包含碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，淀粉和纤维 素;脂肪，如大豆油，向日葵油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸，硬脂酸，亚油酸;醇，例 如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸，或其组合。重组微生物的培养可以通过使用葡萄糖作为 碳源进行。例如，氮源可以包括有机氮源，如蛋白胨，酵母提取物，肉汁，麦芽提取物，玉米浆 (CSL)和大豆粉;和无机氮源，如尿素，硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵;或其组合。 培养基可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢钾作为磷源。另外，培养基可包括对应于磷源的含钠 盐，和金属盐，如硫酸镁或硫酸铁。另外，培养基可包括氨基酸，维生素和适当的前体。培养 基或培养基的个别成分可以以分批或连续的方式加入到培养基中。
[0028] 另外，化合物，如氢氧化铵，氢氧化钾，氨水，磷酸和硫酸可以以适当的方式在重组 微生物的培养过程中加入到培养基中，以便调节培养基的pH值。此外，防沫剂，如脂肪酸聚 乙二醇酯，可在重组微生物的培养过程中使用的，以便抑制气泡的产生。为了维持培养基的 需氧条件，氧气或含氧气体的需氧条件(例如，空气)可以被注入到培养基中。这里，培养基 的温度通常可以在约20°C至约45°C的范围内。培养重组微生物的时段可以持续到获得L-氨 基酸的期望量，并且例如，培养重组微生物可以持续约10小时至约160小时。
[0029] 如本文中使用，术语"培养产物"指含有重组微生物的肉汤培养物、除去微生物细 胞的培养上清液、或培养产物的稀释溶液。培养基可以进一步包含用于提高L-氨基酸的生 产能力的成分。例如，组成可以进一步包含碳源、氮源或微量元素成分。
[0030] 可以通过本领域中已知的适当培养条件，如分批培养、连续培养、或补料-分批培 养实施从培养产物收集L-氨基酸，从而收集或回收培养产物中产生的L-氨基酸。
[0031] 本发明的有益效果
[0032] 根据一个方面，可以使用具有至少一种蛋白质的除去或降低的活性的微生物生产 L-氨基酸，所述蛋白质选自：NfrA蛋白、NfrB蛋白、Tsx蛋白和FhuA蛋白。
[0033]根据另一个方面，可以使用生产L-氨基酸的方法以高效的方式生产L-氨基酸。 实施例
[0034]在下文中，将参考以下实施例更为详细描述本发明。这些实施例仅为了例示的目 的，而并不意图限制本发明的范围。
[0035]实施例1:通过使用KCCM10910P制备具有失活的噬菌体受体的产苏氨酸的菌株 [0036]为了制备具有失活的噬菌体受体的产苏氨酸的菌株，使用KCCM10910P菌株(韩国 专利公开文本No: 10-0966324)作为母本菌株。然后，制备用于失活用于每种噬菌体受体的 基因的盒，然后用于允许遗传转化。
[0037] l-ι.制备具有失活的nfrA基因的产苏氨酸的菌株
[0038] 为了制备具有失活的nfrA基因的产苏氨酸的菌株，制备用于失活nfrA基因的盒。 所述盒使用一步失活的方法，该方法是由Datsenko KA等人(Proc Natl Acad Sci USA·， (2000)97:6640-6645)开发的使用lambda Red重组酶构建突变体的技术。为了确认盒对基 因的插入，使用pUCprmfmloxC的氯霉素抗性基因作为标志物(韩国专利N0:2009-007554)。
[0039] 通过使用SEQIDN0:2和3的引物组获得l.lkbDNA片段，该DNA片段包含nfrA基因 的序列（SEQ ID NO:39)的一部分和pUCprmfmloxC的氯霉素抗性基因的碱基序列的一部分。 这里，通过在下述条件下使用PCR预混合物试剂盒（即BI0NEER公司的产品，在下文中，使用 相同的产品）实施聚合酶链式反应(在下文中，称为"PCR"）：于95°C变性30秒，于56°C退火30 秒，和于72°C延长1分钟的27个循环。在0.8%琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，然后洗脱。此后， 通过在上文描述的相同条件下使用洗脱的产物作为模板和SEQ ID NO: 1和4的引物组再次 实施PCR，产生约1.2kb的DNA片段。在0.8 %琼脂糖凝胶上电泳DNA片段，然后洗脱，最终用于 制备用于失活nrf A基因的盒。
[0040] 为了制备具有失活的nfrA基因的产苏氨酸的菌株，将产苏氨酸的菌株 (KCCM10910P)(其依照Datsenko KA等人（Proc Natl Acad Sci USA. ,(2000)97:6640-6645)开发的方法转化有pKD46质粒)制备为感受态菌株。然后，将为了失活nfrA基因而制备 的盒的DNA导入菌株以允许转化。
[0041 ]在具有氯霉素抗性的LB板上选择获得的菌株。也就是说，使用SEQ ID NO: 5和6的 引物组(其具有位于用于基因组失活的盒的nfrA同源序列的两个末端外部的DNA序列），从 而选择所得的PCR产物的大小从2.8kb降低到1.5kb的菌落。
[0042]对具有氯霉素抗性的原代重组菌株除去pKD46质粒，然后导入pJW168质粒以从微 生物细胞除去氯霉素标志物基因 （Gene ,(2000)247,255-264)。然后，使用SEQ ID N0:5和6 的引物组实施PCR以获得0.4kb DNA产物，其指示最终获得的菌株具有降低的DNA大小。因 而，制备好具有失活的nfrA基因的产L-苏氨酸的菌株(KCCM10910P Δ nfrA)。
[0043] 1-2.制备具有失活的nfrB基因的产苏氨酸的菌株
[0044]为了制备具有失活的nfrB基因 （SEQ ID N0:41)的产苏氨酸的菌株，以与实施例1-1制备用于失活nfrA基因的盒中相同的方式制备用于失活nfrB基因的盒。通过使用SEQ ID N0:8和9的引物组获得l.lkb DNA片段，然后通过使用SEQ ID N0:7和10的引物组制备1.2kb DNA片段。
[0045]通过实施例1-1中描述的相同方法实施制备具有失活的nfrB基因的产苏氨酸的菌 株的方法，其中使用SEQ ID NO: 11和12的引物组来确认所得的PCR产物的大小。因而，最终 制备具有失活的nfrB基因的产L-苏氨酸的菌株(KCCM10910P Δ nfrB)。
[0046] 1-3.制备具有失活的nfrAB基因的产苏氨酸的菌株
[0047]为了制备具有失活的nfrAB基因 （SEQ ID N0:43)的产苏氨酸的菌株，以与实施例 1-1制备用于失活nfrA基因的盒中相同的方式制备用于失活nfrAB基因的盒。通过使用SEQ ID N0:2和9的引物组获得l.lkb DNA片段，然后通过使用SEQ ID NO: 1和10的引物组制备 1.2kb DNA片段。
[0048]通过实施例1-1中描述的相同方法实施制备具有失活的nfrAB基因的产苏氨酸的 菌株的方法，其中使用SEQ ID N0:5和12的引物组来确认所得的PCR产物的大小。因而，最终 制备具有失活的nfrAB基因的产L-苏氨酸的菌株(KCCM10910P Δ nfrAB)。
[0049] 1-4.制备具有失活的tsx基因的产苏氨酸的菌株
[0050] 为了制备具有失活的tsx基因 （SEQ ID N0:44)的产苏氨酸的菌株，以与实施例1-1 制备用于失活nfrA基因的盒中相同的方式制备用于失活tsx基因的盒。通过使用SEQ ID NO: 13和14的引物组获得l.lkb DNA片段，然后通过使用SEQ ID NO: 15和16的引物组制备 1.2kb DNA片段。
[0051] 通过实施例1-1中描述的相同方法实施制备具有失活的tsx基因的产苏氨酸的菌 株的方法，其中使用SEQ ID N0:17和18的引物组来确认所得的PCR产物的大小。因而，最终 制备具有失活的tsx基因的产L-苏氨酸的菌株(KCCM10910P Δ tsx)。
[0052] 1-5.制备具有失活的fhuA基因的产苏氨酸的菌株
[0053]为了制备具有失活的fhuA基因 （SEQ ID N0:46)的产苏氨酸的菌株，根据上文描述 的一步失活的方法制备用于失活fhuA基因的盒。为了获得与fhuA基因的序列具有同源性的 碱基序列的DNA片段，使用SEQ ID N0:19和20的引物组和SEQ ID N0:21和22的引物组，导致 产生PCR产物。另外，为了获得含具有氯霉素抗性的碱基序列的DNA片段，使用SEQ ID N0:23 和24的引物组，导致产生PCR产物。因而，在0.8 %琼脂糖凝胶上电泳这三种所得的PCR产物， 然后洗脱。通过使用这三种洗脱的PCR产物作为模板和SEQ ID N0:19和22的引物盒实施PCR 以制备用于失活fhuA基因的盒。
[0054] 为了制备具有失活的fhuA基因的产苏氨酸的菌株，通过实施例1-1中描述的相同 方法实施制备用于失活fhuA基因的盒，其中使用SEQ ID N0:25和26的引物组来确认所得的 PCR产物的大小。因而，最终制备具有失活的fhuA基因的产L-苏氨酸的菌株(KCCM10910PA fhuA) 〇
[0055] 1-6.制备具有失活的lamB基因的产苏氨酸的菌株
[0056]为了制备具有失活的lamB基因 （SEQ ID N0:48)的产苏氨酸的菌株，通过实施例1-1中描述的相同方法实施制备用于失活lamB基因的盒。通过使用SEQ ID N0:27和28的引物 组获得l.lkb DNA片段，然后通过使用SEQ ID N0:29和30的引物组制备1.2kb DNA片段。 [0057]通过实施例1-1中描述的相同方法实施制备具有失活的lamB基因的产苏氨酸的菌 株的方法，其中使用SEQ ID N0: 31和32的引物组来确认所得的PCR产物的大小。因而，最终 制备具有失活的lamB基因的产L-苏氨酸的菌株(KCCM10910P Δ lamB)。
[0058] 1-7.制备具有失活的btuB基因的产苏氨酸的菌株
[0059]为了制备具有失活的btuB基因 （SEQ ID N0:50)的产苏氨酸的菌株，通过实施例1-1中描述的相同方法实施制备用于失活btuB基因的盒。通过使用SEQ ID N0:33和34的引物 组获得l.lkb DNA片段，然后通过使用SEQ ID N0:35和36的引物组制备1.2kb DNA片段。 [0060]通过实施例1-1中描述的相同方法实施制备具有失活的btuB基因的产苏氨酸的菌 株的方法，其中使用SEQ ID N0: 37和38的引物组来确认所得的PCR产物的大小。因而，最终 制备具有失活的btuB基因的产L-苏氨酸的菌株(KCCM10910P Δ btuB)。
[0061 ]实施例2:重组微生物间的L-苏氨酸生产能力的比较
[0062] 在锥形瓶中在含有下文表1中显示的组成的苏氨酸滴定培养基中培养根据实施例 1制备的重组微生物。然后，确认重组微生物是否具有L-苏氨酸的生产能力。
[0063] 【表1】
[0065]在25ml含有上文表1中显示的组成的滴度培养基中接种1铂环的在33°C的培养箱 中在LB固体培养基中培养过夜的实施例1的7类大肠杆菌菌株之每种和KCCM10910P菌株，然 后在培养箱中在33°C并且以200rpm培养48小时。
[0066]【表2】
[0069] 如上文表2中显示，确认分别具有失活的11；1^\、11；^13、11；1^413、七81和;〇11^基因的菌株 的糖消耗率高于母本菌株(KCCM10910P)的糖消耗率。还确认了菌株的生产速率在48小时时 段期间不降低。同时，确认分别具有失活的lamB和btuB基因的菌株的糖消耗率类似于母本 菌株的糖消耗率，或略低于母本菌株的糖消耗率。还确认了 48小时后的培养物菌株中显示 的L-苏氨酸浓度都是类似的。分别具有失活的nfrA、nfrB和nfrAB基因的菌株产生相同的培 养结果。也就是说，两种基因之一被缺失的情况和两种都被缺失的情况产生相同的结果。
[0070] 实施例3:制备具有有效突变组合的菌株和其L-苏氨酸生产能力的比较
[0071] 3-1.制备具有同时失活的nfrAB和fhuA基因、同时失活的nfrAB和tsx基因、和同时 失活的nfrAB、tsx和fhuA基因的菌株
[0072 ]为了确认具有增加的糖消耗能力的nfrAB、fhuA和tsx基因的组合失活的情况是否 在产L-苏氨酸的菌株中具有进一步的糖消耗能力，制备KCCM10910P Δ nfrAB Δ fhuA菌株、 KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx菌株和KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx Δ fhuA菌株。为了制备这些菌 株，以与实施例1中的描述相同的方式根据实施例1-3的KCCM10910PAnfrAB菌株制备分别 具有失活的fhuA和tsx基因的菌株(产生KCCM10910P Δ nfrAB Δ fhuA和KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx菌株）。另外，根据KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx菌株制备具有失活的fhuA基因的菌株，从 而最终制备KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx Δ fhuA菌株。
[0073] 如表2中显示，确定具有失活的nfrA、nfrB和nfrAB基因的菌株彼此具有相同的效 果。在这点上，在制备具有有效突变组合的菌株中，通过使用具有失活的nfrAB基因的菌株 制备具有失活的tsx和fhuA基因的菌株。然而，确定具有失活的tsx和fhuA基因的菌株的效 果与具有仅失活的nfrA基因、仅失活的nfrB基因、或同时失活的nfrA和nfrB基因的菌株的 效果相冋。
[0074] 3-2.具有有效的突变组合的菌株的L-苏氨酸生产能力的比较
[0075]为了比较上文制备的具有有效突变组合的菌株的L-苏氨酸生产能力，使用含有上 文表1中显示的组成的培养基以与上文描述的相同方式培养菌株。
[0076] 下文表3中显示了结果。
[0077] 【表3】
[0078]
[0079 ]作为具有增加的糖消耗能力的分别根据nf r AB、f huA、和t s X基因的组合失活制备 的KCCM10910P Δ nfrAB Δ fhuA菌株、KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx菌株和KCCM10910P Δ nfrAB Δ tsx Δ fhuA菌株上的效力测试的结果，确认除了仅通过nfrAB基因的突变外进一步失活fhuA 基因或tsx基因的菌株增加糖消耗能力。因而，显示增加的糖消耗能力的经转化的大肠杆菌 KCCM10910P Δ nfrAB菌株命名为"CA03-8253P"，并且在2013年12月13日保藏于韩国微生物 保藏中心(KCCM)(保藏号:KCCM 11501P)。
[0080]实施例4:通过使用KCCM-10132制备具有失活的噬菌体受体的菌株和其苏氨酸生 产能力的比较
[0081 ] 4-1.通过使用KCCM-10132制备具有失活的噬菌体受体的菌株
[0082]根据实施例1的7类失活盒，以与实施例1和3中描述的相同方式，通过使用KCCM-10132菌株制备各自具有失活的噬菌体受体的10类菌株(参见下文表4) ICCM-10132菌株在 韩国专利申请No: 10-0270510中以从大肠杆菌衍生的具有苏氨酸生产能力的菌株公开。 [0083] 4-2.通过使用KCCM-10132制备具有失活的噬菌体受体的菌株及其苏氨酸生产能 力的比较。
[0084]通过与实施例2中描述的相同方法在含有表1中显不的组成的培养基中培养通过 使用实施例4-1的KCCM-10132菌株制备的具有失活的噬菌体受体的10类菌株和母本菌株 (KCCM-10132)。然后，通过比较其苏氨酸的生长能力评估培养的菌株。
[0085]【表4】
[0087] 如上文表4中显示，确认了分别具有失活的11；1^4、11；^13、11；1^\13、七81和;〇11^基因的菌 株的糖消耗率高于母本菌株(KCCM-10132)的糖消耗率。还确认了菌株的生产速率在48小时 时段中没有降低。同时，确认了分别具有失活的lamB和btuB基因的菌株的糖消耗率类似于 母本菌株的糖消耗率，或者略低于母本菌株的糖消耗率。还确认了48小时后培养物的菌株 中显示的L-苏氨酸浓度都是相似的。还确认了分别具有同时失活的nfrAB、fhuA、nfrAB和 tsx基因和同时失活的nfrAB、tsx和fhuA基因的菌株与仅具有失活的nfrAB基因的菌株的糖 消耗率相比具有改善的糖消耗率。
[0088]实施例5:通过使用KCCM11166P制备具有失活的噬菌体受体的菌株及其苏氨酸生 产能力的比较
[0089] 5-1.通过使用KCCM11166P制备具有失活的噬菌体受体的菌株 [0090]根据实施例1的7类失活盒，通过以与实施例1中描述的相同方式（韩国专利申请 No: 10-1261147)使用KCCM11166P(韩国专利申请N0:10-1261147)制备分别具有失活的噬菌 体受体的7类产色氨酸的菌株。
[0091] 5-2.通过使用KCCM11166P制备具有失活的噬菌体受体的菌株及其苏氨酸生产能 力的比较
[0092]为了评估通过使用实施例5-1的KCCM11166P菌株制备的分别具有失活的噬菌体受 体的7类产色氨酸的菌株的生产能力，使用含有下文表5中显示的组成的培养基。也就是说， 通过铂环接种微生物细胞，然后在LB固体培养基中培养过夜。此后，将1铂环的每种微生物 在25ml含有下文表5中显示的组成的滴度培养基中接种，然后在培养箱中在37°C和以 200r Pm培养48小时。从其获得的结果显示于下文表6中。
[0098] 如上文表6中显示，在11；1^4、11；1^13、11；1^413、七81和;1^111^基因中的每种的缺失的情况 中，确认了分别具有失活的1^^、11；^13、11；^413、七81和;^11^基因的菌株中生成的色氨酸的量 是类似的，而分别具有失活的11；^4、11；^8、11；^48、丨81和;〇11^基因的菌株的糖消耗率略高于 其它菌株。同时，在lamB和btuB基因中的每种的缺失的情况中，确认了由分别具有失活的 lamB和btuB基因的菌株生成的色氨酸的量或分别具有lamB和btuB基因失活的菌株的糖消 耗率没有变化。
[0099]实施例6:制备具有有效突变组合的菌株及其L-色氨酸生产能力的比较
[0100] 6-1.制备具有同时失活的nfrAB和fhuA基因、同时失活的nfrAB和tsx基因、和同时 失活的nfrAB、tsx和fhuA基因的产L_色氨酉爱的菌株
[0101] 为了确认具有增加的糖消耗能力的nfrAB、fhuA和tsx基因的组合失活的情况在产 色氨酸的菌株中是否具有进一步的糖消耗能力，制备KCCM11166P Δ nfrAB Δ fhuA菌株、 KCCM11166P Δ nfrAB Δ tsx菌株、和KCCM11166P Δ nfrAB Δ tsx Δ fhuA菌株。
[0102] 6-2.具有有效突变组合的菌株的L-色氨酸生产能力的比较
[0103] 为了比较根据实施例6-1制备的三类菌株的L-色氨酸生产能力，使用含有上文表5 中显不的组成的培养基以与实施例5中描述相同的方式培养菌株。下文表7中显不了结果。
[0104] 【表7】
[0107] 作为具有有效突变组合的产色氨酸的菌株上的效力测试的结果，确认了在仅通过 nfrAB基因的突变外进一步失活fhuA基因或/和tsx基因的菌株增加糖消耗能力。
[0108] 应当理解，本文中描述的示例性的实施方案应当仅在描述的意义上而不出于限制 目的考虑。每个实施方案内的特征或方面的描述通常应当视为可用于其它实施方案中的其 它类似的特征或方面。虽然已经参考附图描述了本发明的一个或多个实施方案，但是本领 域普通技术人员应当理解，可以在不偏离以所附权利要求书限定的本发明的精神和范围的 前提下对其进行形式和细节上的各种变化。
[0109] [保藏号]
[0110] 保藏机构:韩国微生物保藏中心（国际）
[0111] 保藏号:KCCM11501P
[0112] 保藏日：2013年12月13日
【主权项】
1. 生产L-氨基酸的埃希氏菌属的重组微生物，其中NfrA和NfrB中的至少一种是失活 的。2. 权利要求1的重组微生物，其中所述NfrA包含SEQ ID N0:40的氨基酸序列，并且所述 NfrB包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。3. 权利要求1的重组微生物，其中Tsx和FhuA的至少一种是进一步失活的。4. 权利要求3的重组微生物，其中所述Tsx包含SEQ ID NO: 45的氨基酸序列，并且所述 FhuA包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。5. 权利要求1的重组微生物，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸或L-色氨酸。6. 权利要求1的重组微生物，其中所述重组微生物是大肠杆菌。7. 生产L-氨基酸的方法，所述方法包括： 培养权利要求1至6中任一项的重组微生物;并 从培养物中收集L-氨基酸。8. 权利要求7的方法，其中所述L-氨基酸是L-苏氨酸或L-色氨酸。
【文档编号】C12P13/04GK105980544SQ201580006219
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年3月17日
【发明人】李知宣, 徐昌, 徐昌一, 丁起龙, 高恩圣, 权刀显, 李光镐
【申请人】Cj第制糖株式会社, Cj第一制糖株式会社