柳叶蜡梅总生物碱提取物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明属于医药和保健品领域，具体涉及柳叶蜡梅总生物碱提取物及其单体化合物在制备治疗消化道肿瘤疾病方面的药物或保健品中的应用。本发明从蜡梅科蜡梅属植物柳叶蜡梅中提取和制备柳叶蜡梅总生物碱提取物及其山蜡梅碱类单体化合物（1?4），并经实验证实，所述柳叶蜡梅总生物碱提取物能显著抑制胃癌SGC-7901、结肠癌SW1116、结肠癌HCT116细胞的增殖和诱导癌细胞凋亡；所述生物碱单体化合物对胃癌SGC-7901、结肠癌SW1116、结肠癌HCT116细胞具有不同程度的抑制作用。本发明的柳叶蜡梅提取物及其单体化合物可单独应用或者合用，或与适宜的赋形剂结合，按照常规方法制成口服或非口服剂型用于治疗或辅助消化道肿瘤疾病，尤其是制成治疗胃癌和结肠癌的药物或保健制品。
【专利说明】
柳叶蜡梅总生物碱提取物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药和保健品领域，具体涉及柳叶蜡梅总生物碱提取物及其制备方 法和应用，具体涉及柳叶蜡梅总生物碱提取物及其单体化合物在制备治疗消化道肿瘤疾病 方面的药物或保健品中的应用。 技术背景
[0002] 现有技术公开了胃癌和结肠癌是我国常见的消化系肿瘤，就发病率和死亡率而 言，胃癌在我国居各种恶性肿瘤的首位，而结肠癌在我国也是处于逐年上升的趋势，在发达 国家要列于前三位。对于消化系的两大常见肿瘤，现代医学通常是以手术治疗为主、化疗为 辅，医疗实践显示，上述治疗干预措施副作用大，且术后复发转移几率非常高，并发症较多， 因此，目前在预防和治疗方面缺乏有效的措施和方法。中医药是中华民族的瑰宝，有标本兼 治、虚实并治、缓急兼收之功效，近年来中医药在治疗恶性肿瘤方面已取得了良好效果。因 此，如何在中医理论指导下发掘中医特色和优势，开发毒副作用小、疗效可靠、经济安全、使 用方便的中草药制剂或中药新药治疗恶性肿瘤是一个亟待探索的课题。
[0003] 畲药是我国民族特色药物之一，在畲族中有着悠久的应用历史。柳叶蜡梅 (Chimonanthus salicifolius)，俗称石凉茶、食凉撑、山錯茶，是我国浙江丽水畲族人民应 用最广泛的的草药之一。经检测畲乡民间用柳叶蜡梅的叶加工制成食凉茶中主要含有桉叶 素、生物碱、黄酮类和鲨肌醇等成分，其中VB1、VB2、VC含量丰富，并含有18种人体必需的氨 基酸，同时还含有铁、锌、钙、镁、硒等人体必需的微量元素，是一种很好的天然保健药。1997 年版中国药典一部收载"柳叶蜡梅叶及其制剂柳叶蜡梅茶"有祛风解表、清热解毒之功效， 用于防治感冒和流行性感冒。且由柳叶蜡梅叶中提取的挥发油成分研制而成的脾胃舒胶 囊，具有理气健脾、消食化积之功效，临床用于治疗寒湿困脾、肝胃不和的消化功能紊乱、胃 部疾患等症。此外，有临床研究采用柳叶蜡梅提取物用于辅助化疗胃肠道恶性肿瘤（胃癌、 大肠癌)的治疗。然而，迄今尚未见柳叶蜡梅提取物用于胃癌、结肠癌药物上的应用，更未见 关于柳叶蜡梅总生物碱提取物及其生物碱单体化合物的相关研究的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供新的治疗消化道肿瘤疾病的药物或保健品，具体涉及柳叶 蜡梅总生物碱提取物及其制备方法和应用，更具体涉及柳叶蜡梅总生物碱提取物及其单体 化合物和在制备治疗消化道肿瘤疾病的药物或保健品中的应用。
[0005] 本发明经研究证实，柳叶蜡梅中含有生物碱成分，且在随机活性筛选实验中发现 总生物碱提取物对消化道肿瘤细胞具有抑制活性，因此，所述的柳叶蜡梅总生物碱提取物 及其山蜡梅碱类单体化合物可进一步用于制备治疗消化道肿瘤疾病的药物或保健品。
[0006] 本发明中，还提供了柳叶蜡梅总生物碱提取物及其山蜡梅碱类单体化合物（1- 4) 的提取和制备方法。
[0007] 本发明的活性成分柳叶蜡梅总生物碱提取物及其山蜡梅碱类单体化合物可从柳 叶蜡梅枝和叶经由本领域所涉常规的方法制备而得。
[0008] 具体的，本发明的柳叶蜡梅总生物碱提取物，可通过下述方法制得：以柳叶蜡梅 枝叶为原料，采用溶剂提取法制成浓缩提取物。所采用的溶剂提取法中，可以选用水、甲 醇、乙醇、丙酮等单一溶剂或多种溶剂的混和溶剂，以50~95%乙醇为最佳提取溶剂，在室 温下浸渍提取或加热条件下回流提取，提取次数为2~3次，提取液浓缩后悬浮于适量3% 酒石酸水溶液中，以等体积的乙酸乙酯萃取2~3次；酒石酸水溶液以Na 2C03调节pH值 至10,然后用氯仿进行萃取，获得总生物碱(氯仿提取物）；进一步，经柱色谱分离、纯化， 从柳叶錯梅氯仿提取物中依次得到下式单体化合物salicifoxazines A (1)和B (2)， (-)-chimonanthine (3)和（meso)-chimonanthine (4)，
其中，所述的单体化合物1和2,通过1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR和MS，确定其化学结构如 下式所示：
Salicifoxazine A (1) ：[a ]D-243. 9 (c 0. 37, MeOH) ; UV (MeOH) Anax(l〇g e) 241 (3.87), 298 (3.45) nm; IR (film) vnax： 3279, 2930, 2850, 1604, 1483, 1379 cm1; 4-匪1? (400MHz，CDC13):S 2.44 (2H, m, overlapped, H-2), 2.63 (1H, ddd, overlapped, H-3), 1.71 (1H, td, 4.9, 11.8, H-3), 7.16 (1H, dd, 7.5, 1.0, H-4), 6.74 (1H, td, 7.5, 1.0, H-5), 7.07 (1H, td, 7.5, 1.0, H-6), 6.61 (1H, dd, 7.5，1.0，H-7), 4.47 (1H, brs, H-8a), 2.27 (3H, s, N「CH3); S 2.66 (1H, ddd, overlapped, H-2'），2.33 (1H，td，11.3，3.5，H-2'），2.45 (1H，m，H-3'），2.02 (1H，ddd，2.2，3.5，13.3，H-3'），7.21 (1H，dd，7.5，1.0，H-4'），6.86 (1H，td， 7.5，1.0，H-5'），7.17 (1H，td，7.5，1.0，H-6'），6.71 (1H，dd，7.5，1.0，H-7'）， 5.11 (1H，brs，H-8a'），2.41 (3H，s，&，-〇13);13C-NMR (100 MHz, CDC13): S 52.9 (C-2)， 34.3 (C-3)， 125.7 (C-4)， 118.6 (C-5)， 128.3 (C-6)， 109.2 (C-7)， 64.1 (C-3a), 132.3 (C-4a), 151.1 (C-7a), 85.2 (C-8a), 37.2 (N「CH3); S 53.8 (C-2，）， 27.3 (C-3'），125.1 (C-4'），118.8 (C-5'），128.5 (C-6'），109.5 (C-7'），50.9 (C-3a'），129.4 (C-4a'），151.1 (C-7a'），93.2 (C-8a'），46.3 (Ni'-CHd; (+) ES頂S m/z 363 [M+H] + ; EIMS m/z (rel. int. ) 362 (6.8), 173 (50.0), 172 (50.7), 143 (69.4), 130 (96.7); HRESIMS m/z 363.2176 [M+H]+ (calcd for C22H27N40, 36 3 . 2 1 79, A = -〇. 9 ppm). Salicifoxazine B (2)：[a]D-2. 2 (c 0.32, MeOH) ; UV (MeOH) Anax (log e) 241 (3.62), 294 (3.20) nm; IR (film) vnax： 3265, 2925, 2848, 1605, 1483, 1379 cm1; iH-NMRUOOMHzJDClJJ 2.67 (1H, m, H-2), 2.43 (1H, m, overlapped, H-2), 2.53 (1H, ddd, 6.5, 8.3, 11.8, H-3), 1.84 (1H, m, H-3), 6.51 (1H, d, overlapped, H-4), 6.47 (1H, t, 7.5, H-5), 6.97 (1H, t, 7.5, H-6), 6.47 (1H, d, 7.5, H-7), 4.83 (1H, brs, H-8a), 2.39 (3H, s, N「CH3); S 2.83 (1H, ddd, 3.8，5.3，10.2， H-2'），2.46 (1H, m, H-2'），2.46 (1H, m, overlapped, H-3'），2.38 (1H, m， overlapped, H_3'），6.61 (1H, d, overlapped, H_4'），6.75 (1H, t, 7.5，H_5'）， 7.12 (1H，t，7.5，H-6'），6.55 (1H，d，7.5，H-7'），5.26 (1H，brs, H-8a'），2.49 (3H, s, Nr-CH3) ; 13C-NMR (100 MHz, CDC13) : 8 52. 7 (C-2), 35.0 (C-3), 124.9 (C-4), 118.2 (C-5), 127.9 (C-6), 108.8 (C-7), 64.3 (C-3a), 132.3 (C-4a), 150.9 (C-7a), 83.6 (C-8a), 36.4 (N「CH3); S 53.9 (C-2'），28.4 (C-3'），123.8 (C-4'）， 118.9 (C-5'），128.4 (C-6'），109.7 (C-7'），50.8 (C-3a'），130.4 (C-4a'），150.7 (C-7a, ), 92.3 (C-8a, ), 46.4 (Nr-CH3) ; (+) ESIMS m/z 363 [M+Na] + ; EIMS m/z 362 (5.0), 173 (81.3), 172 (100.0), 143 (31.5), 130 (80.9); (+) HRESIMS m/z 385.1995 [M+H]+ (calcd for C22H26N40Na, 385.1999, A = -1. 0 ppm). 〇
[0009] 本发明进行了 MTT活性测试实验，结果表明所述的，柳叶蜡梅总生物碱提取物及 其山蜡梅碱类单体化合物对胃癌SGC-7901，结肠癌SW1116、HCT116细胞具有明显的抑制作 用。
[0010] 本发明所述的柳叶蜡梅提取物及其单体化合物可单独应用或者合用，或与适宜的 赋形剂结合，按照常规方法制成口服或非口服剂型用于治疗消化道肿瘤疾病，尤其是制成 治疗胃癌和结肠癌的药物。
[0011] 本发明所述的柳叶蜡梅提取物及其单体化合物可单独应用或者合用，或与适宜的 赋形剂结合，按照常规方法制成口服或非口服剂型用于辅助治疗消化道肿瘤疾病保健品制 剂，尤其是制成辅助治疗胃癌和结肠癌的药物保健品制剂。
[0012] 本发明的优点是： 1，提供了柳叶蜡梅总生物碱提取物及山蜡梅碱类单体化合物对消化道肿瘤，尤其是胃 癌和结肠癌的治疗新用途，且应用前景广阔； 2, 其中的单体化合物1 -4结构独特，尤其是其中的化合物1和2为从腊梅科植物中获 得的具有六元氮氧杂环的新化合物，天然产物中此类结构十分罕见； 3, 柳叶蜡梅在我国南方分布广泛，自然资源丰富，价廉易得； 4, 柳叶蜡梅总生物碱提取物及单体化合物的提取及制备工艺简便易行，作为治疗消化 道肿瘤的药物，能有效简化治疗方案，降低治疗成本。
【具体实施方式】
[0013] 下述实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本 领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书 的范围内。
[0014] 实施例1:制备柳叶蜡梅总生物碱提取物 取干重2. 0 kg柳叶蜡梅枝叶，粉碎，用3倍量的90%甲醇室温冷浸24小时，共3次。合 并3次提取液，减压浓缩，得到300 g浸膏，浸膏用2倍量的3%酒石酸水溶液混悬，用与混 悬液等体积的乙酸乙酯进行萃取三次，然后用Na2C0 3将酒石酸水溶液部分调至pH = 10,再 用氯仿萃取三次，氯仿萃取部分减压浓缩后得浸膏2. 3 g，即为柳叶蜡梅总生物碱提取物。
[0015] 实施例2:制备柳叶蜡梅总生物碱提取物 取干重2. 0 kg柳叶蜡梅枝叶，粉碎，用80%乙醇室温下回流3小时，重复3次，合并提 取液，减压浓缩得浸膏330 g，浸膏用2倍量的3%酒石酸水溶液混悬，用与混悬液等体积的 乙酸乙酯萃取三次，然后用Na2C0 3将酒石酸水溶液调至pH = 10,以等体积氯仿萃取三次， 氯仿萃取部分减压浓缩后得柳叶蜡梅总生物碱提取物浸膏2. 6 g。
[0016] 实施例3:制备生物碱单体化合物（1 - 4 ) 将制得的2.0 g总生物碱浸膏以等倍硅胶（100~200目）拌样，以50倍量的硅胶 (200~300目）进行柱层析，用二氯甲烷：甲醇作为流动相梯度洗脱洗脱(体积比1:0 - 0:1)。收集二氯甲烷：甲醇（15:1，体积比）洗脱组分，该组分继续过硅胶柱，采用二氯 甲烷：甲醇50 :1、30:1、10:1洗脱，对30:1洗脱组分采用制备HPLC进行纯化，以甲醇： 水：二乙胺（68:32:0. 05%)等度洗脱，收集17. 2 min组分，得到12. 2 mg白色无定形 粉末（-)-chimonanthine (3)，收集13.0 min组分，得到8.1 mg的白色无定形粉末 8已1：[(^;1^(?32；[116 13(2);以甲醇：水：二乙胺（75:25:0.05%)等度洗脱，收集10.6 111；[11组 分，得到白色无定形粉末（meso)-chimonanthine (4) 4.6 mg;以甲醇：水：二乙胺（55:45: 0.05%)等度洗脱，收集15.5 111；[11组分，4.2 11^得到淡黄色胶状物831;[(^;1；'(?32；[116 4(1)。
[0017] 实施例4: 将2. 0 g总生物碱浸膏上样至大孔树脂HP-20,分别以水、50%乙醇、90%乙醇洗脱，将 50%乙醇洗脱部分上S印hadex LH-20,采用二氯甲烷：甲醇2:1洗脱，通过TLC检测合并得 到4.3 11^的（111680)-(311；[1]10仙111：11；[116(4)和3.8 11^的8&1；[(^；1^0叉&2；[116八（1)，其余组分 合并后采用制备HPLC进行纯化，以甲醇：水：二乙胺（68 :32 :0. 05%)等度洗脱，收集17. 2 min组分得13. 2 mg白色无定形粉末（-)-chimonanthine (3)，收集13. 0 min组分得8. 7 mg的白色无定形粉末salicifoxazine B (2)0
[0018] 实施例5:总生物碱提取物及单体化合物对消化道肿瘤细胞增殖的抑制作用 本实施例中，为了探究总生物碱提取物及单体化合物对消化道肿瘤细胞的抑制效果， 选择了 3种恶性消化道肿瘤细胞系（胃癌SGC-7901、结肠癌SW1116、结肠癌HCT116 )，并对其 进行体外活性测试，具体的方法与结果如下： 1)材料及方法 细胞株：胃癌SGC-7901、结肠癌SW-1116购买于中科院上海细胞生物学研究所，结肠癌 HCT-116由华东师范大学赵正教授提供。HCT-116细胞接种于含10%热灭活新生牛血清、 10万U/L青霉素和10万U/L链霉素的RPMI-1640培养基中，37 °C、5% C02条件下培养，用 0. 25%的胰酶消化传代； 主要试剂：四甲基偶氮唑蓝（MTT)(美国sigma公司）;二甲基亚砜（DMS0)(美国sigma 公司）；胰蛋白酶(美国resco公司）；1640培养基（赛默飞生物化学制品有限公司）；5_氟尿 啼啶(美国sigma公司）；胚牛血清（FBS,美国sigma公司）； MTT检测抑制活性：取对数生长期的各肿瘤细胞（胃癌SGC-7901、结肠癌SW1116、 HCT116)以5000个/孔分别接种于96孔板，接种24h后，分别加入含不同浓度的柳叶蜡梅 总生物碱和单体化合物样品，对照组加新鲜培养液，每个浓度及对照组（5-氟尿嘧啶）均设 6个复孔，在37° e培养箱中培养，于48h后加入5mg/mLMTT溶液10 yL于37° C培养箱 中继续培养4h后，弃去上清，加入150 yL DMSO振荡十分钟后用酶联免疫检测仪器测定各 孔在570 nm处的吸光度，按下式计算细胞生长抑制率，抑制率（％)= (1-A$M /A,- ) X 100% ; 根据各组样品对不同肿瘤细胞的生长抑制率，用LOGIT法计算得出个样品对各肿瘤细胞的 半数抑制浓度（IC 5。)，测试数据如下：
结果显示： 柳叶蜡梅总生物碱提取物及单体化合物对不同消化道肿瘤细胞的抑制活性不同， 其中，化合物1对结肠癌SW1116细胞的生长具有明显的抑制作用，化合物2和4对胃癌 SGC-7901细胞的生长具有明显的抑制活性，化合物3对结肠癌HCT116细胞的生长具有明显 的抑制活性。
【主权项】
1. 柳叶蜡梅总生物碱提取物及其单体化合物，其特征在于，通过下述方法制备：W柳 叶蜡梅枝叶为原料，采用溶剂提取法制成浓缩提取物；其中，W水、甲醇、乙醇或丙酬单一 溶剂或多种溶剂的混和溶剂为提取溶剂，在室溫下浸溃提取或加热条件下回流提取2~3 次，提取液浓缩后悬浮于适量3%酒石酸水溶液中，W等体积的乙酸乙醋萃取2~3次；酒石 酸水溶液W NazCOs调节抑值至10,然后用氯仿进行萃取得氯仿提取物，获得总生物碱；再 经柱色谱分离、纯化，从所述氯仿提取物中依次得下式单体化合物salici化xazines A (1) 和 B (2)，（ 一 )-chimonanthine (3)和（meso)-chimonanthine (4)，2. 按权利要求1所述的柳叶蜡梅总生物碱提取物及其单体化合物，其特征在于，所述 制备方法中：W 50~95%乙醇为提取溶剂。3. 权利要求1所述的柳叶蜡梅总生物碱提取物及其单体化合物在制备治疗消化道肿 瘤药物或保健品中的应用。4. 按权利要求3所述的用途，其特征在于所述的消化道肿瘤是胃癌或结肠癌。5. -种治疗消化道肿瘤的药物组合物，其特征在于：包括权利要求1所述的柳叶蜡梅 总生物碱提取物或其单体化合物和药学中常用的赋形剂。6. -种辅助治疗消化道肿瘤的保健品，其特征在于：包括权利要求1所述的柳叶蜡梅 总生物碱提取物或其单体化合物和保健品中常用的赋形剂。7. 根据权利要求5所述的治疗消化道肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组 合物制成经口服给药的制剂和非口服给药的注射剂。8. 根据权利要求6所述的辅助治疗消化道肿瘤的保健品，其特征在于，所述的保健品 制成经口服给药的制剂和非口服给药的注射剂。
【文档编号】A61K31/5365GK105985358SQ201510081635
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月15日
【发明人】胡金锋, 麻光磊, 杨国勋, 熊娟
【申请人】复旦大学