一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其应用。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成；或者含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加而形成的，具有抗凝血活性，能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)，而对凝血酶原时间(PT)基本无影响。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有抗血栓作用，而且出血风险小，可作为制备治疗和预防血栓性疾病的药物应用。
【专利说明】
一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域。具体地说，本发明涉及一种具有抗凝作用的Kunitz型 丝氨酸蛋白酶抑制剂及其在制备治疗和预防血栓性疾病中的应用。 技术背景
[0002] 血栓栓塞性疾病是危害人类健康的常见病，也是当前社会致死致残的主要原因之 一。传统的抗栓药物如肝素、低分子量肝素、华法林、血小板聚集抑制剂（如阿司匹林）、水 蛭素等在临床应用中均具有较好的抗栓药效，但他们却还存在一定的不足，其中，最常见、 最严重的并发症（副作用）是引起出血，因此，发明出血副作用小的抗栓新药具有非常重要 的价值。
[0003] 近年来的研究表明：凝血过程中的凝血因子^ (coagulation factor XI，FXI) 及血衆激肽释放酶（plasma kallikrein，PK)是出血风险小的抗栓防治新革巴点[Bane CE Jr，Gailani D. Factor XI as a target for antithrombotic therapy. Drug Discov Today. 2014,19(9) :1454-8 ;Renne T，Gruber A. Plasma kallikrein ：novel functions for an old protease. Thromb Haemost. 2012,107(6) :1012-3]，FXIa或FXI、血楽激肽释放 酶（PK)抑制剂可能开发为出血副作用小的抗栓药物。
[0004] Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类含有Kunitz结构域的多肽或蛋白类抑制 剂，是目前研究最多的丝氨酸蛋白酶抑制剂之一[罗玉娇，李滨，舒衡平，蒋立平.Kunitz型 胰蛋白酶抑制剂的研究进展.中国生化药物杂志.2012,33(3) :316-9]。Kunitz型丝氨酸 蛋白酶抑制剂具有复杂多样的功能，如具有抗炎、抗菌或抗虫等作用，目前已有牛胰蛋白酶 抑制剂（BPTI)、尿胰蛋白酶抑制剂（UTI)等Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂作为药物进入临 床应用。
[0005] 生物体内分布有大量的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，目前在Genbank中登 记的含有Kunitz型结构域的蛋白/多肽已超过1万多条。我们从美洲钩虫（Necator americanus)中获得了 一种含有Kunitz型结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂-Necatorin， Necatorin及其经氨基酸残基替换、缺失或添加而形成的突变体具有较强的抗凝作用， 能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间（APTT)，而对凝血酶原时间（PT)基本无影响。 Necatorin及其突变体对FXIa、或PK有很强的抑制作用。动物实验表明：Necatorin及其 突变体能抑制血栓形成，而且出血副作用小。因此，Necatorin及其突变体是一种具有出 血副作用小的抗凝多肽，可应用于制备预防和治疗血栓性疾病药物。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及其 应用。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较强的抗凝活性，能明显延长血浆活化部分凝 血活酶时间（APTT)，而对凝血酶原时间（PT)基本无影响。该Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制 剂可应用于制备药物以治疗和预防血栓性疾病，并且具有出血副作用小的优点。
[0007] 本发明提供了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂。该Kunitz型 丝氨酸蛋白酶抑制剂含有由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列组成的多肽，或者含有由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列组成的多肽经过一个或多个氨基酸残基的替代、缺失或添加而形成 的，且能明显延长APTT，而对PT基本无影响。
[0008] 本发明提供了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂。该抑制剂含 有由SEQIDNα2、或SEQIDNα3、或SEQIDNα4、或SEQIDNα5、或SEQIDNα6、或 SEQ ID N0. 7、或 SEQ ID N0. 8、或 SEQ ID N0. 9、或 SEQ ID N0. 10、或 SEQ ID N0. 11 所示氨 基酸序列组成的多肽，这些多肽能明显延长ΑΡΤΤ，而对ΡΤ基本无影响。
[0009] 本发明提供了一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其对FXIa或 PK有很强的抑制作用。其中，由SEQ ID N0. 1、或SEQ ID N0. 2、或SEQ ID N0. 3所示氨基酸 序列组成的多肽对激活的凝血因子十一（FXIa)及血浆激肽释放酶（PK)两者均有较强的抑 制作用，由 SEQ IDN0.4、或 SEQ ID Ν0.5、或 SEQ IDN0.6、或 SEQ ID Ν0.7、或 SEQ ID Ν0.8、 或SEQ ID NO. 9、或SEQ ID NO. 10、或SEQ ID NO. 11所示氨基酸序列组成的多肽较SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列组成的多肽对FXIa抑制作用有增强或无明显变化，但抑制PK的能力 明显减弱，即抑制FXIa的特异性明显增强了。
[0010] 本发明的一个应用在于应用提供的一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶 抑制剂制备治疗和预防血栓性疾病药物。包含本发明的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂具 有明显的抑制血栓形成作用，而且对出血时间无明显影响，可用于作为或发展成为出血副 作用小的抗血栓约物。
[0011] 本发明的其它方面由于本文技术内容的公开，对本领域专业技术人员是易于理解 并实施的。例如，包含本发明所述的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂与其它抗栓药物联合用 药可减少出血副作用，包含本发明所述的多肽药物组合物在临床中的应用，包含本发明的 多肽药物与白蛋白等偶联或融合以提高药物半衰期，包含本发明的抗凝多肽在作为抗凝制 剂中的应用。
[0012] 本发明提供的一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的优点是：该 种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂不但能够制备作为有效治疗和预防血栓性疾病药物应 用，而且出血副作用小，对于解决目前临床抗栓药物治疗出现的出血副作用具有重大价值。
【附图说明】
[0013] 以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中， 图1显示的是Necatorin对APTT及PT的影响，X轴数值为Necatorin浓度（nM)，Y轴数值 为凝血时间（秒，sec)，Necatorin延长APT T的活性与其浓度呈依赖关系；图2显示的是 Necatorin的核苷酸序列及其编码氨基酸序列，上方序列为核苷酸序列，下方为氨基酸残基 (简写）序列，示终止，下划线部分序列为预测的信号肽序列。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。凡是依照本发明公开内容所做出的等同替换，均属于本发明的保 护范围。
[0015] 实施例1 :Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的获得与制备
[0016] 在Genbank中登记的美洲钩虫基因组测序数据中，一种预测为具有Kunitz型结构 域的多肽/蛋白（GenBank:ETN84717. 1)由62个氨基酸残基组成，但其仅含有4个半胱氨酸 残基（cys)，提示该Kunitz型结构域还不不完整。多种已知的美洲钩虫Kunitz型丝氨酸蛋 白酶抑制剂信号肽具有较保守序列"MK/RFLLFLL"，因此我们利用已知的美洲钩虫Kunitz 型丝氨酸蛋白酶抑制剂（GenBank :ΕΤΝ75126· 1及GenBank :ΕΤΝ82803· 1)的cDNA序列设计 上游引物5'4了64441'1'1'(^6〇^1'1'1'(：1'1'-3'，根据前述661^31^疋了胳4717.1序列的相应〇0嫩 序列（GenBank :KI657882. 1)设计下游引物 5'-CTACAGTTTATGTTTGCGGTTTA-3'，以美洲钩虫 成虫cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，获得了具有完整成熟肽的编码基因，编码基因及其编 码序列见图2。编码成熟肽序列见SEQ ID NO. 1所示序列，由69个氨基酸残基组成，具有典 型Kunitz型结构域所具备的6个半胱氨酸残基（cys)。
[0017] 用BlastP程序进行检索，在GenBank中与SEQ ID NO. 1所示序列氨基酸序列 一致性大于或等于66%的序列有2条，其中具有最大序列相似性的序列为前述GenBank : ETN84717. 1所述序列，两者的羧基端的50个氨基酸残基序列一致，但氨基端序列有明显差 异，且前者成熟肽由69个氨基酸残基组成，含有6个半胱氨酸残基（cys);后者登记的完 整序列由62个氨基酸残基组成，仅含有4个半胱氨酸残基（cys);与SEQ ID NO. 1所示序 列具有其次序列相似性的序列为GenBank :ETN84721. 1所述序列，两者氨基酸序列一致性 (Identities)为68% (38/56)。因此，我们命名我们获得的多肽为Necatorin。目前尚无 任何有关SEQ ID NO. 1序列的生物活性（功能）研究。
[0018] 用PCR法对SEQ ID NO. 1编码序列进行突变，结果获得了突变体AP-1(SEQ ID N0. 2 所示氨基酸序列）、AP-2 (SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列）、AP-3 (SEQ ID NO. 4所示氨基酸序 列）、AP-4 (SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列）、AP-5 (SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列）、AP-6 (SEQ ID NO. 7所示氨基酸序列）、AP-8 (SEQ ID NO. 9所示氨基酸序列）、AP-9 (SEQ ID NO. 10所 示氨基酸序列）及AP-10 (SEQ ID NO. 11所示氨基酸序列）编码序列。
[0019] Necatorin及其突变体编码基因经克隆、酶切连接入表达质粒pET32a，成功构建 的表达质粒pET32a/Necatorin (或其突变体编码序列）转入到大肠杆菌BL21(DE3)中，经 IPTG诱导表达、离心分离细菌、超声破碎、Ni-NTA亲和层析获得了纯化的含Necatorin或其 突变体的融合蛋白，再用牛肠激酶切割融合蛋白，经Ni-NTA亲和层析分离融合伴侣Trx和 目的多肽，获得重组目的多肽。
[0020] 实施例2 :本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的抗凝活性
[0021] 本实施例中，用活化部分凝血活酶时间（APTT)及凝血酶原时间（PT)法检测本发 明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的抗凝活性。本实施例所述的Kunitz型丝氨酸蛋 白酶抑制剂（抗凝多肽）是通过在大肠杆菌中重组表达、分离纯化获得（见实施例1)。
[0022] 活化部分凝血活酶时间（APTT)测定（白陶土）：于塑料试管中取10 μ 1 -定浓度 的抗凝多肽（空白对照用浓度为〇· 9 %的生理盐水）与0· lml正常人血浆（枸橼酸钠抗凝） 混匀后，加入APTT (上海太阳生物技术有限公司产品）试剂0. lml，37°C水浴5min，其间轻 轻振摇，再加入25mmol/L CaC12溶液0. lml混勾，置于37°C水浴，摇勾计时，观察凝固时间， 即为APTT值。每个浓度均重复3次，取平均值。通过计算该重组多肽延长凝血时间的倍数 值分析其延长APTT的能力，计算公式为：延长APTT倍数=(测定的各浓度APTT值-空白 对照组APTT值）/空白对照组APTT值。
[0023] 凝血酶原时间（PT)测定：于塑料试管中取10 μ 1 -定浓度的抗凝多肽（空白对照 用生理盐水）与0.1ml正常人血浆（枸橼酸钠抗凝）混匀后，37°C温浴5min后，加入预温 PT试剂（上海太阳生物技术有限公司产品）0. 2ml，混匀，开始计时，血液凝固时间即为PT 值。
[0024] 结果表明：Necatorin及其突变体均能明显延长APTT (表1)，但均基本不影响PT。 在50nM及ΙΟΟηΜ浓度（终浓度）下，重组Necatorin(SEQ ID NO. 1所示序列）分别能延长 0.43倍及1.01倍APTT。保留有3对完整Cys结构的截断突变体AP-1(SEQ ID N0. 2所示 序列）及AP-2 (SEQ ID Ν0· 3所示序列）具有与Necatorin相似的延长APTT活性；突变体 AP-3~AP-10 (SEQ ID N0. 4~SEQ ID N0. 11所示序列）延长APTT活性均有显著增强（P < 0· 05)，如ΙΟΟηΜ的AP-3及AP-4分别能延长1. 66及1. 42倍APTT。但即使在lOOOnmol 的浓度下，Necatorin及其突变体均不明显延长PT。
[0025] 不同浓度的Necatorin对APTT、PT的影响可见图1。Necatorin延长APTT的能力 与其浓度呈依赖关系，但其基本不能延长PT。
[0026] 表1本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对APTT的影响
[0027]
[0028] 实施例3 :本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对凝血因子的抑制作用
[0029] 本实施例所述的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂（重组抗凝多肽）是通过在大肠 杆菌中重组表达、分离纯化获得（见实施例1)。用发色底物法检测各重组多肽对凝血因子 的作用。
[0030] 在酶标板每孔200 μ 1反应体系中进行。100 μ L人凝血因子Xla(FXIa)、或人 FXIIa(终浓发为lnM，Haematologic lechnologies Inc产品）、或人血衆激肽释放酶 (plasma kallikrein，PK)(终浓度为InM，Merck产品）分别与20 μ L不同浓度重组多肽 (对照组用PBS)混匀。在25°C孵育15分钟后，加入80yL发色底物（FXIa及FXIIa发 色底物用S2366,终浓度均为0. 4mM ;PK发色底物用S2302,终浓度为0. 8mM。发色底物均 为Chromogenix产品），3分钟后测0D4()5值，根据0D 4。5值变化计算抑制情况，重复测3孔。 抑制率计算公式为：抑制率=(对照组〇D 4(]5值-加入重组多肽的0D 4。5值）/对照组0D 4。5 值 X100%〇
[0031] 结果表明：Necatorin及其突变体对PK、或FXIa有较强的抑制作用（表2和表3)。 Necatorin、AP-1 (SEQ ID N0. 2 所示序列）及 AP-2 (SEQ ID N0. 3 所示序列）对 PK 及 FXIa 两者均有很强的抑制作用，如1〇ηΜ浓度的Necatorin可抑制83 %的PK活性及63 %的FXIa 活性。突变体AP-3~AP-10 (SEQ ID NO. 4~SEQ ID NO. 11所示序列）抑制FXIa的活性 较野生型序列（SEQ ID NO. 1所示序列）有所增强或无明显变化，但他们抑制PK活性均有 不同程度减弱，如ΙΟΟηΜ的Necatorin能抑制约97%的ΡΚ活性，但ΙΟΟηΜ的AP-3 (SEQ ID NO. 4所示序列）仅能抑制约40%的PK活性。部分突变体抑制PK活性降低了，意味着其抑 制FXIa的特异性增强了。
[0032] 表2本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对PK的抑制作用
[0033]
[0034] 表3本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对FXIa的抑制作用
[0035]
[0036] 实施例4 :本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠尾出血时间（BT) 的影响
[0037] 取昆明小鼠，体重18~22g，雌雄各半，随机分组（每组8只）。小鼠腹腔注射2 %戊 巴比妥钠0. 2ml/100g麻醉，麻醉后于尾静脉注射给药，分别给予各重组多肽高（5mg *kg ^、 低（50 μ g · kg 4 2个剂量组、肝素钠（1650U/kg，天津生物化学制药有限公司）组和生理 盐水组。给药l〇min后，于鼠尾术端1mm处用外科手术刀横向切断鼠尾，立即将鼠尾放于试 管内37°C恒温的生理盐水中，开始计时，观察出血情况并记录出血时间（BT)。出血时间最 长观察10分钟，超过10分钟仍出血的按10分钟计算。
[0038] 结果表明：本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对出血时间（BT)无明显 影响（表4)，表明本发明所提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠的正常止血功能无 明显影响，作为药物应用时，出血副作用小。
[0039] 表4本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠出血时间的影响（η = 8)
[0040]
[0041] 实施例5 :本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠动-静脉旁路血栓 形成的影响
[0042] 取雄性SD大鼠，体重300~350g，随机分组，每组8只，包括生理盐水对照组，阳 性对照组（100U · kg 1肝素钠，天津生物化学制药有限公司），重组多肽（Necatorin、AP-3、 AP-4 及 AP-5)低（50 μ g · kg 3、中（200 μ g · kg 4 和高剂量组（800 μ g · kg 4。大鼠腹腔 注射2%戊巴比妥钠1.5ml/kg体重，仰位固定，分离气管插管。手术分离出右颈总动脉及左 颈外静脉，在一内径1. 5mm、长22cm、充满50U · mL的肝素生理盐水的娃化聚乙稀管内，内 置一根长5cm的4号手术缝合线，将聚乙烯管的一端插入右颈总动脉，另一端插入左颈外静 脉。尾静脉给药，给药后5min，打开动脉夹，血液由右颈总动脉流经聚乙烯管返回左颈外静 脉。开放血流20min后中断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重量为血栓湿重。血 栓形成抑制率=(生理盐水对照组血栓湿重-给药组血栓湿重）/生理盐水对照组血栓湿 重 X100%〇
[0043] 结果见表5,与生理盐水对照组比较，本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶 抑制剂能显著抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成（p < 0. 01)，如Necatorin低剂量组 (50 μ g · kg 3血栓湿重为（10. 5 ± 2. 1) mg，血栓形成抑制率为78. 7 %。
[0044] 表5本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠动-静脉旁路血栓形成 的影响（η = 8)
[0045]
[0046] 与生理盐水对照组比较，Y < 0. 01
[0047] 实施例6 :本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠颈总动脉血栓形成 的影响
[0048] 取雄性SD大鼠（体重300-350g)随机分组（8只/组），包括假手术组，模型组， 肝素钠组（1650U · kg ^，重组多肽（Necatorin、AP-3、AP-4 及 AP-5)低（50 μ g · kg ^、中 (200 μ g · kg 4及高剂量组（800 μ g · kg 4。大鼠用以2%戊巴比妥钠溶液1. 5ml/kg剂量 腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台，于颈部正中切口，小心剥离左侧颈总动脉1. 5cm，穿过 2根2号缝合线将其游离，用塑料纸将血管与周围组织隔开，以保护血管周围正常组织。尾 静脉给药后，将准备好浸润有40 μ 1 10% FeCl3溶液的滤纸片（0. 8cmX2. 0cm)将血管包 裹lOmin，从而诱导动脉血栓形成。20min后，结扎滤纸条两端血管，精确剪下滤纸条包裹的 血管段，用滤纸吸干血管内余血，称重。血栓湿重=(含血栓的血管重量-取出血栓后的血 管重量）。假手术组用生理盐水代替FeC13浸泡的滤纸条。
[0049] 结果见表6,与模型组比较，本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂能显著 抑制大鼠颈总动脉血栓形成，如Necatorin低剂量组（50 μ g · kg 3血栓湿重为（4. 140. 8) mg，较模型组血栓湿重（7. 5 ±0. 7) mg显著降低。
[0050] 表6本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠颈总动脉血栓形成的影 响（η = 8)
[0051]
[0052] 与生理盐水对照组比较，*p <0· 01
[0053] 实施例7 :本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠静脉血栓形成的影 响
[0054] 取雄性SD大鼠（体重300-350g)随机分组（8只/组），包括生理盐水对照组，重 组多肽（Necatorin、AP-3、AP-4 及 AP-5)低（50 μ g · kg ^、中（200 μ g · kg》及高剂量组 (800 μ g · kg 4。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液1. 5ml/kg剂量麻醉，剖腹分离下腔静 脉，于左肾静脉下方置一丝线备结扎血管用，自尾静脉注射不同浓度受试药物，5min后结扎 下腔静脉造成淤血，然后关闭腹腔，4h后再次打开腹腔，于结扎下方2. Oem处夹闭血管，纵 行剖开检查有无血栓形成，以正常对照组为基准计算各组血栓形成比率，即血栓形成比率 为给有血栓形成的大鼠数/每组实验大鼠数。抑制率=[(每组实验大鼠只数-每组有血 栓形成的大鼠只数）/每组实验大鼠只数_(生理盐水组实验大鼠只数-生理盐水组有血栓 形成的大鼠只数）/生理盐水组实验大鼠只数）]。
[0055] 结果表明（表7)本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂能显著抑制大鼠的 静脉血栓形成，如在Necatorin低剂量组（50 μ g · kg》，10只实验大鼠中有2只大鼠有静 脉血栓形成，相对于生理盐水组的100%大鼠能形成血栓，血栓形成抑制率为80%。
[0056] 表7本发明提供的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠下腔静脉血栓形成的影 响（η = 10)
[0057] 与生理盐水对照组比较，Y < 0. 01
[0058] 以上所述仅为本发明示意性的【具体实施方式】，并非用以限定本发明的范围。任何 本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的等同变化、修改与结合， 均应属于本发明保护的范围。 工业实用件
[0059] 本发明提供的具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂是凝血因子 Xla(FXIa)，或血浆激肽释放酶（PK)的抑制剂，该类抑制剂不但能够制备作为有效预防和 治疗血栓性疾病药物应用，而且出血副作用小，对于解决目前临床抗凝抗栓治疗出现的出 血并发症具有重大意义。
【主权项】
1. 一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于含有： (a) 由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列组成的多肽；或者 (b) 由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或添加而 形成的、且能明显延长血浆活化部分凝血活酶时间，但不延长凝血酶原时间。2. 如权利要求1所述的一种具有抗凝作用的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在 于，所述的替换、缺失或添加而形成的多肽含有：由SEQ ID NO. 2、或SEQ ID NO. 3、或SEQ ID NO. 4、或 SEQ ID NO. 5、或 SEQ ID NO. 6、或 SEQ ID NO. 7、或 SEQ ID NO. 8、或 SEQ ID NO. 9、 或SEQ ID NO. 10、或SEQ ID NO. 11所示氨基酸序列组成的多肽。3. 如权利要求1或2所述的一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的应用，其特征在于在 制备治疗和预防血栓性疾病药物中的应用。4. 如权利要求3所述的一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的应用，其特征在于，将所 述的一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂或其衍生物或组合物作为活性成份直接或与药学 上可接受的载体制成制剂。
【文档编号】A61K38/57GK105985432SQ201510097858
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月5日
【发明人】莫永炎
【申请人】莫永炎