灯盏花黄烷酮-3-羟化酶及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明属于生物技术和植物学技术领域，具体涉及到一种新的灯盏乙素生物合成途径代谢酶及其编码基因与应用。本发明提取成熟灯盏花的总RNA，通过cDNA末端快速克隆的技术(RACE)和逆转录PCR(RT-PCR)克隆得到基因序列，再测得其序列的碱基组成并完成必要的生物信息学分析。本发明首次克隆得到灯盏花中黄烷酮-3-羟化酶(EbF3H)，为灯盏花遗传背景和灯盏乙素生物合成途径的认识奠定了基础。
【专利说明】
灯盏花黄烷酮-3-羟化酶及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和植物学技术领域，特别涉及到一种新的灯盏乙素生物合成 途径代谢酶及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 灯蓋花是菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus (Vant. )Hand_Mazz的干燥全 草，又名灯盏细辛，主要分布于我国西南地区，尤以云南较多。短葶飞蓬中提取的黄酮类化 合物灯盏乙素（5, 6, 4-三羟基黄酮-7-葡萄糖醛酸苷）普遍认为是其主要活性物质。具有 抗缺血损伤、抗血小板聚集、改善器官血流动力学和微循环等多方面作用，对缺血性心脑血 管疾病有显著疗效。
[0003] 在植物体内类黄酮的生物合成途径普遍存在，并产生极其丰富的次生代谢产物， 统称类黄酮化合物，野黄芩苷（灯盏乙素）也是其中的一员。目前充分研究的黄酮途径是通 过上游苯丙素途径，苯丙氨酸在L-苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyase，PAL)， 肉桂酸 4_ 轻化酶（Cinnamate4-hydroxylase，C4H)和 4_ 香豆酰 CoA 连接酶（4-coumarate coenzyme A ligase，4CL)催化苯丙氨酸生成对香豆酰辅酶A，再通过下游黄酮途径，通过 查尔酮合成酶（Chalcone Synthase，CHS),查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI)，黄 烧酮3-轻化酶$1&￥&110116 3-117(11'(?71&86，？3!{)，黄酮合成酶1(?1&￥0116 37111：11&86 1， FNS I)，黄酮合成酶II(Flavone synthase II，FNSII)的催化作用生成黄酮化合物。而 灯蓋花中，则是黄烧酮6_轻化酶（Flavanone 6-hydroxylase，EbF6H)代替EbF3H，再通 过UDP-葡萄糖醛转移酶（EbF7GAT)催化生成灯盏乙素。因此EbF3H是灯盏乙素生物合 成的一个重要旁路基因，深入研究EbF3H对认识灯盏乙素生物合成具有重要意义，然而目 前却没有灯盏花中EbF3H的研究。已有文献报道诸多植物中的F3H，例如转F3H的烟草的 黄酮代谢被上调，并提高了其抗盐能力（Plant Mol Biol，85(6):551-573)。在小麦，草 莓，拟南芥和水稻等植物中也都有广泛的研究（Mol Biol, 2013, 47 (6) :1028-1030 ;Plant Physiol Biochem, 2014, 82:289-298 ；Plant Physiol Biochem, 2008, 46(10) :833-843 ； Planta, 228(6):1043-1054〇 )
[0004] 灯盏花被广泛用于医疗时，这一野生资源就被大量采摘，可观的经济利益导致灯 盏花资源过度开发，环境遭到严重破坏，野生资源日益减少，逐渐造成如今灯盏花资源紧缺 的现状。但是由于对灯盏花相关遗传研究滞后及其遗传背景狭窄等问题，杂交育种的难度 极大，因此到目前为止均为野生株系的栽培，后代稳定性差，给灯盏花规模化栽培以及GMP 管理带来了巨大的挑战。
[0005] 对于灯盏乙素生物合成途径，只有上游基因得到克隆（PLoS One，2014, 9 (6) : e100 357)，下游基因和旁路基因几乎没有任何进展，这为进一步从分子水 平调控达到提高灯盏乙素含量的目的造成了极大的困扰。因此克隆、分析和调控代谢途径 中的未知基因是十分重要的。
[0006] 目前尚无文献报道灯盏花中EbF3H的克隆方法、序列分析和相关应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种新的灯盏乙素生物合成途径旁路的重要代谢酶及其 编码基因，该代谢酶具体是从灯盏花中提取到的黄烷酮-3-羟化酶（EbF3H)。本发明的另一 目的在于提供该灯盏花黄烷酮-3-羟化酶及其编码基因的应用。
[0008] 本发明的主要技术方案是：将种子播种于土壤，取生长90天的灯盏花植株作为处 理对象，提取总RNA反转录cDNA，通过RACE和RT-PCR克隆得到EbF3H，测序得到核酸序列， 并进行生物信息学分析。
[0009] 具体步骤如下：
[0010] A.种子的萌发：将灯盏花种子播种于土壤，覆盖透明塑料薄膜保持水分，在光照 12小时/天，光照强度2500-3500Lux，优选3000Lux条件下培养，温度为25°C，待发芽后去 除塑料薄膜，30天后得到颜色有光泽呈鲜绿色，生长旺盛的幼苗；
[0011] B.移栽幼苗：每株幼苗移栽至独立的土壤环境，于同样条件下（光照12小时/天， 光照强度3000LUX，温度25°C )培养60天（无塑料薄膜），选取长势良好的灯盏花植株作为 对象；
[0012] C.取一株生长90天成熟的灯盏花植株，提取总RNA (TotalRNA)，反转录得到cDNA， 存于-20°C备用；
[0013] D.设计引物，通过RACE和RT-PCR的方法得到EbF3H的核酸序列；
[0014] F.进行必要全面的生物信息学分析。
[0015] 其中步骤C和D中，涉及的实验反应均按照产业化试剂盒中提供的步骤进行。
[0016] 其中步骤F中，涉及的软件和网站使用方法均按照说明操作。
[0017] 其中播种前需进行种子的处理，处理步骤具体为：将干燥灯盏花种子30mg浸泡于 纯水中30min，去除漂浮表面的杂质。
[0018] 术语解释，本文中" Lux "是指光照强度。
[0019] 本文中"独立的土壤环境"是指将植株幼苗分开种植，但是其他条件包括土壤，光 照，温度都保持不变。
[0020] 本发明的第一方面，是提供了一种新的灯盏乙素生物合成途径代谢酶及其编码基 因。
[0021] 本发明提供了一种灯盏花黄烷酮-3-羟化酶EbF3H，所述的EbF3H的氨基酸序列如 SEQ ID N0:1 所示（362aa)。
[0022] 本发明提供了一种灯盏花黄烷酮-3-羟化酶EbF3H的编码基因，所述的EbF3H的 编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示（1327bp,其中0RF1086bp为SEQ ID N0:11)。
[0023] 本发明的第二方面，是提供了上述的灯盏花黄烷酮-3-羟化酶及其编码基因的应 用。
[0024] 所述的应用，是指利用该灯盏花黄烷酮-3-羟化酶及其编码基因生物合成灯盏乙 素。
[0025] 所述的应用，进一步是指利用该灯盏花黄烷酮-3-羟化酶及其编码基因提高灯盏 花的品质。
[0026] 所述的提高灯盏花的品质，具体是指提高灯盏花中灯盏乙素的含量。
[0027] 本发明的有益效果如下：
[0028] 本发明完成了灯盏花EbF3H的克隆和生物信息分析，完善了灯盏乙素生物合成的 认识，为进一步进行分子水平的调控尝试代谢工程，提高灯盏乙素含量奠定了基础。
[0029] 本发明克隆得到一条新的参与灯盏乙素合成的功能基因，对灯盏花的遗传背景认 识具有积极影响。
【附图说明】
[0030] 图1 :EbF3H的生物信息学分析，A) EbF3H的结构域分析；B) EbF3H蛋白的二级结构 分析；C)EbF3H蛋白的三级结构分析；D)EbF3H的也细胞定位分析。
【具体实施方式】
[0031] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0032] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商 所建议的条件。
[0033] 实施例1 :
[0034] 一、样品的采集
[0035] 1.种子的处理：将干燥灯盏花种子30mg浸泡于纯水中30min，去除漂浮表面的杂 质，将筛选后的种子均匀铺于提前润湿的土壤中，再于表面覆盖一层土壤。
[0036] 2.发芽：在土壤上覆盖一层透明的塑料薄膜，以保存水分。置于光照强度为 3000LUX条件下培养，光照12小时/天，温度为25°C，待发芽后去除塑料薄膜，30天后得到 颜色有光泽呈鲜绿色，生长旺盛的幼苗。
[0037] 3.培养：将每株幼苗移栽至独立的土壤环境，继续同样条件培养60天。
[0038] 4.取样：全草取样，铝箱纸包装，液氮速冻后存于_80°C保存备用。
[0039] 二、EbF：3H 的克隆
[0040] 1.取满足上述第一部分中的灯盏花样品。
[0041] 2. RNA的提取：按照RNA提取试剂盒TRIzol? Reagent，天根公司（TianGen)的说 明方法提取灯盏花的TotalRNA (总RNA)。
[0042] 3. RACE文库的构建：按照RACE文库构建试剂盒（SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，宝生物工程，日本，TAKARA，JAPAN)的说明方法构建3'和5' RACE文 库。
[0043] 4. RACE :通过5'和3' RACE克隆基因的5'和3'端，使用Phusion超保真DNA聚 合酶进行反应（NEW ENGLAND BIOLABS, AMERICA)，使用的引物见表1。
[0044] 表1RACE使用的引物
[0047] 5. RT-PCR :根据RACE结果设计引物，使用Phusion超保真DNA聚合酶进行反应 (NEW ENGLAND BIOLABS, AMERICA)进行 RT-PCR 获得 EbF3H 全长，条件为：98°C，30s，1 个循 环；98°C，10s，57°C，10s，72°C，60s，40个循环；72°C，5min，1个循环。使用的引物见表2，得 到的核酸序列如SEQ ID N0:2所示，委托genewiz生物公司（苏州）测序成功。
[0048] 表2qRT_PCR使用的引物
[0049]
[0050] 实施例2 :表达EbF3H-GFP融合蛋白的载体构建
[0051] 实验方法：通过带有酶切位点Sail和Spel的引物（序列如下）扩增EbF3H，使用 Phusion 超保真 DNA 聚合酶进行反应（NEW ENGLAND BIOLABS, AMERICA)进行 RT-PCR 获得 带有酶切位点的 sEbF3H全长，条件为：98°C，30s，1 个循环；98°C，10s，55°C，10s，72°C，60s， 40个循环；72°C，5min，1个循环。再通过限制性内切酶Sail和Spel (Takara, Japan)酶切 sEbF3H和pA7-GFP载体。最后通过T4连接酶（Takara，Japan)将酶切产物于16°C进行连 接，条件按照说明操作。得到的EbF3H-Pa7-GFP载体为后续亚细胞定位实验备用。
[0052] 表3EbF3H-Pa7_GFP载体构建使用的引物
[0053]
[0054] 实施例3 :实施例2得到的融合蛋白进行生物信息学分析
[0055] 1. EbF；3H 的结构域分析：使用 MAGA 5· 〇5 软件（http://www. megasoftware· net/) 将EbF3H与其他植物中F3H进行同源分析，得到20G-FeII-Oxy，PLN003176和PLN002515 三个结构域，使用的F3H序列信息均来自NCBI网站，序列信息分别是：Gynura bicolor (GbF3H, BAJ17667. 1), Dahlia pinnata(DaF3H, BAJ21534. 1), Chrysanthemum x morifol ium(CmF3H, AAB97310. l),Pilosella officinarum(PoF3H, ACB56921. l)and Carthamus tinctorius (CtF3H, AEG64806. 1)，如图 1A 所示。
[0056] 2. EbF3H 的二级结构分析：使用 S0PMA 软件（https://npsa_prabi. ibcp. fr/ cgi-bin/npsa_automat. pi ? page = /NPSA/npsa_sopma. html)进行 EbF3H 蛋白的二级 结构分析，结果表明蛋白由35. 36 % α-螺旋，21. 82%延展结构，9.67% β-转角and 33. 15 %不规则卷曲，结果如图1B所示。
[0057] 3. EbF3H 的三级结构分析：使用 Phyre2 软件（http://www. sbg. bio. ic. ac. uk/ phyre2/html)进行EbF3H蛋白进行三级结构分析，结果如图1C所示。
[0058] 4. EbF3H的亚细胞定位：以水稻原生质体为媒介，在载体pA-7中表达EbF3H-GFP 融合蛋白，观察GFP荧光蛋白在细胞的表达部位，发现EbF3H-GFP融合蛋白主要表达在细胞 质中，结果如图1D。
[0059] 以上结构域，二级和三级结构分析结果表明其具有F3H的特征，加之亚细胞定位 实验说明其主要在细胞液中表达，这与黄酮代谢主要在细胞液中相吻合，因此克隆得到的 EbF3H的是灯盏花中的黄烷酮3-羟化酶。
[0060] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
【主权项】
1. 一种灯盏花黄烷酮-3-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -种如权利要求1所述的灯盏花黄烷酮-3-羟化酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示。3. -种如权利要求1所述的灯盏花黄烷酮-3-羟化酶在生物合成灯盏乙素中的应用。4. 一种如权利要求1所述的灯盏花黄烷酮-3-羟化酶在提高灯盏花的品质中的应用， 所述的提高灯盏花的品质是指提高灯盏花中灯盏乙素的含量。5. -种如权利要求2所述的灯盏花黄烷酮-3-羟化酶的编码基因在生物合成灯盏乙素 中的应用。6. -种如权利要求2所述的灯盏花黄烷酮-3-羟化酶的编码基因在提高灯盏花的品质 中的应用，所述的提高灯盏花的品质是指提高灯盏花中灯盏乙素的含量。
【文档编号】C12N15/53GK105985936SQ201510053624
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月2日
【发明人】张磊, 陈瑞兵, 黄鑫, 刘江华
【申请人】中国人民解放军第二军医大学