一种rna高通量测序文库构建方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，它确立了一种RNA高通量测序文库构建方法，构建的文库可在高通量测序仪进行测序并得到高质量序列信息，其含有两个技术要点：1.确立了构建文库所需要的引物；2.确立了操作流程和反应条件。该可用于转录组测序、RNA病毒检测、小RNA测序、宏基因组分析等，在科学研究、医学临床诊断和兽医临床诊断上有较大的使用价值。
【专利说明】
一种RNA高通量测序文库构建方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域；具体说来，本发明确立了一种RNA高通量测序文库构建方法，构建的文库可进行高通量测序并得到高质量序列信息，可用于转录组测序、RNA病毒检测、小RNA测序、宏基因组分析等，在科学研究、医学临床诊断和兽医临床诊断上有较大的使用价值。
【背景技术】
[0002]高通量测序，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，因此也称其为深度测序或下一代测序技术。高通量测序技术有三大优点是传统Sanger测序法所不具备的。第一，它利用芯片进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序，把平行处理的思想用到极致，因此也称之为大规模平行测序。第二，高通量测序技术有完美的定量功能，这是因为样品中某种DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度。第三，成本低廉。利用传统Sanger测序法完成的人类基因组计划总计耗资27亿美元，虽然比预计的30亿美元节省了不少，但仍是一个耗资巨大的工程。而现在利用高通量测序技术进行人类基因组测序，耗资不到传统测序法的1%。
[0003]RNA测序研究是基因功能及结构研究的基础，能够从整体水平研究基因功能及其结构。随着高通量测序和定量检测技术的不断发展，能够通过RNA测序对转录组进行更深度更完整的研究。该研究进展包括改善转录起始位点的预测、链特异性测序、融合基因的检测、microRNA定量的分析以及RNA可变剪切的识别。目前利用单分子测序技术可以实现RNA的直接测序，通过二代测序技术与单分子测序技术相结合的方式，能更深层次、更全面地获得转录组信息。
【发明内容】
[0004]本发明以微量的RNA为初始样品，可构建用于高通量测序的测序文库。该方法包括以下内容:
该方法以RNA为初始样品，采用随机引物adaptor 1-nnnnnn进行反转录，并用随机引物adaptor2-nnnnnn合成DNA第二链，两次采用随机引物，减少了文库序列的偏好性；进而以引物Pl和P2进行聚合酶链式反应扩增，加入测序仪能够识别的序列；产物经电泳回收目的大小的DNA，用于高通量测序(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，η代表碱基a、碱基t、碱基c和碱基g的混合物)。具体操作流程包括:
1.RNA反转录合成第一链。使用引物adaptorl-nnnnnn，采用反转录酶进行RNA反转录。PCR仪中设置如下反应程序，进行反转录反应:25 0C 15分钟，42 V 30分钟，70 V15分钟。
[0005]2.RAN/cDNA消化。在上述反转录反应液中，加入RNase H消化掉RNA。
[0006]3.cDNA纯化。采用磁珠纯化第一链cDNA。
[0007]4.第二链合成。使用引物 adaptor2_nnnnnn，Klenow Fragment exo_3，—5，I μ L，37 °C温育30分钟，合成双链DNA。
[0008]5.DNA纯化。采用磁珠纯化DNA。
[0009]6.PCR扩增。在PCR管中依次加入:Phus1n HF mix 25yL，引物 Pl 和 P2 (1pM)各 I yL，纯化的 DNA 10 μ L，DMSO 1.5 yL, H20 11.5yL。进行 PCR
7.Lib纯化。用2%的E-gel系统回收DNA片段，用于测序。
【具体实施方式】
[0010]下面通过实施例，说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于这个实施例。
[0011]本实施例用此发明的文库构建方法，对鸡胚培养的含有禽副粘病毒4型的尿囊液样品进行处理，提取基因组RNA进行文库构建。采用随机引物gtgtctccgactcagnnnnnn进行反转录，并用随机引物tgggcagtcggtgatnnnnnn合成DNA第二链；以引物ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag 和 ccgctttcctctctatgggcagtcggtgat 进行聚合酉每链式反应扩增，加入PGM测序仪能够识别的序列；产物经电泳回收目的大小的DNA，用于PGM测序仪进行高通量测序(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相应的碱基，η代表碱基a、碱基t、碱基c和碱基g的混合物)。包括如下步骤:
第一步(合成引物):按照本发明指定的核酸序列(即序列表中SEQ ID N0.1，SEQ IDN0.2，SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4)，人工合成逆转录-聚合酶链式反应所需要的引物；第二步(文库构建):按照本发明指定的操作流程和反应条件，以禽副粘病毒4型的基因组RNA为原始材料，构建该病毒的基因组RNA的高通量测序文库(200bp);
第三步(高通量测序):将第二步构建的基因组RNA的高通量测序文库，按照PGM测序仪的操作步骤进行高通量测序；
第四步(测序结果分析):测序得到的reads，经质量控制和生物信息学分析，拼接成完整的禽副粘病毒4型基因组序列，并计算测序深度。
[0012]实际应用结果:共测序得到52，167 reads(Genbank登录号:SRR2132250)，并拼接成完整的禽副粘病毒4型基因组(15，274 bp, Genbank登录号:KC439346)。
【主权项】
1.一种RNA高通量测序文库构建方法，其特征为采用随机引物逆转录反应对初始RNA进行反转录，能够对低浓度RNA进行建库测序。2.—种RNA高通量测序文库构建方法，以RNA为初始样品，采用随机引物adaptor 1-nnnnnn进行反转录，并用随机引物adaptor2_nnnnnn合成DNA第二链，两次采用随机引物，减少了文库序列的偏好性；进而以引物Pl和P2进行聚合酶链式反应扩增，加入测序仪能够识别的序列；产物经电泳回收目的大小的DNA，用于高通量测序(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，adaptor表示相应的碱基，η代表碱基a、碱基t、碱基c和碱基g的混合物)。3.—种RNA高通量测序文库构建方法，以RNA为初始样品，采用随机引物 gtgtctccgactcagnnnnnn 进行反转录，并用随机引物 tgggcagtcggtgatnnnnnn合成DNA第二链，两次采用随机引物，减少了文库序列的偏好性；进而以引物ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag 和 ccgctttcctctctatgggcagtcggtgat 进行聚合酉每链式反应扩增，加入PGM测序仪能够识别的序列；产物经电泳回收目的大小的DNA，用于用于Life Technologies公司的1n torrent PGM高通量测序仪测序(本段文字中，引物序列均为5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相应的碱基，η代表碱基a、碱基t、碱基c和碱基g的混合物)。
【文档编号】C40B50/06GK105985949SQ201510730153
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年11月2日
【发明人】王楷宬, 陈继明, 陈贵钱
【申请人】中国动物卫生与流行病学中心