基因vii型新城疫病毒株、其疫苗组合物、制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了具有良好免疫原性的基因VII型新城疫病毒株以及由该新城疫病毒株传代致弱的弱毒株，所述新城疫病毒株F基因含有实质上编码SEQ ID NO.2所示蛋白序列的核苷酸序列，以及所述病毒株HN基因含有实质上编码SEQ ID NO.6所示的蛋白序列的核苷酸序列。本发明提供的新城疫病毒株，其毒力强、在鸡胚上生长速度快，相比于常规新城疫疫苗株，具有安全性好、免疫保护能力强、免疫效力高等优点。CCTCC NO: V 20143520141106
【专利说明】
基因 VI I型新城疫病毒株、其疫苗组合物、制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基因 VII型新城疫病毒株强毒株、由其通过反向遗传技术致弱的 弱毒疫苗株，本发明还涉及由该弱毒株制备的疫苗组合物以及该疫苗组合物的制备方法和 应用，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 新城疫是由新城疫病毒引起的多种禽类发生高度死亡的一种重要传染病。新城疫 病毒在中国已存在几十年，近年来由于疫苗的广泛使用，新城疫的发病率和死亡率均得到 了较好的控制，但自90年代初以来，非典型新城疫病爆发的现象时有发生，同时，临床上新 城疫病毒与其它呼吸道病原体协同致病的现象也较为常见，因此，新城疫仍然成为当前困 扰广大养殖户重要疾病之一。从近十年来的新城疫流行特点来看，临床上所分离到的新城 疫病毒毒株除传统的I型和II型外，大多数属于基因 VII型，而常规的新城疫疫苗株的基 因型主要为I和II型（如V4、LaSota等），在遗传距离上新城疫新分离株与常规新城疫疫 苗株相差较远，因此，常规疫苗对当前新城疫病毒强毒株的攻击并不能提供理想的免疫保 护效力。
[0003] 然而，不同新城疫病毒分离株之间的毒力差异很大，在鸡胚上的生长特性差异明 显，合适的基因 VII型新城疫病毒株的分离显得异常困难。因此，需要免疫原性良好的基因 VII型新城疫病毒株来制备疫苗，从而解决上述问题。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种F基因，所述F基因含有实质上编码SEQ ID N0. 2所示的蛋白 序列的核苷酸序列。
[0005] 术语"实质上编码"指其编码的蛋白可以通过添加、删除、替换一个或多个氨基酸 残基同时保持其功能和免疫原性。
[0006] 本发明提供了一种F基因，所述F基因实质上含有序列表中SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列。
[0007] 本发明提供了一种F基因，所述F基因含有实质上编码SEQ ID N0. 4所示的蛋白序 列的核苷酸序列。本发明提供了一种F基因，所述F基因实质上含有序列表中SEQ ID N0. 3 所示的核苷酸序列。
[0008] 作为本发明的一种实施方式，所述F基因含有的编码序列SEQ ID N0. 4是通过将 强毒F裂解位点112R/K-R-Q-K/R-R-F117突变为弱毒裂解位点112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117 来实现的。
[0009] 本发明提供了一种HN基因，所述HN基因含有实质上编码SEQ ID N0. 6所示的蛋 白序列的核苷酸序列。
[0010] 本发明提供了一种HN基因，所述HN基因实质上含有序列表中SEQ ID N0. 5所示 的核苷酸序列。
[0011] 本发明另一目的在于提供一种基因 VII型新城疫病毒株，所述病毒株含有序列表 中SEQ ID N0. 2所示的蛋白序列。
[0012] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明提供的基因 VII型新城疫病毒株进一步 含有序列表中SEQ ID N0. 6所示的蛋白序列。
[0013] 本发明另一目的在于提供一种基因 VII型新城疫病毒株，所述病毒株F基因含有 实质上编码SEQ ID N0. 2所示蛋白序列的核苷酸序列。
[0014] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明提供的基因 VII型新城疫病毒株HN基因 进一步含有实质上编码SEQ ID N0. 6所示的蛋白序列的核苷酸序列。作为本发明的一种优 选实施方式，所述病毒株为HN1101株，所述HN1101株生物保藏号为CCTCC N0:V201435。
[0015] 鸡新城疫病毒 HN1101 株（Newcastle disease virus，stain HN1101)，保藏号为 CCTCC N0:V 201435;保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为湖北省武汉·武汉大 学，保藏日期为2014年11月06日。
[0016] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明提供的基因 VII型新城疫病毒株为 HN1101株或其培养物。
[0017] 本发明又一个目的在于提供一种基因 VII型新城疫病毒弱毒株，所述弱毒株含有 序列表中SEQ ID N0. 4所示的蛋白序列。
[0018] 作为本发明的一种优选实施方式，所述弱毒株为本发明的所述病毒株F基因变异 为含有实质上编码SEQ ID N0. 4所示的蛋白序列的核苷酸序列。
[0019] 作为本发明的一种优选实施方式，所述弱毒株为所述HN1101株F基因变异为含有 实质上编码SEQ ID N0. 4所示的蛋白序列的核苷酸序列的致弱株HNllOlFm。
[0020] 优选地，本发明提供的基因 VII型新城疫病毒弱毒疫苗株为HNllOlFm株或其培养 物。
[0021] 术语"培养物"是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间 其基因序列仅可能会发生微小的变异，优选地，所述培养物是2-35代以内的培养物。
[0022] 作为本发明的一种实施方式，本发明提供的基因 VII型新城疫病毒弱毒疫苗株 HNllOlFm株是基因 VII型新城疫病毒株HN1101株通过反向遗传技术将强毒F裂解位点 112R/K-R-Q-K/R-R-F117 突变为弱毒裂解位点 112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117 致弱得到的。
[0023] 本发明另一个目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量 的本发明所述基因 VII型新城疫病毒株抗原和药学上可接受的载体。
[0024] 作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物包括免疫量的HN1101株 抗原和药学上可接受的载体。
[0025] 作为本发明的一种实施方式，本发明的所述疫苗组合物包括免疫量的HNllOlFm 株抗原和药学上可接受的载体。
[0026] 作为本发明的一种实施方式，上述基因 VII型新城疫病毒株抗原包括减毒活病毒 抗原、灭活病毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原。本发明所用术语"疫苗组合物"指含有基因 VII型新城疫病毒免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对基因 VII型新城疫病毒的免疫反应。所述疫苗组合物包括免疫量的基因 VII型新城疫病毒株的 减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗。
[0027] 优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的基因 VII型新城疫病毒株HN1101株或其培 养物的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗。
[0028] 优选地，所述疫苗组合物包括免疫量的基因 VII型新城疫病毒株HNllOlFm株或其 培养物的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或合成肽疫苗。
[0029] 本发明所用的术语"活疫苗"指的是毒力已经减弱但仍可在宿主体内或细胞上复 制的病毒制备的疫苗。
[0030] 本发明所用的术语"减毒"用于指使病原丧失致病性、但保持免疫原性的方式对基 因进行突变来人工降低病原体毒性。通常，通过UV辐射、化学处理或体外连续高阶继代培 养实现减毒。或者通过人工的基因改变，例如将已知序列中的特定核苷酸缺失或替换以使 毒力减弱。
[0031] 本发明所用的术语"灭活疫苗"，也称作失活疫苗，指的是用作抗原以产生免疫力 的灭活病毒的混悬液。灭活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以 很容易地产生灭活疫苗。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活疫苗。裂解型 疫苗可在用醚处理后由病毒包膜制备得到。例如用本发明的强毒株HN1101株可以通过灭 活的方法制备成灭活疫苗。
[0032] 本发明所用的术语"亚单位疫苗"指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗 原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起 副反应的可能性小。例如，表达的基因 VII型新城疫病毒的F基因、HN基因所编码的蛋白 可用于制备亚单位疫苗。
[0033] 本发明所用的术语"合成肽疫苗"指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽，即用 人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽，与载体连接后加佐剂所制成的疫 苗。
[0034] 优选地，所述疫苗组合物含有免疫量的基因 VII型新城疫病毒，该基因 VII型新城 疫病毒含有编码序列表中SEQ ID NO. 2所示氨基酸的核苷酸序列SEQ ID NO. 1、编码SEQ ID NO. 4所示氨基酸的核苷酸序列SEQ ID NO. 3、编码SEQ ID NO. 6所示氨基酸的核苷酸序 列 SEQ ID N0. 5。
[0035] 作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物含有免疫量的基因 VII型新城疫病 毒，所述基因 VII型新城疫病毒含有蛋白序列为SEQ ID N0. 2、4、6及核苷酸序列为SEQ ID NO. 1、3、5所示的变体。
[0036] "变体"旨在表示基本上类似序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸之内 的一个或更多位点的一个或更多核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中一个 或更多位点的一个或更多核苷酸的取代。如本文所用，"天然"多核苷酸或多肽分别包含天 然存在的核苷酸序列或蛋白序列。本发明的特定多核苷酸（即，参照多核苷酸）的变体也 可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的百分率序列 同一性来评价。"变体"蛋白旨在表示通过在天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多 氨基酸的缺失或添加，和/或天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的取代而 源于天然蛋白的蛋白。本发明包括的变体蛋白有生物学活性，即，它们有引发免疫应答的能 力，能对基因 VII型新城疫病毒攻击具有保护性反应的能力。
[0037] 变体包括等位基因变体。术语〃等位基因变体〃指称含有导致蛋白的蛋白序列变 化及在天然的群（例如，病毒物种或变种）之内存在的多态性的多核苷酸或多肽。该天然 的等位基因变异可一般导致多核苷酸或多肽的1%~5%变异。等位基因变体可通过在许 多不同物种中测序目的核酸序列来鉴定，其可通过使用鉴定那些物种中的相同的遗传座位 的杂交探针来容易进行。任何和全部该核酸变异及得到的氨基酸多态性或是天然的等位基 因变异的结果且不改变目的基因的功能活性的变异旨在本发明的范围之内。
[0038] 术语"预防"指通过其与基因 VII型新城疫病毒相关的感染或疾病的症状被阻断 或延迟；术语"治疗"指通过与基因 VII型新城疫病毒相关的感染或疾病的症状被缓和或完 全消除的过程。
[0039] 术语"保护性反应"意为在动物中预防基因 VII型新城疫病毒相关疾病或由基因 VII型新城疫病毒导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。
[0040] 本发明涉及的基因 VII型新城疫病毒基因，其有利地激发动物中的保护性反应。 具体地，本发明实施方式的基因序列包含与其功能衍生物基本相同的蛋白序列。
[0041] "基本上相同"可以理解为本发明的基因优选地具有这样的蛋白序列，其与SEQ ID NO :2、4、6中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚至优选地80%同源性，或 甚至更优选地90 %同源性，或最优选地95 %同源性。
[0042] 在本文中术语"同源性"还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简 单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具），本领域技术人员公知的程序进 行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0043] 优选地，所述疫苗组合物中基因 VII型新城疫病毒抗原为灭活的所述基因 VII型 新城疫病毒HN1101株全病毒抗原；所述疫苗组合物进一步包含佐剂。
[0044] 作为本发明的一种优选实施方式，所述基因 VII型新城疫病毒抗原为灭 活的HNllOlFm株全病毒抗原；所述灭活的HNllOlFm株全病毒抗原含量为灭活前 ^ 108-°EID50/0. 1ml 〇
[0045] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物中所述灭活的HNllOlFm株全 病毒抗原含量为 l〇s'°EID5Q/(X lml ~l(f°EID5Q/(X lml。
[0046] 术语"佐剂"指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知 的佐剂包括，但不限于：（1)氢氧化错、阜苷（Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，（2) 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，或（3)疫苗可以 以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成。
[0047] 尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃， 特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油 酸乙基酯，丙二醇二（辛酸酯/癸酸酯），甘油三（辛酸酯/癸酸酯），丙二醇二油酸酯；分 支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选 非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸（例如油酸），脱水山梨糖醇、甘露醇（例如 脱水甘露醇油酸酯）、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、 羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇（例如油醇）的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚 物，特别是 PluronicR，尤其是 L121(参照 Hunter 等，1995, "The Theory and Practical Application ofAdjuvants"（Steward_Tull，D.E.S 主编）John Wiley andSons，NY，51_94; Todd 等，Vaccine，1997,15, 564-570)〇
[0048] 特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化 合物被称作卡波姆。
[0049] 优选地，本发明选用佐剂为白油佐剂，制备油包水乳剂。
[0050] 在最终疫苗组合物中，佐剂的浓度范围是从10 %到70% V/V，优选从30 %到60% V/V，更优选 60% V/V。
[0051] 本发明的疫苗组合物进一步包含其他病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括基 因 VII型新城疫病毒感染的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。术语"联合疫苗"用于指从本 发明的基因 VII型新城疫病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语"复合 疫苗"指从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的基因 VII型新城疫病毒可与传染性支气 管炎病毒、禽流感病毒、法氏囊病毒、减蛋综合症病毒、病毒性关节炎病毒和/或大肠杆菌、 滑液囊支原体混合或组合。
[0052] 本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物。例如，本 发明的组合物还可以包含试剂，如：药物，免疫刺激剂（如：α -干扰素 、β -干扰素 、γ -干 扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)和白介素 2 (IL2))、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。为了 制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
[0053] 本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在 组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和 待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年 龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
[0054] 优选地，所述疫苗组合物中基因 VII型新城疫病毒抗原含量为灭活前 ^ 108-°EID50/0. 1ml 〇
[0055] 优选地，所述疫苗组合物中基因 VII型新城疫病毒抗原含量为灭活 前l(f°EID5Q/0. lml~l(f°EID5Q/0. lml。当基因 VII型新城疫病毒以灭活前少于 10s'°EIDM/0. lml的量使用时，疫苗不能有效刺激抗体产生。另一方面，超过的量可能是不经 济的。
[0056] 本发明的再一个目的在于提供一种预防和/或治疗基因 VII型新城疫病毒感染的 疫苗组合物的制备方法，其中，所述方法包括：
[0057] (1)培养增殖所述基因 VII型新城疫病毒；
[0058] (2)灭活所述增殖的基因 VII型新城疫病毒；
[0059] (3)加入佐剂，乳化。
[0060] 本发明的又一个目的在于提供所述的新城疫F基因及HN基因在制备预防和治疗 新城疫相关疾病的药物中的应用。
[0061] 本发明的又一个目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗新城疫相关 疾病的药物中的应用。
[0062] 本发明具有以下突出的优点：NDV虽然只有一个血清型，但是疫苗株和流行株在 基因型和抗原位点上都差异较大；国内外研究表明，当疫苗株与流行株的基因型一致时，其 不仅能提供理想的临床保护，而且能显著降低免疫鸡的强毒感染率和排毒量，在临床上可 有效控制免疫鸡群中非典型新城疫的发生；本发明提供的基因 νπ型新城疫病毒株，其毒力、 在鸡胚上生长速度等特性显著优异，克服了基因 w型新城疫病毒株难以分离出合适疫苗株 的困难，免疫效果良好，有利地预防新城疫病毒的感染。
[0063] 序列表中：
[0064] SEQ ID NO. 1为基因 VII型新城疫病毒F基因的核苷酸序列；
[0065] SEQ ID N0. 2为基因 VII型新城疫病毒F基因的编码蛋白序列；
[0066] SEQ ID N0. 3为基因 VII型新城疫病毒Fm基因的核苷酸序列；
[0067] SEQ ID N0. 4为基因 VII型新城疫病毒Fm基因的编码蛋白序列；
[0068] SEQ ID N0. 5为基因 VII型新城疫病毒HN基因的核苷酸序列；
[0069] SEQ ID N0. 6为基因 VII型新城疫病毒HN基因的编码蛋白序列。
【具体实施方式】
[0070] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0071] 实施例1基因 VII型新城疫病毒株的分离鉴定
[0072] 1. 1样品的采集及处理
[0073] 采山东、广东、四川、江苏、河南等地鸡场发病死亡鸡的脑、心、肝、脾、肾、气囊等组 织，按照1 :5比例加入生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS，PH7. 4)研成乳液，溶液中加入青霉素 (终浓度为l〇〇〇U/ml)和链霉素（终浓度为lmg/ml)，37°C作用lh或者4°C过夜，lOOOrpm 离心10min，取上清备用。
[0074] L 2病毒的分离和鉴定
[0075] 将步骤1. 1得到的上清接种9~11日龄SPF鸡胚，将接种后24h内死胚弃去，于接 种后24h~120h每天照胚，将死亡的鸡胚放置于4°C，不死亡的鸡胚于接种后120h收获，取 所有鸡胚尿囊液，检查尿囊液是否具有血凝性（HA)以及这种血凝性能否被新城疫特异抗 血清所抑制（HI)。有血凝性（HA效价>24,血凝价低于24再传一代），血凝性能被新城疫特 异血清所抑制，证明分离到了新城疫病毒，共分离10株新城疫病毒株，分别命名为SD1101、 SD1102、⑶1101、⑶1102、SC1101、SC1102、JS1101、JS1102、HN1101、HN1102。
[0076] 1.3病毒的纯化
[0077] 取步骤1. 2鉴定得到的新城疫病毒的样品用生理盐水分别进行10 6、10 7、10 8、10 9 稀释，每个稀释度经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚3枚，每枚鸡胚接种0. lml，石蜡封口后置 37°C孵化器内继续孵化，每天照蛋观察鸡胚的死亡情况。将接种后24h内死胚弃去，将死亡 的鸡胚和接种后5天未死的鸡胚测HA，取最高稀释度中HA效价较高的感染胚收获鸡胚尿囊 液。以同样的方法进行三次纯化。
[0078] 1. 4病毒的遗传进化分析
[0079] 参照姚春峰硕士论文《我国部分地区新城疫病毒的部分生物学特性鉴定及分子流 行病学研究》论文的方法设计用于扩增F基因的引物：
[0080] NDV F-F:GCCGAATTCCCGAATCATCACGACGCTTAA,
[0081] NDV F-R:GTGAAGCTTGAGTCTGTGAGTCGTAC
[0082] 扩增出来的PCR片段克隆入pEasy-blunt vector，送测序公司测NDV分离株的F 基因，采用NJ方法（Neighbor-joining Method，邻接法）构建分离株遗传进化树，并进行基 因分型，结果仅有3株为基因 W型新城疫病毒株，其他3株为基因 I型，，4株为基因 II型。 具体结果见表1。
[0083] 表1新城疫病毒分离株基因型鉴定结果
[0084]
[0085] 虽然非典型性新城疫时有发生，但从以上结果可以看出，不同地区分离的新城疫 病毒，基因 W型新城疫病毒株分离率依然较低，只有30%。
[0086] 1. 5.基因 W型新城疫病毒株进一步筛选
[0087] 测定步骤1. 4中鉴定出的3株基因 W型新城疫病毒株的血凝价（HA)、鸡胚平均致 死时间（MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI)和鸡胚半数致死量（ELD50)。具体方法 如下。
[0088] 血凝价测定按现行《中国兽药典》进行测定。
[0089] 鸡胚平均致死时间（MDT)测定方法：
[0090] (1)将新鲜感染的尿囊液用灭菌的生理盐水连续10倍递增稀释成10 6~10 9;
[0091] (2)每个稀释度尿囊腔接种10枚9~11日龄SPF鸡胚，每枚接种0. 1ml，置37°C 培养；
[0092] (3)每日照蛋4次，连续观察7天，记录各鸡胚死亡时间；
[0093] (4)最小致死量是指能引起所有用此稀释度接种的鸡胚死亡的最大稀释度；
[0094] (5)MDT是指最小致死量引起所有鸡胚死亡的平均时间（小时）。
[0095] 1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI)的测定方法：
[0096] (1)将HA滴度大于41og2的新鲜感染尿囊液，用等渗无菌生理盐水作10倍稀释；
[0097] (2)将稀释后的尿囊液脑内接种于出壳后24~40h之间的SPF雏鸡，每份样品接 种10只，每只接种0. 05ml，并设PBS阴性对照组和标准毒株阳性对照组；
[0098] (3)每24h观察一次，共观察8天；
[0099] (4)每天观察并给鸡打分，正常记作0,病鸡记作1，死鸡作2 (不能采食、饮水的鸡 只应剖杀，并在下次观察时记作死亡，每只死鸡在其死后的每日观察中仍记为2);
[0100] (5) ICPI是每只鸡8天内每次观察分值的平均数（最强毒力病毒的ICPI将接近最 大值2. 0,而温和型毒株的值近于0)。
[0101] 鸡胚半数致死量测定（ELD50):
[0102] 取待测病毒用生理盐水进行10 6、10 \ 10'10 9稀释，每个稀释度接胚5枚，分 别经尿囊腔接种9-11日龄SPF鸡胚，每个鸡胚接种0. lml，石蜡封口后置37 °C孵化器内 孵化，每天照蛋将死亡鸡胚置于4°C，逐日连续观察120h，测定所有鸡胚尿囊液的HA，根据 Reed-Muench法计算每个毒株的ELD50。
[0103] 结果：对分离的三株基因 W型新城疫病毒进行了生长特性和毒力的测定，结果显 不三株病毒在鸡胚上生长状况不一，虽然三株病毒均为强毒或者中强毒，但从病毒的生长 特性上来看，HN1101株的生长速度明显快于其他两个毒株，而且HA滴度也明显高于其他两 个毒株，毒力也是最强的，具体结果见表2。
[0104] 表2基因 W型新城疫病毒株进一步筛选
[0105]
[0106] 证明基因 W型新城疫病毒HN1101株是一株典型的基因 W型新城疫病毒强毒株， 其毒力、在鸡胚上生长速度等特性明显高于其他两株病毒。从不同地区筛选的10株新城疫 病毒，最终只筛选出一株合适的基因 w型新城疫病毒，进一步说明合适的基因 w型新城疫 病毒筛选的难度。基于基因 W型新城疫病毒HN1101株各方面指标的优异，所以选择HN1101 株进行后续试验。
[0107] 实施例2HN1101株新城疫病毒主要免疫原性基因测定
[0108] 2. 1HN1101株新城疫病毒RNA的抽提
[0109] 利用Trizol法抽提鸡胚尿囊液中的病毒基因组RNA,详细步骤如下：
[0110] (1)取鸡胚尿囊液 250 μ1，加入 750 μ1 Trizol(invitrogen，USA)，振荡混匀，室 温放置5分钟；
[0111] (2)每管加入氯仿200 μ 1，盖紧离心管，剧烈振荡离心管15秒，室温放置10分钟， 12000rpm离心15分钟；
[0112] (3)取上层水相放置于新的离心管中，加入700 μ 1异丙醇，4°C放置10分钟， 12000rpm离心10分钟；
[0113] (4)弃掉上清液，按每毫升Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混匀， 4°C下12000rpm离心5分钟；
[0114] (5)小心弃去上清液，室温干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的 溶解度；最后将RNA溶于水中。
[0115] 2. 2病毒RNA的反转录
[0116] 在20 μ 1反转录体系中（见表3)，依次加入以下成分：M-MLV Reverse Trascriptase (购自北京全式金生物技术有限公司）1. 0 μ 1，RNase inhibitor (购自北京 全式金生物技术有限公司）〇· 5 μ 1，5XM-MLV buffer4. 0 μ 1，dNTP(2. 5mM)2. 0 μ l，6nts primers (lOpmol) 1 μ 1，新城疫病毒RNA 11. 5 μ 1，混匀后置PCR仪中42°C lh进行反转录， 反转录产物直接用于PCR或者4°C保存备用。
[0117] 表3反转录体系
[0118]
[0119] 2. 3PCR扩增F和HN基因
[0120] 参照Genbank上NDV的F基因和HN基因测序，设计扩增F基因的引物和HN基因 的引物分别为：
[0121] NDFM-F 5' -TGCTCACTCCTCTTGGCGACTC-3'
[0122] NDFM-R 5' -TGCCCAAGAGTTGAGTCTGTGA-3'
[0123] NDHN-F 5' -GAACTCATAGTGGACGACATCA-3'
[0124] NDHN-R 5' -AACCATACACGGTCGTCAATA-3'
[0125] 按照表4的反应体系进行扩增。
[0126] 表4 PCR反应体系
[0127]
[0128] PCR扩增程序为预变性95°C，5min ;变性98°C，30s ;退火55°C，30s ;延伸72°C， 2min ;运行30个循环；最后于72°C延伸lOmin，同时设无模板的阴性对照，反应结束后在 1 %琼脂糖凝胶上电泳后，切下目的条带，用于回收。
[0129] 2. 4PCR产物回收
[0130] 电泳结束后在紫外光下从凝胶上切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，用DNA快速回 收试剂盒（E. N. Z. A.)回收DNA。方法如下：切下含有目的DNA的凝胶，放入一无菌的1. 5ml 的EP管中，加入3倍体积binding buffer，于50_60°C水浴中5min，其间轻弹EP管，使凝胶 完全溶化。然后将溶化的液体加入到回收柱内，lOOOOrpm离心lmin，倒掉收集管中废液，加 入 300 μ 1 binding buffer，lOOOOrpm离心 lmin，倒掉收集管中废液，用 500ml wash buffer lOOOOrpm离心洗柱子两次，倒掉废液后空离lmin，与柱子中央加入15-30 μ 1 ddH20,室温静 置2min，12000rpm离心2min，收集管中即为回收的DNA片段。
[0131] 2. 5连接反应
[0132] 收回的PCR产物直接连接到pEASY-blunt vector (购自北京全式金生物技术有限 公司）中，连接体系和条件为：PCR产物4yl，pEASY-blunt vector ΙμL，轻轻混匀后，室温 (20-37Γ )反应5min，反应结束后，将离心管至于冰上准备转化。
[0133] 2. 6连接产物的转化
[0134] 加连接产物与50 μ 1 transl-Tl感受态细胞中（在感受态细胞刚刚解冻时加入 连接产物），轻弹混匀后，冰浴20-30min ;42°C热激30S，立即置于冰上2min ;加入250 μ 1平 衡至室温的 S0B 或者 LB，200 转，37°C孵育 lh ;取 8 μ l，500mM IPTG，40 μ l，20mg/ml X-gal 混匀后，均匀地涂于准备好的平板上，在37°C放置30min ;待IPTG，X-gal被吸收后，取 200 μ 1菌液铺板，培养过夜。
[0135] 2. 7PCR方法鉴定阳性重组子
[0136] 挑选白色克隆至10 μ 1无菌水中，涡旋混匀；25 μ 1反应体系中，取1 μ 1混合液 用作PCR反应的模板，用M13F和M13R鉴定重组子；PCR反应条件：94°C预变性lOmin (裂 解细胞，失活核酸酶），94°C变性30S，55°C退火30S，72°C延伸（根据片段的大小确定延伸 时间）。30个循环，72°C后延伸10分钟，确定包含重组子的克隆，扩大培养后菌液用M13F， M13R引物测序。
[0137] 2. 8序列测定和分析
[0138] 序列送Invitrogen测序后，应用DNASTAR分析结果，结果显示序列为基因 W型新 城疫病毒的F基因和ΗΝ基因，序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 5。
[0139] 实施例3HN1101株新城疫病毒株的致弱
[0140] 参照扬州大学胡顺林的博士论文鹅源新城疫病毒反向遗传技术平台的建立及其 应用和新城疫La Sota疫苗株反向遗传操作系统及其应用（专利公开号：CN 1772909A)采 用分段克隆的方法建构全基因组cDNA克隆（转录载体），并分别扩增克隆NP、P与L到真 核表达载体pCI-neo中为NDV拯救的辅助质粒。NDV的拯救过程是将构建全基因组cDNA克 隆和含基因 NP、P与L的辅助质粒共转染表达T7RNA聚合酶的哺乳动物细胞，在辅助质粒提 供有关酶的作用下，cDNA克隆进行转录产生基因组正义单链RNA，辅助质粒表达的聚合酶 蛋白包裹该基因组正义单链RNA，形成核糖核蛋白复合体（RNPs)，然后以RNPs形式复制成 基因组负义单链RNA，由此进入NDV的正常生命循环，病毒各基因表达出相应的病毒蛋白后 通过出芽方式组装成有感染性的病毒粒子，然后通过接种鸡胚或敏感等细胞来扩增"人工 制造"的病毒粒子而获得大量拯救的NDV。
[0141] 像其它大多数RNA病毒的反向遗传研究一样，通过对NDV基因组cDNA克隆进行有 目的的人工改造，便可对改造后的病毒进行各种表型研究，例如，对NDV基因组中的强毒F 裂解位点 112R/K-R-Q-K/R-R-F117 突变为弱毒裂解位点 112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117,获得 F 裂解位点为弱毒株的NDV命名为NDV HNllOlFm。
[0142] 实施例4HN1101Fm株新城疫病毒弱毒株的生物学特性比较
[0143] 参考实施例1列举的方法测定HNllOlFm株与HN1101株新城疫病毒株的生物学特 性，结果见表5。
[0144] 表5 HNllOlFm株新城疫病毒弱毒株的生物学特性比较
[0145]
[0146] 结果显示，将裂解位点强毒F裂解位点112R/K-R-Q-K/R-R-F117突变为弱毒裂解 位点112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117获得的NDV HNllOlFm病毒生长特性不受影响，而毒力却大 幅度下降。
[0147] 说明NDV HNllOlFm的生长特性较快和低毒力的特性适合作为疫苗进行后续研究。
[0148] 实施例5HN1101Fm株新城疫病毒灭活疫苗制备
[0149] NDV HNllOlFm株E4代毒种用灭菌生理盐水稀释10, 000倍，接种10日龄SPF鸡胚 20枚，每胚接种0. lml，置37°C继续孵育。将接种后24h内死胚弃去，24h~96h死胚及时 放4°C，96h收混合样，经浓缩后，测定制苗毒的HA和EID 5。分别为10和109·5ΕΙ05(]/0. lml。 将测定好效价的新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10 %甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使 其充分混合，甲醛的最终浓度为0. 1%，37°C灭活16小时。
[0150] 按照表6组分配比，将灭活完全的病毒液徐徐加入到白油佐剂中，同时开动电 机，以4000r/min搅拌30~40分钟，在终止搅拌前加入1 %硫柳汞溶液，使其最终浓度为 0· 01%〇
[0151] 表6 HNllOlFm株新城疫灭活疫苗配比
[0152]
[0153] 实施例6HN1101Fm株新城疫病毒灭活疫苗效力试验
[0154] 取30日龄的SPF鸡30只，分成3组，每组10只，第1组和第2组分别胸部肌肉注 射免疫实施例5制备的疫苗1和疫苗2,免疫剂量为20 μ 1，第3组不免疫作为对照。所有试 验鸡均隔离饲养，免疫21日后，连同对照组采血分离血清，测定HI抗体效价，同时用ΗΝ1101 株10 5EID5。/只的剂量肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表7。
[0155] 表7 HNllOlFm株新城疫病毒灭活疫苗效力试验结果
[0156]
[0157] 注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数，表示为X土 SD，X代表平均数，SD代表 离散度。
[0158] 结果显示，疫苗1和疫苗2组在免疫后21天均能产生较高的抗体，而且两组和对 照相比，可以完全保护强毒的攻击。
[0159] 证明了疫苗1和疫苗2均能保护致死剂量的强毒攻击，疫苗含量不小于 10&°EID 5Q/0. lml即可提供对鸡群的完全保护。
[0160] 实施例7La Sota株新城疫病毒灭活疫苗的制备
[0161] 取La Sota株E6代毒种按照实施例5的制备方法制备La Sota株新城疫病毒灭 活疫苗，疫苗组分含量见表8。
[0162] 表8 La Sota株新城疫灭活疫苗配比
[0163]
[0164] 实施例8HN1101Fm株新城疫病毒灭活疫苗免疫原性对比试验
[0165] 取实施5制备的疫苗1及实施例7制备的疫苗3分别免疫21~28日龄SPF鸡， 疫苗1免疫20只鸡，疫苗3免疫20只鸡，20 μ 1/只，共40只，对照组10只鸡，胸部肌肉注 射，免前、免后21日和28日对全部鸡只采血分离血清，进行HI抗体效价测定（自身抗原）。 免后28日，用HN1101株和F48E9攻毒，攻毒剂量10 5ELD5。，滴鼻点眼进行攻毒，攻毒后每天 观察，观察14日，记录免疫组和攻毒对照组鸡只食欲、粪便、发病症状及有无死亡，在攻毒 后第5天分别采集免疫组每只鸡的喉头和泄殖腔拭子，将所有的喉头和泄殖腔拭子分别接 胚，每个拭子接胚3枚进行病毒分离，鸡胚液HA > 0即判为病毒分离阳性。阴性样本需盲 传一代后再进行判定。试验分组情况见表9。
[0166] 表9试验分组情况
[0167]
[0168] 疫苗1免疫组免疫后21日至28日HI抗体平均值达到了 1 : 64以上，且对照组 鸡均不高于1 : 4。说明疫苗的血清学方法检验结果均达到了现在疫苗的质量标准，而且在 免疫后28天疫苗1对自身抗原产生的HI抗体较疫苗3高。具体结果见表10。
[0169] 表10免疫后7天、14天、21天和28天HI抗体检测情况
[0170]
[0171] 各免疫组攻毒后观察14天，各免疫组均未见发病或死亡，均达到了现在NDV疫苗 的质量标准。攻毒后第5天采集喉头和泄殖腔棉拭子，分别进行病毒分离检测排毒，阴性样 品盲传一代。HNllOlFm结果各免疫组均未见排毒。对照组存活鸡两种拭子样品均为排毒阳 性。具体结果见表11、12。
[0172] 表11攻毒保护结果
[0173]
[0174] 表12攻毒第5天喉头和泄殖腔的排毒情况
[0175]
[0176] 注："/"表示此项无内容；"+A"表示喉头和泄殖腔排毒均为阳性；"一"表示喉头 和泄殖腔排毒均为阴性。
[0177] 结论：免疫后第7天可以检测到抗体，免疫28天后抗体滴度较高，而且NDV HNllOlFm较经典疫苗株La Sota抗体稍高，NDV HNllOlFm免疫后可以完全保护野毒和标 准强毒F48E9的攻击，说明本发明的疫苗组合物不仅能够预防基因 VII型NDV的感染且对 经典NDV也能有效免疫，并较La Sota免疫组保护率更高，而且比La Sota免疫组攻毒后相 比，无排毒。
[0178] 实施例9新城疫重组火鸡疱疹病毒疫苗的制备及其效力试验
[0179] 参考中国专利CN1774264A中重组火鸡疱疹病毒的制备方法，将新城疫编码SEQ ID N0. 2所示的蛋白序列的核苷酸序列、编码SEQ ID N0. 4所示的蛋白序列的核苷酸序列、 编码SEQIDN0.6所示的蛋白序列的核苷酸序列分别插入到火鸡疱疹病毒FC126株（ATCC VR-584B) UL44与UL46之间的0RF间区域，分别得到重组病毒rHVT-F、rHVT-Fm和rHVT-HN。
[0180] 以2000PFU/100 μ L/只的剂量将重组病毒rHVT-F、rHVT-Fm和rHVT-HN分别皮下 接种10只1日龄SPF鸡，同时设立对照组。接种后六周，用10 5ELD5。剂量的新城疫HN1101 株肌肉注射，观察发病情况。
[0181] 表13重组火鸡疱疹病毒疫苗效力试验结果
[0182]
[0183] 结果表明，本发明编码SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 4及SEQ ID N0. 6所示的蛋白具 有良好的免疫原性，利用该基因制备的重组活载体疫苗能够较好的抵抗流行毒株的攻击。
[0184] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽 然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人 员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修 饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实 质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种F基因，所述F基因含有实质上编码SEQ ID NO. 2所示的蛋白序列的核苷酸序 列。2. -种F基因，所述F基因含有实质上编码SEQ ID NO. 4所示的蛋白序列的核苷酸序 列。3. -种HN基因，所述HN基因含有实质上编码SEQ ID NO. 6所示的蛋白序列的核苷酸 序列。4. 一种基因 VII型新城疫病毒株，其特征在于，所述病毒株F基因含有实质上编码SEQ ID NO. 2所示蛋白序列的核苷酸序列，以及所述病毒株HN基因含有实质上编码SEQ ID NO. 6 所示的蛋白序列的核苷酸序列。5. 根据权利要求4所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株为HN1101株，所述HN1101 株生物保藏号为CCTCC NO :V201435。6. -种基因 VII型新城疫病毒的弱毒株，其特征在于，所述弱毒株为权利要求4或5 任一项所述病毒株F基因变异为含有实质上编码SEQ ID NO. 4所示的蛋白序列的核苷酸序 列；优选地，所述弱毒株为权利要求5中所述HN1101株F基因变异为含有实质上编码SEQ ID NO. 4所示的蛋白序列的核苷酸序列的致弱株HNllOlFm株。7. -种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求4~6任一项所述基 因 VII型新城疫病毒株抗原和药学上可接受的载体；所述基因 VII型新城疫病毒株抗原包 括减毒活病毒抗原、灭活病毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原。8. 根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述基因 VII型新城疫病毒抗原为 灭活的HN1101 Fm株全病毒抗原；所述灭活的HN1101 Fm株全病毒抗原含量为灭活前 彡l(f°EID5Q/0. lml ;优选地，所述疫苗组合物中所述灭活的HN1101 Fm株全病毒抗原含量 为 10s.°EID5(]/0· lml ~109.°EID5(]/0· lml。9. 一种制备权利要求7所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括： (1) 培养增殖所述基因 VII型新城疫病毒； (2) 灭活所述增殖的基因 VII型新城疫病毒； (3) 加入佐剂，乳化。10. 根据权利要求7~8任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗新城疫相关疾病 的药物中的应用。
【文档编号】A61P31/14GK105985966SQ201510099834
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月6日
【发明人】张许科, 孙进忠, 王同燕, 田克恭
【申请人】普莱柯生物工程股份有限公司