一种利用ZFN系统定点突变RNaseZ^S1获得温敏不育系的方法

一种利用ZFN系统定点突变RNase Z^S1获得温敏不育系的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用ZFN系统定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其根据RNase ZS1在水稻的TMS5或Os02g0214300或LOC_Os02g12290编码区分别设计左、右两侧的ZFN识别序列ZFN-L和ZFN-R，然后构建双元载体，遗传转化获得阳性转基因植株，在阳性转基因植株中筛选获得突变的植株，将突变的植株传代种植和分离，获得不带转基因成分且低温下育性恢复可育的植株作为温敏不育株等步骤。通过ZFN系统定点突变失活RNase ZS1蛋白，实现人工培育可以获得不带转基因成分的温敏不育系，具有目的性强，基因组损伤小，不带转基因成分，大大简化了生物安全评价过程。
【专利说明】
一种利用ZFN系统定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方 法
技术领域
[0001] 本发明涉及水稻温敏不育系的培育方法，具体涉及一种利用ZFN系统定点突变 RNase ZS1获得温敏不育系的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是最主要的粮食作物，全世界超过一半的人口以水稻为 主食。随着人口的增长以及可耕地面积的减少，粮食的供需不平衡变得日益显著，增加粮食 单位面积产量是解决粮食供需不平衡的主要措施之一。幸运的是，杂交水稻可以比常规水 稻提高20-30%的产量，在解决粮食不足的问题上起到了非常重要的作用，因此，杂交水稻 的种植面积稳步上升，现在大约占水稻种植面积的60%左右。
[0003] 根据所使用的不育系类型的不同可以将杂交水稻育种的方法分为两系法和三系 法。三系法使用细胞质雄性不育系和恢复系生产杂种h代种子，通过保持系和细胞质雄性 不育系杂交繁殖细胞质雄性不育系；但是可以作为恢复系的水稻品种在常规水稻中大约只 占5%，这大大降低了恢复系和不育系间的遗传多样性，限制了杂种优势的利用。而两系法 主要用光/温敏雄性核不育系作为不育系和保持系，因为光/温敏不育系育性受光周期和 温度调控，在不育条件下可作为不育系，在可育条件下可作为保持系，一系两用。与三系杂 交水稻相比，两系杂交水稻具有广泛的恢复系，不需要特殊的恢复基因，这使得配组相当自 由，利于亚种间杂种优势的利用，对提高杂交稻组合的产量、米质、抗性等存在更大潜在优 势；不育系可一系两用，不需要保持系，简化了生产程序，有利于降低制种成本；光/温敏不 育受核基因控制，与细胞质无关，丰富了细胞质遗传物质的多样性，可以避免三系杂交稻不 育细胞质的负效应和细胞质单一可能带来的潜在危险。因此温敏不育系在杂交水稻育种中 存在巨大潜力，相比而言，目前在两系杂交水稻育种中广泛应用的为温敏不育系。
[0004] 安农S-1温敏不育系是第一个被发现的籼型温敏不育突变体，温敏不育材料往往 通过自然突变或人工诱变获得，但是突变频率非常低，而利用传统育种手段将突变获得的 温敏不育材料培育成为温敏不育系需要漫长的过程，提高温敏不育系的培育效率，缩短培 育进程已经成为迫切需要解决的关键问题。因此必须使用遗传工程手段，突破传统育种的 局限。尽管，RNAi和反义RNA技术可实现对靶基因的抑制表达，但是并不能彻底去除基因 的功能，基因残留的功能往往会提高转基因植株的不育起点温度，不利于育种的安全，而且 这些转基因植株中不可避免的会残留外源序列，涉及转基因食品安全问题。最近，靶向突 变技术取得了突破性进展，已广泛应用于各类生物中。这些方法都是通过特异的靶识别序 列或引导序列将核酸内切酶引导到靶标位置，然后核酸内切酶切割靶标DNA，在细胞自身修 复系统的帮助下将切断的DNA修复链接起来，但是在修复过程中经常会导致碱基丢失或增 加。目前，虽然已经通过RNAi技术干涉RNase ZS1，获得温敏不育植株；但是RNAi技术只是 部分降低了 RNase ZS1的表达量，并不能使其彻底失活，使得转基因植株的不育起点温度较 高，并且不育起点温度不稳定，影响制种安全。
[0005] ZFN(锌指核酸酶，Zinc-finger nuclease)是第一种人工构建并成功应用的人工 核酸内切酶，是由锌指转录因子和Fok I核酸内切酶融合后，获得了具有特异性识别功能 的核酸内切酶。锌指结构域通常由3~6个Cys2-His2型锌指单元串联而成，每个锌指单 元能识别3~4个连续的核苷酸碱基。

【发明内容】

[0006] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用ZFN系统定点突变 RNase ZS1培育温敏不育系的方法，通过ZFN系统定点突变失活RNase Z S1蛋白的活性，获得 人工培育不带转基因成分的实用型温敏不育系，具有目的性强，基因组损伤小，不带转基因 成分，大大简化了生物安全评价过程。同时，加快了不育系的筛选进程，提高了效率，促进两 系杂交水稻的发展。
[0007] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0008] -种利用ZFN系统定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其包括以下步骤：
[0009] 1)靶标序列设计：根据RNase ZS1在水稻的TMS5或0s02g0214300或L0C_ 0s02gl2290编码区分别设计左侧ZFN识别序列和右侧ZFN识别序列；
[0010] 2)构建包含识别左右侧序列的ZFN双元载体；
[0011] 3)遗传转化获得阳性转基因植株；
[0012] 4)筛选阳性转基因植株获得突变的植株；
[0013] 5)将上述突变的植株传代种植和分尚，获得育性恢复可育且不带转基因成分的植 株作为温敏不育株。
[0014] 具体地，步骤2)中，因为ZFN以二聚体的形式起作用，所以首先分别构建识别左右 侧识别序列的ZFN-L和ZFN-R，然后将ZFN-L和ZFN-R载体中的ZFN表达盒切割下来链接到 同一个双元载体中，形成ZFN双元载体。
[0015] 具体地，步骤3)具体为：将ZFN双元载体通过农杆菌介导的遗传转化法或基因枪 法转化水稻愈伤组织；经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素鉴 定并收集阳性转基因植株。
[0016] 具体地，步骤4)具体为：提取T。代阳性转基因植株的DNA，用引物SEQ ID N0. 2和 SEQ ID NO. 3进行扩增，产物经纯化后送公司测序，测序结果与未转基因的野生型植株序列 进行比较，碱基缺失、插入或替换的植株为突变成功的植株。
[0017] 具体地，步骤5)具体为：收获T。代实现定点突变的植株的种子，在高温/长日条 件下种植!\代植株，通过表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分但表型不育的 植株种植于低温/短日条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏 不育系。
[0018] 具体地，在本发明中步骤4)所述突变的植株表现为碱基缺失或碱基插入或碱基 替换。
[0019] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0020] 1.本发明所述的利用ZFN系统定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法将定 点突变得到温敏不育突变体，实现了人工培育实用型温敏不育系，且这种温敏不育系是可 以不带转基因成分的，具有目的性强，基因组损伤小的优点，能够规避转基因可能带来的风 险；
[0021] 2.本发明所述的利用ZFN系统定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法缩短了 培育温敏不育系的时间，加快了育种的进程，节省了成本；
[0022] 3.本发明所述的方法基本不改变受体材料的遗传背景，并可以通过将三系杂交水 稻的保持系定点突变为温敏不育系，可将三系杂交稻改为两系杂交稻，拓展恢复系的筛选 范围，提尚杂种优势利用效率，进而提尚广量、抗性和稻米品质；
[0023] 4.本发明克服了自然突变或传统的人工诱变TMS5 (RNase ZS1)失活的新突变所存 在的难题；诱变新的可用于两系杂交育种的温敏不育系。
[0024] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例1所获得的ZFN-TMS5-6T#植株潮霉素鉴定结果，其中1-7 分别为代植株中的7株；
[0026] 图2为实施例1中所获得的ZFN-TMS5-6植株在不同温度条件下的花粉育性，其 中，ΗΤ表示高温，LT表示低温，WT表示转基因前的植株。
【具体实施方式】
[0027] -种利用ZFN系统定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其包括以下步骤：
[0028] 1)靶标序列设计：根据RNase ZS1在水稻的TMS5或0s02g0214300或L0C_ 0s02gl2290编码区分别设计左侧ZFN识别序列和右侧ZFN识别序列；
[0029] 2)构建包含识别左右侧序列的ZFN双元载体；
[0030] 3)遗传转化获得阳性转基因植株；
[0031] 4)筛选阳性转基因植株获得突变的植株；
[0032] 5)将上述突变的植株传代种植和分尚，获得育性恢复可育且不带转基因成分的植 株作为温敏不育株。
[0033] 具体地，步骤1)中，左右侧识别序列一般间隔5-7碱基，识别序列长度一般为 15-21个碱基。
[0034] 在本发明的研究中发现双链DNA的切割需要2个Fok I形成二聚体来实现。因 此，ZFN通常是成对使用，每个ZFN分别结合切割位点两侧各一条链上的核苷酸，中间有一 个5~7bp (base pairs)的间隔。具体地，步骤2)中，因为ZFN以二聚体的形式起作用，所 以首先分别构建识别左右侧识别序列的ZFN-L和ZFN-R，然后将ZFN-L和ZFN-R载体中的 ZFN表达盒切割下来链接到同一个双元载体中，形成ZFN双元载体。
[0035] 具体地，步骤3)具体为：将ZFN双元载体通过农杆菌介导的遗传转化法或基因枪 法转化水稻愈伤组织；经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素鉴 定并收集阳性转基因植株。
[0036] 具体地，步骤4)具体为：提取T。代阳性转基因植株的DNA，用引物SEQ ID N0. 2和 SEQ ID NO. 3进行扩增，产物经纯化后送公司测序，测序结果与未转基因的野生型植株序列 进行比较，碱基缺失、插入或替换的植株为突变成功的植株。
[0037] 具体地，步骤5)具体为：收获T。代实现定点突变的植株的种子，在高温/长日条 件下种植T1代植株，通过表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分但表型不育 的植株种植于低温/短日条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温 敏不育系。
[0038] 具体地，在本发明中步骤4)所述突变的植株表现为碱基缺失或碱基插入或碱基 替换。
[0039] 以下是本发明具体的实施例。
[0040] 实施例1
[0041] 在粳稻品种中花11中利用ZFN系统定点突变RNase ZS1 (0s02g0214300)获得温敏 不育系，具体步骤如下：
[0042] 1)靶标序列设计：
[0043] 靶位点的识别序列SEQ ID NO. 1 :AAGCAGCTGAagctgTCAGGTGTGG,划线部分为左、右 侧ZFN蛋白识别序列，小写字母部分为Fok I切割位点。
[0044] 2)构建含成对的ZFN的双元载体：
[0045] 将ZFN-TMS5-1L和ZFN-TMS5-1R的序列转化成ZFN的识别模块，合成锌指蛋白基 因序列，并与Fok I基因序列融合，分别构建成ZFN-L和ZFN-R载体。将ZFN-L和ZFN-R的 表达盒切割下来聚合到同一个双元载体上。
[0046] 3)遗传转化获得阳性转基因植株：
[0047] 将含靶标的ZFN-TMS5-1载体通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻胚性愈伤 组织；经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素鉴定阳性转基因植 株；
[0048] 6)阳性转基因植株经纯化后获得突变的植株：
[0049] 提取T。代阳性植株的DNA，用引物TMS7F，序列为SEQ ID N0. 2 : AGATTGGTCAGGAGCACGAG 和 TMS7R，序列为 SEQ ID NO. 3 :ACAGAACCACGCACAGCATC 扩增上述 DNA，产物经纯化后送公司测序，测序结果与野生型植株序列比较，分析突变情况，具体参见 SEQ ID NO. 4-SEQ ID NO. 6 ；
[0053] 其中，TMS5-6和TMS5-43表示不同的转基因株系；WT表示野生型；序列中表 不喊基缺失；测序结果显不：突变植株占总阳性转基因植株的3. 5%，喊基的缺失说明定点 突变成功；及该突变类型为碱基缺失；
[0054] 7)上述突变的植株传代种植，获得育性恢复可育的植株作为温敏不育株：
[0055] 收获T。代实现定点突变的植株的种子，在高温/长日条件下种植T i代植株，通过 育性观察和潮霉素阳性鉴定分离到不带转基因成分且表型不育的植株种植于短日/低温 条件下，花粉育性可恢复的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育系；结果参见图1 和2 〇
[0056] 图1的结果表明，1\代植株中4和6是不带转基因成分的；图2结果表明，6号植 株在高温下表现为花粉败育，而低温下表现为育性恢复。
【主权项】
1. 一种利用ZFN系统定点突变RNase Z S1获得温敏不育系的方法，其包括以下步骤： 1) 靶标序列设计：根据RNase ZS1在水稻的TMS5或0s02g0214300或L0C_0s02gl2290 编码区分别设计左、右两侧的ZFN识别序列ZFN-L和ZFN-R ; 2) 构建含左侧识别序列ZFN-L和右侧识别序列ZFN-R的双元载体； 5) 上述双元载体遗传转化获得阳性转基因植株； 6) 筛选出阳性转基因植株中获得突变的植株； 7) 将上述突变的植株传代种植，获得不带转基因成分且育性恢复可育的植株作为温敏 不育株。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，左侧ZFN识别序列与右侧ZFN识别序列之 间间隔5-7个碱基。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)包括先构建识别左右侧识别序列 的ZFN-L和ZFN-R，然后将ZFN-L和ZFN-R载体中的ZFN表达盒切割下来链接到同一个双元 载体中，形成ZFN双元载体。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤5)具体为：将ZFN双元载体通过根 癌农杆菌介导的遗传转化或基因枪法转化水稻愈伤组织；经筛选，分化和生根成苗，炼苗后 种植于网室，通过潮霉素鉴定并收集阳性转基因植株。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤6)具体为：提取T。代阳性转基因植 株的DNA，用引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3对DNA进行扩增，产物经纯化后送公司测序， 测序结果与野生型植株序列比较，获得突变成功的植株。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤7)具体为：收获T。代实现定点突变 的植株的种子，在长日/高温条件下种植?\代植株，通过花粉育性观察和潮霉素阳性检测 分离不带转基因成分且表型不育的植株种植于短日/低温条件下，育性恢复可育的植株作 为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育系。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述突变的植株为识别序列间碱 基缺失或碱基替换的植株。
【文档编号】C12N15/55GK105985980SQ201510083801
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月13日
【发明人】庄楚雄, 周海, 陈亮, 姜大刚, 李静
【申请人】华南农业大学