一种快速测定饲料用纤维素酶酶活力的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速测定饲料用纤维素酶酶活力的方法。该测定饲料用纤维素酶酶活力的方法，包括如下步骤：将用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸秆粉加入到含有待测饲料用纤维素酶的液体中，获得酶解反应液；将所述酶解反应液进行酶解反应，测定所述酶解反应产生的可溶解物的质量，得到所述待测饲料用纤维素酶的酶活力。该方法既可以快速检测饲料用纤维素酶在缓冲溶液中的酶活力，又可以快速检测饲料用纤维素酶在离体动物消化液中的酶活力。饲料生产企业和养殖户可以参照本发明的方法对纤维素酶的酶活力进行分析和比较，适用于饲料用纤维素酶的研究、生产和应用。
【专利说明】
一种快速测定饲料用纤维素酶酶活力的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及饲料领域中一种快速测定饲料用纤维素酶酶活力的方法。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶是目前饲料工业中应用很广的单体酶，也是一种很成熟的饲料酶，约占 整个饲料酶产值的15%左右。在动物饲料中添加适量纤维素酶可提高饲料利用率，在促进 动物生长、减少粪便排放、改善生态环境和防治动物疾病等方面均有明显效果，且在很大 程度上避免了因添加抗生素、激素和高铜等物质所产生的负面影响，具有明显的经济效益 和环保意义。
[0003] 随着纤维素酶在饲料中的广泛应用，对纤维素酶酶活力评价方法的需求也越来越 迫切。长期以来，纤维素酶酶活力的分析测定一直是饲料工业领域中很有争议的话题，现 有分析方法所提供的分析数据的实用性和重复性都不理想。目前，纤维素酶的酶活力评价 主要以羧甲基纤维素钠（简称CMC钠盐）为底物，所用羧甲基纤维素钠纯度高而且易溶于 水，但是饲料成分相对比较复杂，其中含有的天然的纤维素基本上都是不溶于水的高聚化 合物，而且这些化合物通常与饲料原料中的其他成分（木质素、葡聚糖和木聚糖等）相互交 联在一起，组成结构复杂的聚合体，因此纯化的羧甲基纤维素钠不能模拟纤维素酶在体内 作用时所面对的复杂底物成分。动物饲养试验虽然直观，可靠性也比较好，但是试验的时间 太长（至少需要2个月），成本很高，在实际生产过程中很难推广，与科研过程中的快速分析 要求相差甚远。
[0004] 另外，纤维素酶还有很多同工酶，它们对酸碱环境的适应性、对温度的耐受性以及 对动物消化道环境的抗逆性都有差异，用目前标准的实验室分析方法是很难区别的，而实 际生产应用却很需要这些数据。
[0005] 因此，探索并建立一种更为科学、客观和简便评价纤维素酶酶活力的体外检测方 法是迫切需要的。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是如何快速、更符合实际地测定饲料用纤维素酶的酶 活力。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种测定饲料用纤维素酶酶活力的方 法。
[0008] 本发明所提供的一种测定饲料用纤维素酶酶活力的方法，包括如下步骤：将用于 测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉加入到含有待测饲料用纤维素酶的液体中，获得酶解 反应液；将所述酶解反应液进行酶解反应，测定所述酶解反应产生的可溶解物的质量，得到 所述待测饲料用纤维素酶的酶活力。
[0009] 上述方法中，所述用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉是将植物的茎粉 碎得到的粉。所述用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉中秸杆颗粒的粒径可为 370-850 μ m〇
[0010] 上述方法中，所述含有待测饲料用纤维素酶的液体可为含有待测饲料用纤维素酶 的缓冲溶液或含有待测饲料用纤维素酶的离体动物消化液。所述含有待测饲料用纤维素酶 的缓冲溶液可用所述待测饲料用纤维素酶和醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制，所述含有待测饲 料用纤维素酶的离体动物消化液可用所述待测饲料用纤维素酶和所述离体动物消化液配 制。所述离体动物消化液具体可为离体动物胃液，所述离体动物胃液具体可为离体牛瘤胃 液。
[0011] 上述方法中，所述酶解反应液中，所述纤维素酶的浓度可为〇. 164-0. 167mg/mL， 具体可为0. 164mg/mL或0. 167mg/mL ;所述猜杆粉的浓度可为16. 4-16. 7mg/mL，具体可为 16. 4mg/mL或16. 7mg/mL ;所述纤维素酶与所述秸杆粉的质量比可为1 :100。
[0012] 上述方法中，所述酶解反应的反应温度可为37-39. 5°C，具体可为37°C。
[0013] 上述方法中，所述酶解反应液的pH值可为5. 5-6. 8,具体可为5. 5或6. 8 ;所述 酶解反应时间可为 30_240min，具体可为：30-100min、100-240min、30min、60min、90min、 lOOmin、120min、150min、180min、210min 或 240min〇
[0014] 上述方法中，所述可溶解物的质量可按照公式3获得，所述公式3为：可溶解物质 量=秸杆粉总质量-残留物质量；所述秸杆粉总质量为用于测定饲料用纤维素酶酶活力 的秸杆粉的干重；所述残留物质量为将所述纤维素酶酶解反应后的溶液在相对离心力为 5〇〇g条件下离心3min获得的酶解反应后的残留物干重；所述可溶解物的质量以干重计。
[0015] 上述方法中，所述用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉可按照下述用于测定 饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉的制备方法制备。
[0016] 为解决上述技术问题，本发明还提供了上述用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸 杆粉的制备方法。
[0017] 本发明所提供的用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉的制备方法，包括如下 步骤：将植物的茎粉碎，得到粒径为370-850 μ m的粉，该粉即为所述用于测定饲料用纤维 素酶酶活力的秸杆粉。
[0018] 上文中，所述秸杆可为成熟农作物的茎，如成熟玉米的茎、成熟高粱的茎、成熟水 稻的茎和成熟小麦的茎。
[0019] 本发明所提供的上述方法在鉴别饲料用纤维素酶酶活力中的应用也属于本发明 的保护范围。
[0020] 实验证明，本发明的测定饲料用纤维素酶酶活力的方法能够直观、简便，客观全面 地测定饲料用纤维素酶的酶活力。本发明的测定饲料用纤维素酶酶活力的方法，以秸杆颗 粒粒径范围为370-850 μπι的秸杆粉为底物，既可以快速检测饲料用纤维素酶在缓冲溶液 中的酶活力，又可以快速检测饲料用纤维素酶在离体动物消化液中的酶活力。饲料生产企 业和养殖户可以参照本发明的方法对纤维素酶的酶活力进行分析和比较，适用于饲料用纤 维素酶的研究、生产和应用。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0022] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0023] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024] 下述实施例中的纤维素酶A为武汉新华扬生物有限公司的饲用纤维素酶，纤维素 酶B为济南诺能生物科技有限公司的产品（CS10000)，纤维素酶C为北京盛世嘉明科技开发 有限公司的产品（NXE10000)，纤维素酶D为南京添嘉生物科技有限公司的纤维素酶。
[0025] 实施例1、用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉的制备
[0026] 取成熟的玉米秸杆200kg，去掉叶和根，留下茎杆，用粉碎机粉碎，得到秸杆粉。将 秸杆粉第一次经20目筛筛分，收集过20目筛的秸杆粉过筛物，获得秸杆粉第一次过筛物 56kg。将秸杆粉第一次过筛物再用40目筛子第二次筛分，保留粒径在20目至40目之间的 秸杆粉颗粒，该秸杆粉颗粒即为用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉，其重量为16kg。 该用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉的颗粒粒径为370-850 μ m，将该用于测定饲料 用纤维素酶酶活力的秸杆粉分装在密闭的容器中，保持干燥和低温环境。
[0027] 实施例2、饲料用纤维素酶在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中的酶活力测定
[0028] 醋酸-醋酸钠缓冲溶液的配制：在lOOOOmL蒸馏水中加入9. OmL冰醋酸和69. 70g 无水醋酸钠，搅拌l〇min，使醋酸钠彻底溶解得到醋酸-醋酸钠缓冲溶液，该醋酸-醋酸钠缓 冲溶液中醋酸根离子的浓度为〇. lmol/L，pH值为5. 5。
[0029] 含有饲料用纤维素酶A的缓冲溶液的配制：向烧杯中加入1. 000g粉状饲料用纤维 素酶A，然后加入50mL上述醋酸-醋酸钠缓冲溶液，磁力搅拌10min后转移到100mL容量瓶 中，并用上述醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容至l〇〇mL，配置成质量百分浓度为1 %的饲料用纤 维素酶A的缓冲溶液。
[0030] 取8个1 OOOrnL的三角瓶，依次编号为1、2、3、4、5、6、7和8，分别向每个三角瓶中加 入600mL上述醋酸-醋酸钠缓冲溶液，再向每个三角瓶中分别加入10. 0g实施例1的用于 测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉，在37°C恒温水浴中放置30min，然后再向8个三角瓶 中按编号从1至8的顺序依次分别加入10mL质量百分浓度为1 %的饲料用纤维素酶A的缓 冲溶液，分别得到1-8号饲料用纤维素酶A的酶解反应液。
[0031] 将8个装有饲料用纤维素酶A的酶解反应液的三角瓶放置在37°C恒温水浴中，按 照编号顺序从1-8号三角瓶中（与加入饲料用纤维素酶A溶液的顺序一致），每隔30min抽 取一个三角瓶（第30min抽取1号三角瓶，第60min抽取2号三角瓶，第90min抽取3号三 角瓶，第120min抽取4号三角瓶，第150min抽取5号三角瓶，第180min抽取6号三角瓶， 第210min抽取7号三角瓶，第240min抽取8号三角瓶），将三角瓶中的酶解反应后的溶液 在相对离心力为500g条件下离心3min获得酶解反应后的残留物，依次得到1号三角瓶中 的酶解反应后的残留物，2号三角瓶中的酶解反应后的残留物，3号三角瓶中的酶解反应后 的残留物，4号三角瓶中的酶解反应后的残留物，5号三角瓶中的酶解反应后的残留物，6号 三角瓶中的酶解反应后的残留物，7号三角瓶中的酶解反应后的残留物和8号三角瓶中的 酶解反应后的残留物。分别将各个编号的酶解反应后的残留物置于托盘中，做好标记，在 80°C恒温箱中均气流干燥4h，得到干燥后的残留物，测定干燥后残留物的质量，计算可溶解 物的质量、降解率和降解速度，其中：
[0032] 降解率=(秸杆粉总质量-残留物质量）/秸杆粉总质量X 100%公式1
[0033] 降解速度=(秸杆粉总质量-残留物质量）/降解时间 公式2
[0034] 可溶解物质量=秸杆粉总质量-残留物质量 公式3
[0035] 公式1、公式2和公式3中的秸杆粉总质量均为实施例1的用于测定饲料用纤维素 酶酶活力的秸杆粉的干重，残留物质量和可溶解物质量均为干重，结果如表1所示。
[0036] 表1、醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH值为5. 5)中纤维素酶A的酶活力测定结果
[0037]
[0038] 本实施例中饲料用纤维素酶A的一个酶活力单位是指在37°C和pH值为5. 5的条 件下，每分钟从实施例1的用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉中释放出1 μπιο?可溶 解物所需要的饲料用纤维素酶Α的量。
[0039] 随着酶解反应时间的延长，产生的可溶解物的质量不断增加，用于测定饲料用纤 维素酶酶活力的秸杆粉的降解率也不断增加；随着酶解反应时间的延长，用于测定饲料用 纤维素酶酶活力的秸杆粉中的可降解物质比例不断减少，使得降解速度不断下降，这种情 况符合实际。
[0040] 实施例3、饲料用纤维素酶在离体牛瘤胃液中的酶活力测定
[0041] 在肉牛屠宰场收集5个肉牛瘤胃（肉牛的体重在500kg左右），收集肉牛瘤胃内 的内容物，混合均匀，用8层医用纱布挤压过滤混匀后的牛瘤胃内容物，收集过滤液，获得 6000mL肉牛瘤胃食糜过滤液，然后将肉牛瘤胃食糜过滤液在相对离心力为500g条件下离 心2min，获得3600mL肉牛瘤胃食糜过滤液上清液并进行pH值测定，pH值为6. 8,作为分析 饲料用纤维素酶酶活力的离体牛瘤胃液。
[0042] 取4个1000mL三角瓶，分别加入0. lg饲料用纤维素酶A、饲料用纤维素酶B、饲料 用纤维素酶C和饲料用纤维素酶D(都是粉状酶），每个三角瓶中只加入一种酶，将只加入饲 料用纤维素酶A的三角瓶编号为A，将只加入饲料用纤维素酶B的三角瓶编号为B，将只加 入饲料用纤维素酶C的三角瓶编号为C，将只加入饲料用纤维素酶D的三角瓶编号为D ;再 分别向编号为A、B、C和D的三角瓶中各加入600mL上述作为分析饲料用纤维素酶酶活力 的离体牛瘤胃液，磁力搅拌2min后在37°C恒温水浴保温2min，使得饲料用纤维素酶充分溶 解，得到含有纤维素酶A的离体牛瘤胃液，含有纤维素酶B的离体牛瘤胃液，含有纤维素酶C 的离体牛瘤胃液和含有纤维素酶D的离体牛瘤胃液。向含有纤维素酶A的离体牛瘤胃液， 含有纤维素酶B的离体牛瘤胃液，含有纤维素酶C的离体牛瘤胃液和含有纤维素酶D的离 体牛瘤胃液中依次加入10. 〇g实施例1的用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉，获得 饲料用纤维素酶A的酶解反应液、饲料用纤维素酶B的酶解反应液、饲料用纤维素酶C的酶 解反应液和饲料用纤维素酶D的酶解反应液。在37°C恒温水浴中反应lOOrnin，获得饲料用 纤维素酶A的酶解反应后的溶液、饲料用纤维素酶B的酶解反应后的溶液、饲料用纤维素酶 C的酶解反应后的溶液和饲料用纤维素酶D的酶解反应后的溶液。将饲料用纤维素酶A的 酶解反应后的溶液、饲料用纤维素酶B的酶解反应后的溶液、饲料用纤维素酶C的酶解反应 后的溶液和饲料用纤维素酶D的酶解反应后的溶液依次在相对离心力为500g条件下离心 3min，获得饲料用纤维素酶A的酶解反应后的残留物、饲料用纤维素酶B的酶解反应后的残 留物、饲料用纤维素酶C的酶解反应后的残留物和饲料用纤维素酶D的酶解反应后的残留 物，收集上述各种饲料用纤维素酶的酶解反应后的残留物。分别将各种饲料用纤维素酶的 酶解反应后的残留物置于托盘中，做好标记，在80°C恒温箱中均气流干燥4h，得到干燥后 的残留物，测定干燥后残留物的质量，计算可溶解物的质量和降解率，其中：
[0043] 降解率=(秸杆粉总质量-残留物质量）/秸杆粉总质量X 100%公式1
[0044] 可溶解物质量=秸杆粉总质量-残留物质量 公式3
[0045] 公式1和公式3中的秸杆粉总质量均为实施例1的用于测定饲料用纤维素酶酶活 力的秸杆粉的干重，残留物质量和可溶解物质量均为干重，结果如表2所示。
[0046] 表2、离体牛瘤胃液中四种饲料用纤维素酶的酶活力测定结果
[0047]
[0048] 本实施例中饲料用纤维素酶的一个酶活力单位是指在37°C和pH值为6. 8的条件 下，每分钟从实施例1的用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉中释放出1 μπιο?可溶解 物所需要的饲料用纤维素酶的量。
[0049] 表2中根据四种饲料用纤维素酶在相同实验条件下释放可溶解物的降解率表明， 饲料用纤维素酶Β的功效最显著。
【主权项】
1. 一种测定饲料用纤维素酶酶活力的方法，包括如下步骤：将用于测定饲料用纤维素 酶酶活力的秸杆粉加入到含有待测饲料用纤维素酶的液体中，获得酶解反应液；将所述酶 解反应液进行酶解反应，测定所述酶解反应产生的可溶解物的质量，得到所述待测饲料用 纤维素酶的酶活力。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶解反应的反应温度为37-39. 5°C。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶解反应液的pH值为5. 5-6. 8。4. 根据权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述用于测定饲料用纤维素 酶酶活力的秸杆粉的制备方法包括将植物的茎粉碎，得到粒径为370-850 μπι的粉，该粉即 为所述用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉。5. 权利要求4所述的用于测定饲料用纤维素酶酶活力的秸杆粉的制备方法。6. 权利要求1-5中任一所述方法在鉴别饲料用纤维素酶酶活力中的应用。
【文档编号】C12Q1/34GK105986004SQ201510043706
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月28日
【发明人】蒋慧
【申请人】北京晟亚育达生物科技有限公司