急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变基因及其应用

急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变基因及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变基因、评估ALL耐药复发风险的试剂盒以及筛选治疗或预防ALL耐药复发的药物的方法。该突变基因是PRPS1突变基因。本发明为儿童急性淋巴细胞白血病耐药复发的预防和治疗提供了有力的技术手段和支持。
【专利说明】
急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变 基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 儿童急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)是儿童期常见 的恶性血液系统肿瘤疾病，是我国儿童因病死亡的重要原因之一。尽管在过去几十年经过 众多努力后，儿童ALL的治疗和预后已有显著改善，但仍有15%~20%的患儿会复发，一旦 复发，治愈率不足40%，复发一直是造成儿童ALL治疗失败和死亡的首要因素。复发问题日 益成为国内外儿童ALL研究的热点和焦点。
[0003] 儿童ALL治疗过程中，化疗是诱导缓解和缓解后治疗的主要手段之一。目前临床 上常用的化疗药物通常是利用核苷酸类似物破坏DNA、RNA的合成，从而导致DNA损伤诱导 肿瘤细胞凋亡。儿童ALL诱导缓解阶段，通过大剂量药物的联合化疗，有90 %的病人会得到 缓解，缓解后会通过低剂量的化疗药物来维持治疗，在维持治疗期主要是通过口服6-巯基 嘌呤（6-MP)或6-巯鸟嘌呤（6-TG)，肿瘤细胞需要耐受6-MP/6-TG的作用才会积累复发。最 近Adolfo Ferrando和William L Carroll的研究小组利用二代测序技术对耐药复发的白 血病患者的样本进行检测，发现复发的ALL细胞中的5' -核苷酸酶II (NT5C2)基因存在突 变，该基因负责编码与核苷酸及核苷酸类似药物6-巯基嘌呤出-MP)和6-巯鸟嘌呤出-TG) 的代谢相关酶，在ALL耐药复发中的突变比例约为10%。儿童ALL的耐药复发并非是一个 基因的单碱基突变可以解释的，寻找复发相关的遗传学变异仍是目前儿童ALL耐药复发研 究的重点和难点，与之相应的检测与治疗手段也因此比较缺乏。
[0004] PRPS1基因编码磷酸核糖焦磷酸合成酶，是细胞内嘌呤代谢合成途径的第一个 限速酶。PRPS1催化5-磷酸核糖和ATP的反应，生成AMP和PRPP (5-磷酸核糖-1-焦磷 酸）。PRPP经过一系列酶催化反应后生成次黄嘌呤核苷酸（HIP)，頂P进一步转变为（d) ATP和（d)GTP等DNA和RNA合成的原料。细胞内PRPP的含量过高或者过少，都可能引起 以它为底物或者调节物的代谢通路异常，导致疫病的发生。目前发现PRPS1的突变与疾 病相关，如非综合症型遗传性感音神经性耳聋（X _linked nonsyndromic sensorineural deafness, DFN2)、进行性神经病性肌萎缩综合症（X_linked Charcot-Marie-Tooth disease-5, CMTX5)等。PRPS1 突变有功能获得性突变（Gain of function)，如 D183H、 A190V、D52H 等，也有功能缺失性突变（Reduced function)，如 A87T、M115T、I290T 等。但 到目前为止在肿瘤中PRPS1还没有发现突变。

【发明内容】

[0005] 本发明所解决的技术问题：针对现在儿童ALL的耐药复发检测与治疗手段的较为 缺乏的问题，本发明提供了一组急性淋巴细胞白血病耐药复发相关突变基因群及其在评估 儿童ALL耐药复发风险中的应用。本发明对后续临床的复发早期的基因诊断和个体化治疗 有重要的指导意义。
[0006] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0007] ( -）本发明提供了 PRPS1作为急性淋巴细胞白血病耐药复发的基因标志物的用 途。
[0008] 本发明还提供了一种PRPS1突变体，所述PRPS1突变体的氨基酸序列是序列表中 SEQ ID No. 2所示的序列中下述位点发生氨基酸的替换突变后形成，所述替换为：第103位 丝氨酸替换为苏氨酸、第103位丝氨酸替换为天冬酰胺、第144位天冬酰胺替换为丝氨酸、 第176位赖氨酸替换为天冬酰胺、第183位天冬氨酸替换为谷氨酸、第190位丙氨酸替换为 苏氨酸、第191位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第303位苏氨酸替换为丝氨酸、第53位缬氨酸替 换为丙氨酸、第72位异亮氨酸替换为缬氨酸、第77位半胱氨酸替换为丝氨酸、第139位天 冬氨酸替换为甘氨酸、第311位酪氨酸替换为半胱氨酸、第103位丝氨酸替换为异亮氨酸、 第114位天冬酰胺替换为天冬氨酸或第174位甘氨酸替换为谷氨酸。所述第103位丝氨 酸替换为苏氨酸的突变体在本发明中被表示为S103T，其他突变体的表达方式与此相同，依 次为 S103N、N144S、K176N、L191F、D183E、A190T、T303S、V53A、I72V、C77S、D139G、Y311C、 S103I、N114D 或 G174E。
[0009] 本发明提供一种PRPS1突变基因，所述突变基因编码上述氨基酸序列的PRPS1突 变体。
[0010] 本发明中，所述的PRPS1突变基因，可以如本领域常规，由于碱基的简并性，只要 能够编码上述氨基酸序列的PRPS1突变体即可。所述突变基因的DNA序列较佳地为如序列 表SEQ ID No. 1所示的序列中下述位点发生核苷酸的替换突变后形成，所述替换为：第308 位G替换为C、第308位G替换为A、第431位A替换为G、第528位G替换为C、第549位C 替换为G、第568位G替换为A、第573位G替换为C、第908位C替换为G、第158位T替换 为C、第214位A替换为G、第230位G替换为C、第416位A替换为G、第932位A替换为G、 第308位G替换为T、第340位A替换为G或第521位G替换为A。
[0011] 所述第308位G替换为C在本发明中表示为G308C，其他替换与此类似，分别为 G308A、A431G、G528C、C549G、G568A、G573C、C908G、T158C、A214G、G230C、A416G、A932G、 G308T、A340G 或 G521A。
[0012] 本发明提供一种包含如本发明所述PRPS1突变基因的重组载体。所述重组载体为 本领域常规，较佳地为能表达所述PRPS1突变基因的原核表达载体或真核表达载体，更佳 地为能表达所述PRPS1突变基因的慢病毒表达载体，最佳地为GV303慢病毒表达载体（吉 凯基因）。所述真核表达载体的制备方法为本领域常规，较佳地为通过下述方法制得：将慢 病毒表达载体用限制性内切酶线性化，通过clontech公司的In_Fusion?PCR Cloning Kit 试剂盒将将PCR扩增PRPS1突变基因所得的产物交换入所述线性化的慢病毒载体，通过大 肠杆菌T0P10扩增重组子，形成含有本发明PRPS1突变基因的重组载体。
[0013] 本发明提供一种包含所述重组载体的转化体。所述转化体为本领域常规，只要 能满足重组载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的PRPS1突变基因可被有效表达 即可，较佳地为表达本发明PRPS1突变基因的原核细胞或真核细胞，更佳地为表达本发明 PRPS1突变基因的真核细胞，最佳地为表达本发明PRPS1突变基因的Reh细胞系；所述转化 体的制备方法为本领域常规，较佳地为使用表达本发明PRPS1突变基因的慢病毒载体包装 成为慢病毒后感染所述真核细胞制得，最佳地为使用表达本发明PRPS1突变基因的慢病毒 载体GV303 (吉凯基因）与病毒包装的辅助质粒共转HEK293T细胞系包装成慢病毒后感染 真核细胞Reh，再经流式细胞仪分选绿色荧光阳性的细胞制得。
[0014] (二）本发明还提供了一组评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的PRPS1突变 体群，所述PRPS1突变体群包括以下PRPS1突变体：其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2 所示的序列中第103位丝氨酸替换为苏氨酸、第103位丝氨酸替换为天冬酰胺、第144位天 冬酰胺替换为丝氨酸、第176位赖氨酸替换为天冬酰胺、第183位天冬氨酸替换为谷氨酸、 第190位丙氨酸替换为苏氨酸、第191位亮氨酸替换为苯丙氨酸或第303位苏氨酸替换为 丝氨酸，即 S103T、S103N、N144S、K176N、L191F、D183E、A190T 或 T303S。
[0015] 所述突变体群较佳地还可以包括以下PRPS1突变体中的一种或多种：其氨基酸序 列如序列表中SEQ ID No. 2所示的序列中第53位缬氨酸替换为丙氨酸、第72位异亮氨酸 替换为缬氨酸、第77位半胱氨酸替换为丝氨酸、第139位天冬氨酸替换为甘氨酸、第311位 酪氨酸替换为半胱氨酸、第103位丝氨酸替换为异亮氨酸、第114位天冬酰胺替换为天冬氨 酸、第174位甘氨酸替换为谷氨酸或第190位甘氨酸替换为缬氨酸。即V53A、I72V、C77S、 D139G、Y311C、S103I、N114D、G174E 或 A190V。
[0016] 本发明提供了一组评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的PRPS1突变基因群， 所述PRPS1突变基因群包括以下PRPS1突变基因：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1 所示的序列中第308位G替换为C、第308位G替换为A、第431位A替换为G、第528位G 替换为C、第549位C替换为G、第568位G替换为A、第573位G替换为C或第908位C替 换为 G。即 G308C、G308A、A431G、G528C、C549G、G568A、G573C 或 C908G。
[0017] 所述突变基因群较佳地还可以包括以下PRPS1突变基因中的一种或多种：其核苷 酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的序列中第158位T替换为C、第214位A替换为G、 第230位G替换为C、第416位A替换为G、第932位A替换为G、第308位G替换为T、第 340位A替换为G、第521位G替换为A或第569位C替换为T。即T158C、A214G、G230C、 A416G、A932G、G308T、A340G、G521A 或 C569T。
[0018] 本发明提供了一种评估ALL耐药复发风险的试剂盒，所述试剂盒包括检测本发明 所述突变基因群中的PRPS1突变基因的试剂和使用说明书。
[0019] 所述试剂可为本领域常规的任何检测PRPS1突变基因的试剂，较佳地包括扩增 PRPS1基因各外显子的引物、DNA聚合酶、dNTP或缓冲液中的一种或多种。
[0020] 所述扩增PRPS1基因各外显子的引物是本领域常规的可扩增PRPS1基因各外显子 的引物，较佳地其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0. 3~SEQ ID N0. 16中任一项所示。
[0021] 所述检测试剂盒较佳地还可以包括提取细胞或组织样本DNA的试剂、所述提取细 胞或组织样本DNA的试剂为本领域常规，较佳地为蛋白酶、饱和酚、体积比为24 :1的氯仿和 异戊醇混合液、醋酸钠、无水乙醇、70%乙醇和TE溶液，所述百分比为体积百分比，更佳地 为Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒。
[0022] 所述DNA聚合酶为本领域常规，较佳地为Τ0Υ0Β0公司生产的KOD-Plus DNA聚合 酶。
[0023] 所述dNTP为本领域常规，较佳地为dATP、dGTP、dCTP和dTTP四种的混合物。
[0024] 所述缓冲液为与所述DNA聚合酶相配套的缓冲体系，较佳地为Τ0Υ0Β0公司生产的 KOD-Plus DNA聚合酶缓冲液。
[0025] 所述使用说明书记载着试剂盒的使用步骤，较佳的所述使用说明书记载的内容包 括以下步骤：：
[0026] (1)抽提样本基因组DNA ;
[0027] (2)检测步骤⑴所得的样本基因组DNA中的PRPS1突变基因。
[0028] 步骤（2)中，所述检测步骤（1)所得的样本基因组DNA中的PRPS1突变基因的方 法为本领域常规，较佳地以步骤（1)所得的样本基因组DNA为模板PCR扩增PRPS1基因各 外显子，将扩增片段测序。
[0029] 所述使用说明书较佳地还可以包括步骤（3):检测到样本基因组DNA中存在所述 PRPS1突变基因群中的任意一种或多种PRPS1突变基因，则该样本有急性淋巴细胞白血病 耐药复发的风险。若存在所述的PRPS1突变基因，则认为样本有耐药复发的风险。
[0030] 本发明提供了一种评估病人ALL耐药复发风险的检测方法，包括下述步骤：
[0031] (1)抽提样本基因组DNA ;
[0032] (2)检测步骤⑴所得的样本基因组DNA中的PRPS1突变基因。
[0033] 步骤（1)中，所述样本为本领域常规，较佳地为待检病人的骨髓来源或外周血来 源的肿瘤细胞或体外培养的永生化细胞系。
[0034] 步骤（1)中，所述抽提样本基因组DNA为本领域常规，较佳地为使用Qiagen公司 生产的DNA抽提试剂盒抽提。
[0035] 步骤（2)中，所述检测步骤（1)所得的样本基因组DNA中的PRPS1突变基因的方 法为本领域常规，较佳地包括：以步骤（1)所得的样本基因组DNA为模板PCR扩增PRPS1基 因各外显子，将扩增片段测序。所述PCR扩增为本领域常规，较佳地为使用下述条件进行扩 增：
[0036] PCR具体体系：
[0037]
[0038] PCR具体反应程序：
[0039]
[0040] 所述测序为本领域常规，较佳地为一代测序或二代测序。
[0041] 所述检测方法较佳地还可以包括步骤（3):检测到样本基因组DNA中存在所述 PRPS1突变基因群中的任意一种或多种PRPS1突变基因，则该样本有急性淋巴细胞白血病 耐药复发的风险。
[0042](三）本发明提供了一种评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒，其包 括：检测所述PRPS1突变体群中的PRPS1突变体的试剂和使用说明书。
[0043] 所述试剂为本领域常规，较佳地为检测PRPS1突变体酶活性的试剂，更佳地为包 括用放射性同位素碳原子标记的葡萄糖和PRPP。
[0044] 所述放射性同位素碳原子标记的葡萄糖为本领域常规，较佳地为用同位素13C标 记的葡萄糖，所述PRPP为本领域常规，较佳地为购自Sigma公司的PRPP。
[0045] 所述试剂盒较佳地还可包括细胞裂解试剂，所述细胞裂解试剂为本领域常规，较 佳地为80%甲醇，所述百分比为体积百分比。
[0046] 所述试剂盒较佳地还可包括无葡萄糖培养基，所述无葡萄糖培养基为本领域常 规，较佳地为购自Gibco公司的无葡萄糖培养基。
[0047] 所述使用说明书记载了试剂盒的使用说明，记载的内容较佳的包括以下步骤：
[0048] (1)裂解样本细胞；
[0049] (2)检测步骤⑴所得的细胞裂解液中的PRPS1突变体。
[0050] 其中，步骤（1)所述裂解样本细胞是本领域常规的。步骤（2)所述检测步骤（1) 所得的细胞裂解液中的PRPS1突变体的方法是本领域常规，较佳地是检测PRPS1的酶活性。 所述使用说明书记载的内容较佳的还包括步骤（3):检测到样本中存在酶活性高于野生型 PRPS1的PRPS1突变体，则该样本有急性淋巴细胞白血病耐药复发的风险。所述PRPS1突变 体较佳地为（二）中所述PRPS1突变体群中的任意一种或多种。
[0051] 本发明提供了一种通过检测PRPS1酶活性来评估儿童ALL耐药复发风险的方法， 所述方法包括下述步骤：
[0052] (1)裂解样本细胞；
[0053] (2)检测步骤⑴所得的细胞裂解液中的PRPS1突变体。
[0054] 较佳的，所述方法包括下述步骤：
[0055] (a)分离ALL病人的白血病细胞；
[0056] (b)培养步骤⑴中所述白血病细胞；
[0057] (c)用化疗药物处理步骤（2)所述白血病细胞；
[0058] (d)收集步骤⑶所述白血病细胞，裂解；
[0059] (e) LC-MS 检测 PRPP 含量。
[0060] 步骤（c)中，所述化疗药物为本领域常规，较佳地为嘌呤类似物类化疗药物，更佳 地为6-MP或6-TG。
[0061] 步骤（d)中，所述裂解为本领域常规，较佳地为使用80%甲醇裂解。
[0062] 步骤（e)中，所述检测为本领域常规，较佳地为使用LC-MS检测PRPP含量。
[0063] (四）本发明提供了一种检测治疗或预防儿童ALL耐药复发的药物活性的方法，其 包括以下步骤：
[0064] (1)使化合物与含所述PRPS1突变基因群中的任何一种PRPS1突变基因的白血病 细胞接触，得预处理的白血病细胞；
[0065] (2)使抗白血病的化疗药物与步骤（1)所得的预处理的白血病细胞接触。
[0066] 所述方法较佳地还可以包括步骤（3)，步骤（3)包括：检测步骤（2)中所得的细胞 的存活率。
[0067] 本发明提供了一种筛选治疗或预防儿童急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物的 方法，其包括下述步骤：
[0068] (1)使候选化合物与含所述PRPS1突变基因群中的任何一种PRPS1突变基因的白 血病细胞接触，得预处理的白血病细胞；
[0069] (2)使抗白血病的化疗药物与步骤（1)所得的预处理的白血病细胞接触。
[0070] 本发明中，步骤（1)所述表达本发明PRPS1突变基因的白血病细胞为本领域常规， 较佳地为人源细胞，更佳地为人源淋巴细胞，最佳地为Reh细胞或Jurkat细胞。所述候选 化合物为本领域常规，较佳的为现有的化合物、天然产物或核酸类药物，更佳地为靶向嘌呤 合成途径的化合物、天然产物或核酸类药物；所述候选化合物为具有潜在的逆转ALL耐药 复发的效果的药物。
[0071 ] 所述接触为本领域常规，较佳地为使所述候选化合物能够直接接触所述的白血病 细胞，更佳地为将所述候选化合物直接加到所述白血病细胞的培养基中。
[0072] 本发明中，步骤（2)所述处理为本领域常规，较佳地为使所述化疗药物能够直接 接触所述的白血病细胞，更佳地为将所述化疗药物直接加到所述白血病细胞的培养基中。 所述化疗药物较佳地为嘌呤类药物，所述嘌呤类药物较佳的为6-MP或6-TG。
[0073] 较佳的，步骤（1)中还同时不采用候选化合物与含如权利要求9或10所述PRPS1 突变基因群中的任何一种PRPS1突变基因的白血病细胞接触，作为对照。
[0074] 本发明中，较佳的还包括步骤（3)，即检测步骤（2)所得的细胞的存活率。步骤（3) 所述检测的方法为本领域常规，较佳地为使用活细胞染料染色后计数法、MTT法或通过测量 荧光素酶与存活细胞内的ATP结合后发出荧光强度的方法，更佳地为使用市售可得的商品 化检测试剂盒来检测，如Promega公司的Cell Titer-Glo试剂。
[0075] 较佳的，步骤（3)同时检测步骤（2)中所述对照中的细胞的存活率。对存活率进 行比较，如果测试细胞的存活率明显低于对照细胞，可被认为待检测药物具有逆转ALL耐 药复发的活性。
[0076] 本发明中，所述"耐药复发"是指急性淋巴细胞白血病病人在恢复期对化疗药物的 治疗产生耐药性，所述化疗药物为本领域常规，较佳地为嘌呤类化疗药物，更佳地为6-巯 基嘌呤（6-MP)或6-巯鸟嘌呤（6-TG)。
[0077] 所述"预防"是指在可能存在所述耐药复发的情况下，使用后防止或降低所述耐药 复发的发生。
[0078] 所述"治疗"是指减轻所述耐药复发的程度，或者治愈所述耐药复发使急性淋巴细 胞白血病病人恢复正常，或者减缓所述耐药复发的进程。
[0079] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0080] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0081] 本发明的积极进步效果在于：本发明针对现有的以核苷类似物为化疗药物在治疗 急性淋巴细胞白血病会出现耐药性复发的问题，提供了急性淋巴细胞白血病耐药复发相关 的突变基因，为治疗ALL耐药复发提供了新的靶点，根据所述突变基因得到的评估ALL耐药 复发风险的试剂盒可以实现对儿童急性淋巴细胞白血病耐药复发的风险评估，为预防和治 疗儿童ALL耐药性复发提供了有力的技术手段和支持。
【附图说明】
[0082] 图1 :超深度测序发现PRPS1为复发特异性突变且突变比例在临床复发前迅速增 加。
[0083] 图2 :PRPS1突变蛋白结构示意图。
[0084] 图3 :pET28a载体图谱。
[0085] 图4 :纯化得到的PRPS1野生型及各突变体SDS-PAGE电泳结果。
[0086] 图5 :PCR扩增得到PRPS1野生型琼脂糖凝胶电泳结果。
[0087] 图6 :表达PRPS1野生型及各突变体的稳定Reh细胞系Western结果。
[0088] 图7 :表达PRPS1野生型及各突变体的稳定Reh细胞系对6-MP和6-TG的药物敏 感性结果。
[0089] 图8 :表达PRPS1野生型及各突变体的稳定Reh细胞系对6-MP和6-TG的细胞凋 亡结果。
[0090] 图9 :细胞内化疗药物6-MP/6-TG的代谢产物检测结果。
[0091] 图10 :表达PRPS1野生型及各突变体的PRPS1酶活性检测结果。
[0092] 图11 :ADP和⑶P对PRPS1反馈调节路径示意。
[0093] 图12 :GDP/ADP对PRPS1蛋白活性的抑制的效果。
[0094] 图13 :细胞内嘌呤代谢途径产物含量测定结果。
[0095] 图14 :靶向嘌呤合成途径的核酸药物对PRPS1S103T与A190T突变体耐药性的抑 制作用。
[0096] 图15 :外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的药物耐受。
[0097] 图16 :外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的代谢。
[0098] 图17 :次黄嘌呤竞争性抑制化疗药物6-MP的反应。
[0099] 图18 :洛美曲沙（Lometrexol)逆转PRPS1基因突变导致的6-MP药物耐受。
【具体实施方式】
[0100] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0101] 本发明通过全外显子组测序技术，对16组儿童ALL的初发、缓解和复发样本测序， 发现噪呤合成限速酶PRPSl(Phosphoribosyl pyrophosphate synthase I)基因存在多个 位点的复发特异性突变，在初发与缓解样本中均为野生型。通过进一步对144例复发样本 进行了 PRPS1测序，又发现16例复发样本中出现了 PRPS1基因的突变，在B-ALL中突变频 率为 13% (18/138)。同时德国的夏里特医学院（Charit6-Universil^tsniedizin Berlin) 儿童血液肿瘤中心的Renate Kirschner-Schwarb博士的研究也证实了在德国儿童ALL中 PRPS1存在复发特异性突变，突变比例为2. 7% (6/220)。针对所有突变中最主要的四类突 变A190T、T303S、K176N和N144S，通过对一系列骨髓样本的超深度测序发现，所有的样本中 的病人在诊断期在超深度测序的分辨率范围内均未出现上述突变。此外，这些PRPS1的突 变在临床复发期之前被发现呈指数增长，如图1所示。在PRPS1野生型的ALL细胞系Reh 中过表达所述PRPS1的突变体，通过药物敏感性实验发现，复发性特异的PRPS1基因突变使 Reh对6-MP/6-TG产生了耐药，证明PRPS1基因突变在儿童ALL耐药复发过程中具有重要的 作用。
[0102] 本发明结合细胞生物学、分子生物学、代谢组学等方法，从PRPS1基因突变对自身 酶活性的影响，以及对6-MP药物代谢和嘌呤代谢网络的影响等方面系统地研究PRPS1基 因突变介导儿童ALL耐药复发的机制。研究揭示了儿童ALL -种新的耐药复发机制，提示 PRPS1突变可以驱动复发，是一个耐药复发的基因标志物，并对后续临床的复发早期的基因 诊断和个体化治疗有重要的指导意义。
[0103] 以下实施例中所涉及的D183H突变体为已报道过的PRPS1基因的功能获得性突 变体；所涉及的A87T与M115T突变体为已报道的功能缺失性突变体，它们分别作为检验实 验检测的体系是否正常的正对照与负对照。所涉及的S103T、S103N、N144S、T303S、K176N、 D183E、A190T、A190V和L191F为实验组，这些突变体通过比对人PRPS1的晶体结构可以被 分为两类，即位于PRPS1二聚体形成界面的突变位点与位于PRPS1变构位点的突变位点，如 图2所示。组内的突变体为PRPS1基因的耐药突变体。
[0104] 实施例1
[0105] 检测样本中的PRPS1基因突变：
[0106] 通过全外显子组测序技术，对16组儿童ALL的初发、缓解和复发样本及144例复 发样本进行了 PRPS1的测序。
[0107] 样品的质控：样品质量直接关系到测序结果的可靠性，通过以下三种方法保证用 于深度测序和后续验证样本的质量：①白血病初发和复发时其骨髓中的白血病细胞可占全 部有核细胞的90%以上，通过Ficoll密度梯度离心可以去除残余的正常粒细胞和有核红 细胞，从而可以得到高纯度的白血病细胞用于后续的DNA抽提和测序；②通过多色荧光抗 体组合可以区分白血病细胞和正常骨髓造血细胞，对于个别纯度较低的样品可通过流式细 胞技术分选得到高纯度（>99% )的样品；③根据微量残留病检测结果，选择残留白血病细 胞低于0. 01 %的缓解期样本用于深度测序，从而可以保证初发和复发特异性突变的可靠 性。
[0108] 样品的制备：通过QIAGEN Blood DNA kit进行白血病细胞基因组DNA的抽提， Q-bit荧光定量试剂盒进行DNA浓度测定，将高纯度基因组DNA用于后期的深度测序。
[0109] PRPS1各外显子的扩增：针对PRPS1基因组序列设计合适的引物进行PRPS1各外 显子的扩增，所述PCR体系与程序如下所示：
[0110] PCR具体体系：
[0111] 10XKOD 缓冲液：2μ1
[0112] 2 inM DNTP : 2ul 25 mM MgS〇4： 0.8 μL 正向引物(lOpmol) :0.5μ1 反向引物(1 Opmol) .::0.5 μL 基因组DNA模板：Uil(50ng) 无菌水：1.2.7 μL KOD-PLUS 聚合酶：0·5μ1
[0113] PCR具体反应程序：
[0114] 95Γ 10分钟预变性 95 °C 10秒变性 55 °C 30秒退火 68°C 15秒延伸 68°C 10分钟
[0115] 引物序列如表1所示，PCR产物按常规进行毛细管电泳测序和突变分析，突变分析 使用软件为 Mutation Surveyor。
[0116] 测序分析：PCR成功后将目的条带测序，将目的序列与NCBI中的PRPS1基因序列 进行比对，分析PRPS1的基因突变情况。实验结果见表2与表3。
[0117] 通过对16组儿童ALL的初发、缓解和复发样本测序，发现嘌呤合成限速酶 PRPSl(Phosphoribosyl pyrophosphate synthase I)基因存在多个位点的复发特异性突 变（见表2)，在初发与缓解样本中均为野生型。通过对144例复发样本进行了 PRPS1测 序，又发现16例复发样本中出现了 PRPS1基因的突变，突变频率为13% (18/138)。同时德 国的夏里特医学院（Charit6-Universitiii:smedizin Berlin)儿童血液肿瘤中心的Renate Kirschner-Schwarb博士的研究也证实了本发明的结果，在德国儿童ALL中PRPS1存在复发 特异性突变，突变比例为2. 7% (6/220)(见表2)。结合临床病理学分析显示，存在PRPS1 基因突变的病人均为早期复发（P〈〇. 005)(见表3)。超深度测序发现PRPS1为复发特异性 突变且突变比例在临床复发前迅速增加。意味着PRPS1驱动了病人的耐药复发，可以作为 临床复发诊断的基因标志物以及临床复发治疗的一个重要靶点。
[0118] 表1 PCR扩增外显子信息
[0119]
[0120] 表2中国和德国儿童B-ALL复发样本中的PRPS1突变
[0121]
[0123] 通过全外显子组测序技术对儿童ALL初发、缓解、复发骨髓样本进行测序， 发现了 18例病人复发样本中存在PRPS1基因突变，突变频率为13% (18/138)，如 表2所示。其中有9例复发样本中均为A190T的位点突变。通过与德国的夏里 特医学院（Charit6- Universitiitsmedizin Berlin)儿童血液肿瘤中心的 Renate Kirschner-Schwarb博士合作也证实了在德国儿童ALL中PRPS1存在复发特异性突变，突变 比例为 2. 7% (6/220)。
[0124] 表3中国和德国B-ALL患儿中PRPS1突变与临床特征的关系
[0125]

[0128] 中值用Fisher精确检验计算得到。
[0129] 2P值用卡平方检验计算得到。
[0130] $复发时间：较早期，诊断后的18个月之内；早期，诊断后的18个月与36个月 之间；后期，初次治疗后的36个月之后。
[0131] 如表3所示，通过临床病理学资料，分析发现PRPS1突变都发生在早期复发病人中 (中国病人，P〈〇. 005,德国病人，P〈0. 001)，预示具有缓解期诊断复发意义。
[0132] 实施例2
[0133] 检测样本中的嘌呤代谢途径相关基因的突变
[0134] 通过常规的二代测序技术，在160例儿童ALL复发样本中进行了嘌呤代谢相关酶 HGPRT、頂PDH、NT5C2、PRPS2、ATIC、ADSL、GART、PFAS 的测序。
[0135] 样品的质控、制备、基因外显子的扩增同实施例1
[0136] 测序分析：PCR成功后将目的条带测序，将目的序列与NCBI中对应的基因序列进 行比对，分析基因突变情况。如果复发样本中发现了基因突变，检测同一病人的初发样本， 确定是否是复发特异性突变。实验结果见表4。
[0137] 通过测序与序列比对发现，嘌呤代谢相关酶PRPS2、ATIC、ADSL、GART、PFAS均存在 复发特异性突变。
[0138] 表4嘌呤代谢相关酶在儿童ALL复发样本中的突变

[0143] 1.目的基因片段的获取：根据NCBI提供的PRPSl(gene ID:5631，NM002764)序 列，设计野生型PRPS1的PCR引物序列，正向引物：5' cgcggcagccatATGCCGAATATCAAAATCTT CAG 3'，反向引物：5'gtggtggtgctcgagTTATAAAGGGACATGGCTGAATAGGTA3'（引物说明：含交 换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5'端部分序列用于PCR钓取目的基因）。以提取 的Reh细胞的cDNA为模板，PCR钓取PRPS1，PCR产物大小为957bp，产物序列如序列表SEQ ID No. 1 所示。
[0144] 2.原核表达载体的线性化：用限制性内切酶Ndel/Xhol处理pET28a载体，pET28a 载体图谱如图3所示。
[0145] 3.重组质粒构建：通过clontech公司的In_Fusion?PCR Cloning Kit试剂盒将 第1步的PCR产物交换入线性化病毒载体中，通过大肠杆菌T0P10扩增重组子。
[0146] 4.鉴定重组质粒：通过测序验证重组子是否构建成功。
[0147] 5. PRPS1突变原核载体的构建：以pET28a-PRPSl为质粒模板，通过Τ0Υ0Β0公司的 KOD-Plus DNA聚合酶进行环状PCR分别构建PRPS1的9个突变体：S103T、S103N、N144S、 T303S、K176N、D183E、A190T、A190V 和 L191F，PCR 引物见表 5。
[0148] PCR具体体系：
[0149] 10XKOD 缓冲液：2μ1 2 mM dNTP : 2μ1 25 iTiM MgS04: 0.8 μΙ 正向引物(lOpmol) :0.5μ1 反向引物(lOpmol) :0.5 μΙ GV303-PRPS1 质粒模板：1 μL ClOng) 无菌水：12.7 μL
[0150] KOD-PLUS 聚合酶：0·5μ1
[0151] PCR具体反应程序：
[0152] 95 °C 10分钟预变性 95 °C 10秒变性 55 °C 30秒退火 68°C 3分钟延伸（30秒/Kb) 30个循环 68°C 10分钟
[0153] PCR产物加入1 μ 1 Dpnl酶37°C水浴1小时消化质粒模板后，取10 μ 1加入大肠 杆菌T0P10中扩增。转化子经测序验证突变体是否构建成功。
[0154] 实施例4
[0155] PRPS1原核蛋白的纯化
[0156] 1. pET28a_PRPSl系列质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)
[0157] ①取1 μ 1 pET28a-PRPSl系列质粒与100 μ 1 BL21 (DE3)大肠杆菌感受态细胞混 匀，冰上放置30分钟，水浴42°C，90秒，勿摇动，立即置冰上冷却2分钟，加入900 μ 1 S0C 培养基，37°C，170转/分，振荡1小时.
[0158] ②将1ml已转化的感受态细胞，涂在含50 μ g/ml卡那霉素的半固体LB琼脂培养 皿中倒置平皿培养16小时，出现菌落，拟挑出长势良好的阳性克隆做进一步实验。
[0159] 2.小量表达测试：
[0160] ①从上述pET28a-PRPSl系列转化平板中，挑取单克隆到3ml LB (含抗生素）中， 37°C，220rpm振荡培养10~12小时。
[0161] ②次日以1:100接菌，即取50μ1菌液到5ml LB(含抗生素）中，37°C，220rpm振 荡培养2~3小时至0D值达到0. 6。
[0162] ③对照取样：取2ml菌液，12000rpm离心1分钟，弃尽上清，菌体沉淀中加入 lml PBS溶液，超声破碎（200w，超声3秒，间歇5秒，20循环），加入SDS-PAGE Loading Buffer (还原，4x), 100°C，水浴10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，-20°C保存，做为 诱导前对照。
[0163] ④剩余3ml菌液中，加诱导剂IPTG至终浓度为ImM，16°C，220rpm振荡培养16小 时后，12000rpm离心1分钟，弃尽上清收菌，超声破碎处理取样，-20°C保存。
[0164] ⑤对上述样品进行SDS-PAGE电泳鉴定表达结果。
[0165] 3.PRPS1 大量表达：
[0166] @挑单克隆到10〇11111^(含5(^8/1111卡那霉素抗生素）中，37°(：，220印111振荡培 养10~12小时。
[0167] ②扩大培养：以1:100接菌，即各取上述20ml菌液接到2L LB培养基中（含终浓 度50 μ g/ml卡那霉素抗生素）中，37°C，220rpm振荡培养4~5小时至0D值达到0. 6-0. 8。
[0168] ③对照取样：取2ml菌液，12000rpm离心1分钟，弃尽上清，菌体沉淀中加入 lml PBS溶液，超声破碎（200w，超声3秒，间歇5秒，20循环），加入SDS-PAGE Loading Buffer (还原，4x), 100°C，水浴10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，-20°C保存，做为 诱导前对照。
[0169] ④其余菌液于16°C，220rpm继续振荡培养1小时后，加 IPTG至终浓度ImM，16°C， 220rpm振荡培养12小时后收菌：6000rpm、4°C离心10分钟，弃尽上清，取5ml做表达鉴定 (16°C样品），其余-80°C保存。
[0170] ⑤超声破碎分别处理上述PRPS1系列样品，进行SDS-PAGE电泳鉴定。（同小量表 达中的5)
[0171] 4. PRPS1蛋白纯化：分别取超声破碎好的菌液，通过AKTA-purifier系统的镍柱纯 化PRPS1的系列蛋白，通过SDS-PAGE电泳鉴定PRPS1系列蛋白的表达以及纯度，通过碧云 天公司的BCA蛋白定量试剂盒对PRPS1系列蛋白进行定量，得到氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的野生型PRPS1蛋白，如图4所示。
[0172] 实施例5
[0173] PRPS1突变基因真核表达载体的制备
[0174] 1.目的基因片段的获取：根据NCBI提供的PRPSl(gene ID:5631，NM002764)序列， 设计野生型 PRPS1 的 PCR 引物序列，正向引物：5' GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGCCGAA TATCAAAATC 3 '，反向引物：5 ' TCCTTGTAGTCCATACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTAAAG3 '，引 物含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5'端部分序列用于PCR钓取目的基因。以 pET-28a-PRPSl为质粒模板，PCR钓取PRPS1，PCR产物大小为1022bp，如图5所示。
[0175] PCR 体系：
[0176] 10XK.OD 缓冲液 ；2μ1 2mMdNTP : 2μ1 25 mM MgSO；； : 0 8 μL 正向引物(lOpmol) : 0,5 μL J乂向引物(丨 Opmol) ： 0 5 μL 旗鱗. j 1 μL C1 Ong) 无菌水 ：12.7 μL KOD-PLUS:聚合酶::0.5 μ1
[0177] PCR反应程序：
[0178] 95 °C 10分钟预变性 95 °C 10秒变性 55 °C 30秒退火 68°C 6分钟延伸（30秒/Kb) 30个循环 68°C 10分钟
[0179] PCR产物加入1 μ 1 Dpnl酶37°C水浴1小时消化质粒模板后，取10 μ 1加入大肠 杆菌Τ0Ρ10中扩增。转化子经测序验证突变体是否构建成功。
[0180] 2.病毒表达载体的线性化：用限制性内切酶Agel处理GV303病毒载体（吉凯基 因）。
[0181] 3.重组质粒构建：通过clontech公司的In_Fusion?PCR Cloning Kit试剂盒按 照说明书将第1步的PCR产物交换入线性化病毒载体中，通过大肠杆菌T0P10扩增重组子 GV303-PRPS1。
[0182] 4.酶切鉴定重组质粒：经过限制性内切酶Hind III鉴定重组子是否正确，若产生 354bp的酶切片段则为阳性重组子。
[0183] 5. PRPS1突变质粒的构建：以所述GV303-PRPS1为质粒模板，通过Τ0Υ0Β0公司 的KOD-Plus DNA聚合酶进行环状PCR分别构建PRPS1的9个突变体慢病毒表达载体： GV303-PRPS1-S103T、GV303-PRPS1-S103N、GV303-PRPS卜N144S、GV303-PRPS卜T303S、 GV303-PRPS1-K176N、GV303-PRPS1-D183E、GV303-PRPS1-A190T、GV303-PRPS1-A190V 和 GV303-PRPS1-L191F，PCR 引物见表 5。
[0184] 表5 PRPS1突变体PCR引物序列表
[0187] 实施例6
[0188] 表达PRPS1突变基因的Reh细胞的制备
[0189] 病毒制备
[0190] 1.转染前24小时将HEK293T细胞种到10cm皿中，第二天当细胞密度达到50%~ 80 %时，开始转染。
[0191] 2·配制 DNA-Opti-MEM 和 Fugene-6_Opti-MEM 混合液（一皿细胞）：
[0192] 表 6
[0193]
[0194] Promega公司的转染试剂Fugene-6和Opti-MEM混合后，静置5分钟； DNA-Opti-MEM 和 Fugene-6-Opti-MEM 混合后，静置 15 分钟；
[0195] 3.混合液静置过程中，从培养箱中取出需转染的HEK293T细胞培养皿，换新鲜的 无抗生素培养基。
[0196] 4.混合液静置15min后，加233 μ 1/皿混合液至HEK293T细胞的培养皿中，"十" 字形上下左右混匀培养液5次。
[0197] 5. 37°C，5% C02条件下培养，24小时后换液，15ml/皿加新鲜培养液，继续培养72 小时后，收集含病毒的培养液。
[0198] 6.将收集的病毒上清液加入Amicon Ultra-15100KD的超滤管，4°C离心30分钟， 得到浓缩后的病毒液。
[0199] 7.将得到的病毒液进行梯度稀释后感染HEK293T细胞，并根据感染后绿色荧光的 细胞数量计算病毒的滴度。
[0200] 病毒感染
[0201] 1.细胞接种：将Reh细胞计数后接种到12孔板中，每孔接种3 X 105个细胞。
[0202] 2.每孔加入浓缩后的病毒上清（Μ0Ι = 10)，同时加入终浓度为8 μ g/ml的聚凝胺 (polybrene)，将细胞放入培养箱继续培养24小时后，换成新鲜的完全培养基。48小时后即 可在显微镜下观察荧光。
[0203] 3.流式分选细胞：病毒感染72小时后，将细胞通过Beckman公司的流式细胞仪 Moflo XDP分选出有绿色荧光的Reh细胞，扩大培养。
[0204] 4.收集分选后的Reh细胞，通过Western blot检测PRPS1野生型与突变 型的表达，验证稳定细胞系是否构建成功。实验结果见图6,共获得以下九个稳定细 胞系：Reh-PRPS1-S103T、Reh-PRPS1-S103N、Reh-PRPSl-N144S、Reh-PRPSl-T303S、 Reh-PRPS卜K176N、 Reh-PRPS卜D183E、 Reh-PRPS卜A190T、 Reh-PRPS卜A190V 和 Reh-PRPS1-L191F。
[0205] 实施例7
[0206] 6-MP药物敏感性实验
[0207] Reh细胞是一种人急性B淋巴细胞白血病株。通过检测经化疗药物6-MP处理后表 达不同PRPS1突变基因的Reh细胞的存活率来检测不PRPS1突变体对化疗药物6-MP的敏 感性，步骤如下：
[0208] ①细胞接种：将表达野生型与各类突变体PRPS1的Reh细胞计数后接种到96孔板 中，每孔接种1〇 4个细胞，设置5个复孔；
[0209] ②细胞处理：将药物6-MP进行梯度稀释，起始浓度为100 μ g/ml，依次3倍稀释， 稀释10个梯度，加入铺好细胞的96孔板中，37°C培养72小时；
[0210] ③细胞活性测定：72小时后，每孔中加入50 μ 1 CellTiter-Glo试剂（Promega公 司），室温混匀孵育10分钟，放入酶标仪（Biotek公司）读化学发光值；
[0211] ④计算IC5Q:用Graphpad 5. 0软件计算药物1(：5。值，比较组间差异。
[0212] 实验结果如图7所示。与表达空载的对照相比，实验组各PRPS1突变基因的细胞 IC5。值都有显著上升，证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞在6-MP处理后存活率显著 提高，即耐药性显著增加。
[0213] 实施例8
[0214] 6-TG药物敏感性实验
[0215] 通过检测经化疗药物6-TG处理后表达不同PRPS1突变基因的Reh细胞的存活率 来检测不同PRPS1突变体对化疗药物6-TG的敏感性，步骤如下：
[0216] ①细胞接种：将表达野生型与各类突变体PRPS1的Reh细胞计数后接种到96孔板 中，每孔接种1〇 4个细胞，设置5个复孔；
[0217] ②细胞处理：将药物6-TG进行梯度稀释，起始浓度为100 μ g/ml，依次3倍稀释， 稀释10个梯度，加入铺好细胞的96孔板中，37°C培养72小时；
[0218] ③细胞活性测定：72小时后，每孔中加入50 μ 1 CellTiter-Glo试剂（Promega公 司），室温混匀孵育10分钟，放入酶标仪（Biotek公司）读化学发光值；
[0219] ④计算IC5Q:用Graphpad 5. 0软件计算药物IC5。值，比较组间差异。
[0220] 实验结果如图7所示。与表达空载的对照相比，实验组各PRPS1突变基因的细胞 IC5。值都有显著上升，证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞在6-TG处理后存活率显著 提高，即耐药性显著增加。
[0221] 实施例9
[0222] 细胞凋亡的检测实验
[0223] ①细胞接种：将表达野生型与各类突变体PRPS1的Reh细胞计数后接种到12孔板 中，每孔接种3 X 105个细胞，设置2个复孔；
[0224] ②细胞处理：将药物6-MP或6-TG 10 μ g/ml，加入铺好细胞的12孔板中，37°C培 养72小时；
[0225] ③细胞染色：72小时后，离心收集细胞，用PBS缓冲液冲洗细胞，加入BD公司PE标 记的Annexin-V与7-AAD染料，室温混匀孵育15分钟，离心弃上清，用PBS冲洗2遍；
[0226] ④流式检测：用BD公司的流式细胞仪Canto II上机检测细胞凋亡比例。
[0227] 实验结果如图8所示。与表达空载的对照相比，实验组各PRPS1突变基因的细胞 凋亡比例都有显著下调，证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞在6-MP或6-TG处理后 存活率显著提高，即耐药性显著增加。
[0228] 实施例10
[0229] 检测细胞内化疗药物6-MP/6-TG的代谢产物。
[0230] 6-MP为前药，在发挥作用之前需要先经过体内代谢反应形成??ΜΡ与TGMP，如图9C 所示。检测步骤如下所述：
[0231] ①细胞接种：将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿，每 个皿3X10 6细胞；
[0232] ②细胞处理：每个6cm培养皿中加入10 μ Μ化疗药物6-MP处理4个小时；
[0233] ③收集细胞：将细胞转移到离心管中，3, 000g离心5分钟，弃上清，按照3Χ 106细 胞/200 μ 1 80%甲醇裂解细胞；
[0234] ④ LC-MS (ABI 5500Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测化疗药物 6-MP 的代谢产物 ??ΜΡ, TGMP, r-MP, r-TG, r-MMP 的含量，分别用 ??ΜΡ (Jean Bioscience, cat U-1148)，TGMP(Jean Bioscience，cat#NU-l121)，r-MP(Sigma, cat#852686)，r-TG(Sigma ，cat#858412), r-MMP (Sigma, cat#M4002)做标准曲线定量。
[0235] 实验结果图9所示，对于实验组经过6-MP处理后的各突变体，6-MP的代谢产物 ??ΜΡ、TGMP和r-MP、r-TG、r-MMP在胞内的含量与对照相比都显著减少。
[0236] 实施例11
[0237] PRPS1酶活性的检测
[0238] 本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术，通过同位素标记的方法，检测了 PRPS1在细胞中的活性。【具体实施方式】如下：
[0239] ①细胞培养：将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿，每 个皿3X10 6细胞；
[0240] ②细胞处理：第二天用无葡萄糖培养基（Gibco, cat#11879-020)悬浮细胞，每个 6cm培养皿中加入 10mM 13C6-葡萄糖（Cambridge isotope laboratories, cat#CLM_1396_l) 标记5分钟；
[0241] ③收集细胞：将细胞转移到离心管中，3, OOOg离心5分钟，弃上清，按照3X 106细 胞/200 μ 1 80%甲醇，裂解细胞；
[0242] ④LC-MS (ABI 5500Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测 13C5_PRPP 的 含量，用PRPP(sigma，cat#P8296)做标准曲线定量。
[0243] 实验结果见图10,与表达空载的对照相比，实验组各PRPS1突变基因的催化反应 产物PRPP的浓度值都有显著上升，证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞中PRPS1突变 体酶的活性都有显著地增加。
[0244] 实施例12
[0245] 测定核苷酸ADP、⑶P对PRPS1活性的反馈调节
[0246] 1.体外蛋白水平
[0247] ①建立PRPS1催化的酶学反应，如图11所示，ATP (货号A7699)、ADP (货号A2754)、 ⑶P(货号G7172)、核糖-5-磷酸（货号R7750)购自sigma公司。反应体系为：50mM Tris PH7.5,2mM 磷酸根，ImM DTT，10mM MgC12,0.5mM 核糖-5-磷酸，0.5mM ATP，PRPS1 蛋白。
[0248] ②测定⑶P/ADP对PRPS1蛋白活性的抑制：GDP/ADP起始浓度为5mM，依次做3倍 浓度梯度稀释，配制15 μ L PRPS1体外酶学反应体系加入384孔板，37°C反应30分钟。加 入10 μ 1 Promega公司的Kinase-Glo试剂（货号V3722)终止反应，室温反应15分钟，在 酶标仪中读取化学发光数值。用Graphpad 5. 0计算⑶P/ADP对PRPS1的活性抑制。
[0249] 实验结果见图 12A、B，可见⑶P/ADP 对 PRPS1 突变体 S103T、S103N、N144S、T303S、 K176N、D183E、A190T、A190V、L191F的抑制明显低于PRPS1野生型，而已知的功能缺失性突 变A87T与M115T与野生型无明显差异，即PRPS1的复发特异性突变逃逸了核苷酸⑶P/ADP 对PRPS1活性的负反馈抑制，为功能获得性突变。
[0250] 2.细胞水平
[0251] 本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术，通过同位素标记的方法，检测PRPS1 在细胞中的活性，在此基础上评估核苷酸GDP/ADP对PRPS1活性的影响。【具体实施方式】如 下：
[0252] ①细胞培养：将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿，每 个皿3X10 6细胞；
[0253] ②细胞处理：在培养皿中加入2mM ADP或0. 5mM GDP处理4小时后用无葡萄糖培养 基（Gibco, cat#11879_020)悬浮细胞，每个6cm培养皿中加入10mM 13C6-葡萄糖（Cambridge isotope laboratories, cat#CLM_1396_l)标记 5 分钟；
[0254] ③收集细胞：将细胞转移到离心管中，3, OOOg离心5分钟，弃上清，按照3X 106细 胞/200 μ 1 80%甲醇，裂解细胞；
[0255] ④LC-MS (ABI 5500Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测 13C5_PRPP 的 含量，用PRPP(sigma，cat#P8296)做标准曲线定量。根据PRPP的含量来判定PRPS1酶活性 的变化。
[0256] 实验结果见图12C，表达野生型实验组在加入核苷酸⑶P/ADP后PRPP的浓度有所 下降，实验组各PRPS1突变基因的催化反应产物PRPP的浓度均不受核苷酸⑶P/ADP的影 响，证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞中PRPS1突变体酶的活性不受核苷酸⑶P/ADP 的反馈调节。
[0257] 实施例13
[0258] 嘌呤代谢途径活性的检测
[0259] 本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术，通过同位素标记的方法，检测细胞 中嘌呤从头合成途径与补救合成途径的活性。【具体实施方式】如下：
[0260] ①细胞培养：将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿，每 个皿3X10 6细胞；
[0261] ②细胞处理：第二天用无氨基酸培养基（Gibco定制，cat#ME100031Ll)悬浮细 胞，分别用20 μ g/ml 13C2,15N-甘氨酸（sigma, cat#489522)标记从头合成途径，2 μ M 13C5， 15Ν4-次黄噪呤（Cambridge isotope laboratories, cat#489522)标记补救合成途径，分别 标记4小时与1小时；
[0262] ③收集细胞：将细胞转移到离心管中，3, 000g离心5分钟，弃上清，按照3X 106细 胞/200 μ 1 80%甲醇，裂解细胞；
[0263] ④ LC_MS(ABI 5500Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测 13C2, 15N -次黄嘌呤核苷酸αΜΡ+3)与13C5,15N4次黄嘌呤核苷酸αΜΡ+9)的含量，用 IMP(sigma，cat#I4625)做标准曲线定量。
[0264] 实验结果如图13、图9B和图18所示。实验组中表达各PRPS1基因耐药突变体的 Reh细胞内的13C2,15N-次黄嘌呤核苷酸αΜΡ+3)和 13(：5，15乂次黄嘌呤核苷酸αΜΡ+9)的浓 度和与表达空载与野生型PRPS1基因的Reh细胞相比有显著的上升，即表明嘌呤从头合成 与补救合成两条途径活性均有显著提高。
[0265] 实施例14
[0266] 检测样本中的次黄嘌呤、AICAR以及Inosine的含量
[0267] 本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术，通过LC-MS检测细胞中次黄嘌呤的 含量。【具体实施方式】如下：
[0268] ①细胞培养：将PRPS1的野生型和各类突变体病毒转染人Reh细胞（此处请参见 实施例4)，培养细胞；
[0269] ②细胞计数：当每个反应孔细胞达到5 X 106/5ml时，根据实验所需细胞数量进行 取样；
[0270] ③收集细胞：细胞从孔中吸出，1500rpm离心后弃去上清。PBS洗涤1次，再次离心 (500g)，吸去上清；
[0271] ④细胞裂解：按照3 X 106细胞/200 μ 1 80%甲醇，裂解细胞；
[0272] ⑤4°C 14, 000g离心10分钟，离心后将上清转移到L 5ml ΕΡ管中；
[0273] ⑥ LC-MS(ABI 5500Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测次黄 噪呤、AICAR以及Inosine的含量，分别用13C5， 15N4-次黄噪呤（Cambridge isotope laboratories, cat#489522)、AICAR (sigma, cat#A9978)以及 Inosine (sigma, cat#I4125) 做标准曲线绝对定量。
[0274] 实验结果如图13所示。实验组中表达各PRPS1基因耐药突变体的Reh细胞内的 次黄嘌呤、AICAR以及Inosine的浓度与表达空载和野生型PRPS1基因的对照细胞相比都 有显著地提高。
[0275] 实施例15
[0276] 靶向嘌呤合成途径的核酸药物
[0277] 针对嘌呤从头合成途径的慢病毒LV-CRISPR-ATIC与LV-CRISPR-GART的制备及其 逆转PRPS1基因突变引起的6-MP药物耐受中的应用
[0278] ① CRISPR慢病毒载体的构建：根据CRISPR设计原则与GART和ATIC的序列，分别 设计对应序列如下：CRISPR-ATIC:TGAATCTGGTCGCTTCCGGA(SEQ ID N0:40)，CRISPR-GART:G CAGCCCGAGTACTTATAAT (SEQ ID NO: 39)，构建到 CRISPR 慢病毒载体（Addgene, cat#49535) 中，得到慢病毒载体 lentiCRISPR-ATIC 与 lentiCRISPR-GART ;
[0279] ②按已报道的方法（Shalem 0, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X，Scott DA, Mikkelsen TS, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F Science. 2014Jan 3； 343(6166):84-7.doi:10.1126/science.l247005.Epub 2013Dec 12)包装获得表达针对 ATIC 与 GART 基因的 CRISPR RNA 的慢病毒 LV-CRISPR-ATIC 与 LV-CRISPR-GART ;
[0280] ③将包装得到的空载慢病毒、慢病毒LV-CRISPR-ATIC与LV-CRISPR-GART分 别感染细胞系Reh-PRPS1-S103T与Reh-PRPS1-A190T后形成稳定细胞系，感染Reh细 胞的病毒MOI = 10,加入8 μ g/ml聚凝胺，感染24个小时后换液，培养48小时候加入 0. 8 μ g/ml嘌呤霉素抗性筛选一周后形成下述稳定细胞系：对照细胞系Reh-LV-CRISPR、 Reh-S103T-CRISPR-ATIC、 Reh-S103T-CRISPR-GART、 Reh-A190T-CRISPR-ATIC 和 Reh-A190T-CRISPR-GART。
[0281] ④细胞处理：将药物6-MP进行稀释，加入铺好如步骤③所述的几种细胞系的96孔 板中，每种细胞系设置5个复孔，检测慢病毒感染细胞对6-MP的敏感性变化。具体实施方 式同实施例8 ;
[0282] 实验结果如图14所示，与空载病毒的对照细胞系Reh-LV-CRISPR相比 Reh-S103T-CRISPR-ATIC、 Reh-S103T-CRISPR-GART、 Reh-A190T-CRISPR-ATIC 和 Reh-A190T-CRISPR-GART的IC5。值都显著下降，即表明对药物6-MP的耐药性显著降低。
[0283] 实施例16
[0284] 外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的药物耐受
[0285] 通过检测外源加入嘌呤对Reh细胞的药物敏感性，步骤如下：
[0286] ①细胞接种：将表Reh细胞计数后接种到96孔板中，每孔接种104个细胞，每组设 置5个复孔；
[0287] ②细胞处理：每组分别加入10 μ M、50 μ M、100 μ Μ的次黄嘌呤（HX)或次黄嘌呤核 苷酸（ΜΡ)预处理1小时，然后将药物6-ΜΡ进行梯度稀释，起始浓度为100 μ g/ml，依次3 倍稀释，稀释10个梯度，加入铺好细胞的96孔板中，37°C培养72小时；
[0288] ③细胞活性测定：72小时后，每孔中加入50 μ 1 CellTiter-Glo试剂（Promega公 司），室温混匀孵育10分钟，放入酶标仪（Biotek公司）读化学发光值；
[0289] ④计算IC5Q:用Graphpad 5. 0软件计算药物IC5。值，比较组间差异。
[0290] 实验结果如图15所示。与嘌呤溶剂水对照相比，实验组分别加入次黄嘌呤与雌黄 嘌呤核苷酸的细胞IC 5。值都有显著上升，证明外源加入嘌呤的细胞在6-MP处理后存活率显 著提高，即耐药性显著增加。
[0291] 实施例17
[0292] 外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的代谢
[0293] ①细胞接种：将Reh细胞计数铺6cm培养皿，每个皿3 X 106细胞；
[0294] ②细胞处理：每个6cm培养皿中加入50 μ Μ的次黄嘌呤（HX)或次黄嘌呤核苷酸 (ΜΡ)预处理1小时，后加入10 μ Μ化疗药物6-ΜΡ处理4个小时；
[0295] ③收集细胞：将细胞转移到离心管中，3, 000g离心5分钟，弃上清，按照3Χ 106细 胞/200 μ 1 80%甲醇裂解细胞；
[0296] ④ LC-MS (ABI 5500Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测化疗药物 6-MP 的代谢产物 ??ΜΡ, TGMP 的含量，分别用 ??ΜΡ (Jean Bioscience, cat_U-1148)，TGMP (J ean Bioscience，cat#NU_1121)做标准曲线定量。
[0297] 实验结果如图16所示，对于实验组加入外源嘌呤处理后的Reh细胞，6-MP的代谢 产物??ΜΡ和TGMP在胞内的含量与对照相比都显著减少。
[0298] 实施例18
[0299] 次黄嘌呤竞争性抑制化疗药物6-MP的反应
[0300] 化疗药物6-MP是次黄嘌呤的类似物，6-MP与次黄嘌呤都是HGPRT的底物，本发明 建立了体外酶学反应测定次黄嘌呤与6-MP与HGPRT反应的Km值，反映次黄嘌呤与6-MP与 HGPRT的亲和力。【具体实施方式】如下：
[0301] 建立体外酶学反应，如图17A所示：
[0302] 具体反应体系如下：

[0309] 次黄嘌呤与6-MP依次做浓度梯度稀释，37°C反应1小时，加入80%甲醇终止反应， 通过LC-MS分别检测頂P与??ΜΡ的含量。绘制反应曲线，通过Graphpad 5. 0软件分别计 算次黄嘌呤与6-MP的Km值。
[0310] 实验结果如图17B所示，次黄嘌呤与HGPRT的亲和力明显高于6-MP与HGPRT的亲 和力；且在100 μ Μ 6-MP作为反应底物时，随着加入次黄嘌呤浓度的升高，??ΜΡ的生成受到 了明显的抑制。
[0311] 实施例19
[0312] 洛美曲沙（Lometrexol)逆转PRPS1基因突变导致的6-ΜΡ药物耐受
[0313] 洛美曲沙为一种GART的小分子抑制剂。本发明检测到洛美曲沙可以逆转PRPS1 基因突变导致的6-MP药物耐受，具体步骤如下：
[0314] ①细胞接种：将Reh-PRPS1_S103T与Reh-PRPS1_A190T细胞计数后接种到96孔板 中，每孔接种1〇 4个细胞，每种细胞系设置5个复孔；
[0315] ②细胞处理：用药物5ng/ml洛美曲沙（Lometrexol)或二甲亚楓（DMS0)对照预处 理细胞1小时，对6-MP进行梯度稀释，加入铺好细胞的96孔板中，37°C培养72小时；
[0316] ③读值：72小时后，每孔中加入50 μ 1 CellTiter-Glo试剂（Promega公司），室温 混匀孵育10分钟，放入酶标仪读化学发光值；
[0317] ④计算：用Graphpad 5. 0软件计算IC5。值，比较差异；
[0318] ⑤6-MP代谢产物浓度的检测：同实施例13 ;
[0319] ⑥次黄嘌呤胞内浓度的检测：同实施例14。
[0320] 实验结果如图18所示。与各自的对照相比，Reh-PRPS1_S103T与Reh-PRPS1_A190T 细胞用洛美曲沙（Lometrexol)处理后药物6-MP的IC5。值都显著下降，同时6-MP在 体内的代谢产物??ΜΡ与TGMP都显著上升，表明洛美曲沙使得Reh-PRPS1-S103T与 Reh-PRPS1-A190T细胞系对6-MP的耐药性显著降低。并且处理后的Reh-PRPS1-S103T与 Reh-PRPS1-A190T胞内的6-MP代谢产物??ΜΡ与TGMP都有非常显著地上升，同时次黄嘌呤 浓度有显著下降。
[0321] 实施例20
[0322] 质谱检测嘌呤代谢产物及嘌呤类似物药物代谢产物
[0323] 药物及试剂
[0324] 甲醇、乙腈（HPLC级）购自Sigma-Aldrich公司（美国），甲酸（HPLC级）购自 Merck公司（德国），实验用水由Millipore-Q制备。
[0325] 试验仪器
[0326] 液质联用仪（UPLC-MS/MS):
[0327] AB SCIEX QTR.AP? 5500 (Singapore)
[0328] Waters Ultra Performance LC system(Singapore)
[0329] 1. ACQUITY?Binary Solvent Manager
[0330] 2. ACQUITY?Column Manager
[0331] 3. ACQUITY?Sample Organizer
[0332] 4. ACQUITY?Sample Manager
[0333] 采用Analyst, version 1. 5. 2数据采集和处理系统。
[0334] 其他仪器：Thermo Fisher_70°C超低温冰箱（美国）；Eppendorf 5810R高速大容 量低温离心机（德国）；IKA Vibrax VXR小型摇床（德国）；IKA Vortex振荡器（德国）； KQ5200DA超声波清洗器（昆山）等。
[0335] 1.样品分析方法
[0336] 样品处理方法
[0337] 80%甲醇收集细胞，4度12000rpm离心5分钟，转移上清至新EP管中，取20 μ 1进 行LC-MS/MS分析。
[0338] 1)标记的 PRPP, ADP and GDP:
[0339] 色谱条件
[0340] 流动相组成：流动相A :50mM碳酸氢铵（pH9. 5)
[0341] 流动相B :乙腈：水=6:1 (v/v)
[0342] 梯度洗脱：
[0343] 表 10

[0346] 色谱柱：apHera? NH2Polymer (2 X 150mm);
[0347] 流速：0· 6ml/min ;进样体积：20 μ 1 ;
[0348] 质谱检测条件
[0349] 采用电喷雾离子源（Turbo spray)，选择多通道反应监测（MRM)模式进行二级质 谱分析。质谱检测工作参数及离子源参数如下：
[0350] 表 11
[0351]
[0352] 2)IMP(labeled IMP+3and labeled IMP+9), HX, TIMP, TGMP, AICAR, Inosine, 6-MP, 6-TG, MMP, r-MP, r-TG and r-MMP
[0353] 色谱条件
[0354] 流动相组成：流动相A :水-0. 025%甲酸-ImM
[0355] 流动相B :甲醇-0· 025 %甲酸-ImM醋酸铵
[0356] 梯度洗脱：
[0357] 表 12
[0358]
[0360]色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 (4. 6 X 150mm, 5 μ m);
[0361] 流速：0· 6ml/min ;进样体积：15 μ 1 ;
[0362] 质谱检测条件
[0363] 采用电喷雾离子源（Turbo spray)，选择多通道反应监测（MRM)模式进行二级质 谱分析。质谱检测工作参数及离子源参数如下：
[0364] 表 13
[0367] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关 条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. PRPS1作为急性淋巴细胞白血病耐药复发的基因标志物的用途。2. -种PRPS1突变体，其特征在于，所述PRPS1突变体是氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的序列中下述位点中的任意一个位点发生氨基酸的替换突变后形成的，所述替换 突变为：第103位丝氨酸替换为苏氨酸、第103位丝氨酸替换为天冬酰胺、第144位天冬酰 胺替换为丝氨酸、第176位赖氨酸替换为天冬酰胺、第183位天冬氨酸替换为谷氨酸、第190 位丙氨酸替换为苏氨酸、第191位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第303位苏氨酸替换为丝氨酸、 第53位缬氨酸替换为丙氨酸、第72位异亮氨酸替换为缬氨酸、第77位半胱氨酸替换为丝 氨酸、第139位天冬氨酸替换为甘氨酸、第311位酪氨酸替换为半胱氨酸、第103位丝氨酸 替换为异亮氨酸、第114位天冬酰胺替换为天冬氨酸或第174位甘氨酸替换为谷氨酸。3. -种PRPS1突变基因，其特征在于，所述PRPS1突变基因编码如权利要求2所述 PRPS1突变体。4. 如权利要求3所述PRPS1突变基因，其特征在于，所述PRPS1突变基因的核苷酸序列 为如序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中下述位点中的任意一个位点发生替换突变后 形成，所述替换突变为：第308位G替换为C、第308位G替换为A、第431位A替换为G、第 528位G替换为C、第549位C替换为G、第568位G替换为A、第573位G替换为C、第908 位C替换为G、第158位T替换为C、第214位A替换为G、第230位G替换为C、第416位A 替换为G、第932位A替换为G、第308位G替换为T、第340位A替换为G或第521位G替 换为A。5. -种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如权利要求3或4所述PRPS1突变基 因。6. -种转化体，其特征在于，所述转化体包含如权利要求5所述重组载体。7. -组评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的PRPS1突变体群，其特征在于，所述 PRPS1突变体群包括以下PRPS1突变体：其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的序 列中第103位丝氨酸替换为苏氨酸、第103位丝氨酸替换为天冬酰胺、第144位天冬酰胺替 换为丝氨酸、第176位赖氨酸替换为天冬酰胺、第183位天冬氨酸替换为谷氨酸、第190位 丙氨酸替换为苏氨酸、第191位亮氨酸替换为苯丙氨酸或第303位苏氨酸替换为丝氨酸。8. 如权利要求7所述PRPS1突变体群，其特征在于，所述PRPS1突变体群还包括以下 PRPS1突变体中的一种或多种：其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的序列中第53 位缬氨酸替换为丙氨酸、第72位异亮氨酸替换为缬氨酸、第77位半胱氨酸替换为丝氨酸、 第139位天冬氨酸替换为甘氨酸、第311位酪氨酸替换为半胱氨酸、第103位丝氨酸替换为 异亮氨酸、第114位天冬酰胺替换为天冬氨酸、第174位甘氨酸替换为谷氨酸或第190位甘 氨酸替换为缬氨酸。9. 一组评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的PRPS1突变基因群，其特征在于，所 述PRPS1突变基因群包括以下PRPS1突变基因：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所 示的序列中第308位G替换为C、第308位G替换为A、第431位A替换为G、第528位G替 换为C、第549位C替换为G、第568位G替换为A、第573位G替换为C或第908位C替换 为G〇10. 如权利要求9所述PRPS1突变基因群，其特征在于，所述PRPS1突变基因群还包括 以下PRPS1突变基因中的一种或多种：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示的序列 中第158位T替换为C、第214位A替换为G、第230位G替换为C、第416位A替换为G、第 932位A替换为G、第308位G替换为T、第340位A替换为G、第521位G替换为A或第569 位C替换为T。11. 一种评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒，其特征在于，其包括：检测 如权利要求9或10中所述PRPS1突变基因群中的PRPS1突变基因的试剂和使用说明书。12. 如权利要求11所述试剂盒，其特征在于，所述试剂包括扩增PRPS1基因各外显子的 引物、DNA聚合酶、dNTP或缓冲液中的一种或多种。13. 如权利要求12所述试剂盒，其特征在于，所述使用说明书记载的内容包括以下步 骤： (1) 抽提样本基因组DNA ; (2) 检测步骤（1)所得的样本基因组DNA中的PRPS1突变基因。14. 如权利要求13所述试剂盒，其特征在于，步骤（2)中，所述检测步骤（1)所得的样 本基因组DNA中的PRPS1突变基因的方法包括：以步骤（1)所得的样本基因组DNA为模板 PCR扩增PRPS1基因各外显子，将扩增片段测序。15. 如权利要求13所述试剂盒，其特征在于，所述使用说明书记载的内容还包括步骤 (3):检测到样本基因组DNA中存在如权利要求9或10所述PRPS1突变基因群中的任意一 种或多种PRPS1突变基因，则该样本有急性淋巴细胞白血病耐药复发的风险。16. 如权利要求12所述试剂盒，其特征在于，所述扩增PRPS1基因各外显子的引物为核 苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3~SEQ ID NO. 16所示序列中的一种或多种；和/或，所 述试剂盒包括提取细胞或组织样本DNA的试剂；和/或，所述抽提样本基因组DNA的试剂为 蛋白酶、饱和酚、体积比为24 :1的氯仿和异戊醇混合液、醋酸钠、无水乙醇、70%乙醇和TE 溶液，所述百分比为体积百分比；和/或，所述提取细胞或组织样本DNA的试剂为Qiagen公 司生产的DNA抽提试剂盒；和/或，所述DNA聚合酶为Τ0Υ0Β0公司生产的KOD-Plus DNA聚 合酶；和/或，所述缓冲液为Τ0Υ0Β0公司生产的KOD-Plus DNA聚合酶缓冲液；和/或，所述 dNTP为dATP、dGTP、dCTP和dTTP四种的混合物。17. -种评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒，其特征在于，其包括：检测 如权利要求7或8中所述PRPS1突变体群中的PRPS1突变体的试剂和使用说明书。18. 如权利要求17所述试剂盒，其特征在于，所述试剂为检测PRPS1突变体酶活性的试 剂。19. 如权利要求18所述试剂盒，其特征在于，所述试剂包括PRPP和用放射性同位素碳 原子标记的葡萄糖。20. 如权利要求19所述试剂盒，其特征在于，所述用放射性同位素碳原子标记的葡萄 糖为13C标记的葡萄糖。21. 如权利要求17所述试剂盒，其特征在于，所述使用说明书记载的内容包括以下步 骤： (1) 裂解样本细胞； (2) 检测步骤（1)所得的细胞裂解液中的PRPS1突变体。22. 如权利要求21所述试剂盒，其特征在于，所述使用说明书记载的内容还包括步骤 (3):检测到样本中存在酶活性高于野生型PRPS1的PRPS1突变体，则该样本有急性淋巴细 胞白血病耐药复发的风险；和/或，所述酶活性高于野生型PRPS1的PRPS1突变体为如权利 要求7或8所述PRPS1突变体群中的任意一种或多种。23. 如权利要求21所述试剂盒，其特征在于，步骤（2)所述检测步骤（1)所得的细胞裂 解液中的PRPS1突变体的方法是检测PRPS1的酶活性。24. 如权利要求17所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括细胞裂解试剂；和/ 或，所述细胞裂解试剂为80%甲醇，所述百分比为体积百分比；和/或，所述试剂盒还包括 无葡萄糖培养基；和/或，所述无葡萄糖培养基为购自Gibco公司的无葡萄糖培养基。25. -种检测化合物的治疗或预防儿童急性淋巴细胞白血病耐药复发的活性的方法， 其特征在于，其包括下述步骤： (1) 使化合物与含如权利要求9或10所述PRPS1突变基因群中的任何一种PRPS1突变 基因的白血病细胞接触，得预处理的白血病细胞； (2) 使抗白血病的化疗药物与步骤（1)所得的预处理的白血病细胞接触。26. -种筛选治疗或预防儿童急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物的方法，其特征在 于，其包括下述步骤： (1) 使候选化合物与含如权利要求9或10所述PRPS1突变基因群中的任何一种PRPS1 突变基因的白血病细胞接触，得预处理的白血病细胞； (2) 使抗白血病的化疗药物与步骤（1)所得的预处理的白血病细胞接触。27. 如权利要求26所述方法，其特征在于，步骤（1)所述白血病细胞为人源白血病细 胞；和/或，所述人源白血病细胞为人源淋巴白血病细胞；和/或，所述人源淋巴白血病细 胞为Reh细胞或Jurkat细胞。28. 如权利要求26所述方法，其特征在于，所述接触的方法包括将候选化合物直接加 到所述白血病细胞的培养基中；和/或，步骤（1)中还同时不采用候选化合物与含如权利要 求9或10所述PRPS1突变基因群中的任何一种PRPS1突变基因的白血病细胞接触，作为对 照；和/或，所述化疗药物为嘌呤类药物；和/或，所述嘌呤类药物为6-MP或6-TG。29. 如权利要求26所述方法，其特征在于，还包括步骤（3)，即检测步骤（2)所得的 细胞的存活率；和/或，所述检测的方法为使用活细胞染料染色后计数法、MTT法或通过 测量荧光素酶与存活细胞内的ATP结合后发出荧光强度的方法；和/或，所述过测量荧光 素酶与存活细胞内的ATP结合后发出荧光强度的方法为使用市售的Promega公司的Cell Titer-Glo试剂来检测。
【文档编号】C12N9/12GK105986023SQ201510086559
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月17日
【发明人】李本尚, 李慧, 王升跃, 周斌兵
【申请人】上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心