26-甲基-25-羟基维生素D₃化合物及其制备方法和应用

26-甲基-25-羟基维生素D₃化合物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明为26?甲基?25?羟基维生素D3化合物，提供一种对乳腺癌细胞（MDA?MB?435）、肝癌细胞(HepG2)均表现出较好的抗癌活性，可应用于制备抗癌药物的新化合物，其结构式如式（I）所示：（I）。
【专利说明】26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物及其制备方法和应用
[0001 ]
技术领域： 本发明涉及一种假诺卡氏菌来源的26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物及其制备方法和 应用。
[0002]
【背景技术】： 癌症是严重威胁人类生命的常见病和多发病。研发高效和特异性强的新型抗癌药物是 抗肿瘤药物研究的热点。近年来，研究发现活性维生素 D3类药物及其类似物还具有调控靶 细胞、诱导细胞分化及抑制细胞增殖等作用机制而发挥药效活性，使其在重大疾病如恶性 肿瘤、免疫疾病、银肩病等疾病的治疗上表现出巨大潜力，已成国内外研究的热点药物。
[0003]

【发明内容】
： 本发明的目的在于提供一种微生物来源的26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物。所述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物是从假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243或 者假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243的发酵液中分离得到的，该化合物 对乳腺癌细胞(MDA-MB-435)、肝癌细胞(HepG2)均表现出较好的抗癌活性，可应用于制备抗 癌药物。
[0004] 本发明的另一个目的是提供上述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的制备方法。
[0005] 本发明还有一个目的是提供上述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的应用。
[0006] 本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现： 一种26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物，其结构式如式（I)所示：
(I) 本发明所述假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243菌株已在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2013年7月17日，保藏号 是CGMCCN0.7935。该菌株是由从广州白云山的土壤样品中分离筛选得到的能够将维生素 D3 转化为骨化二醇的原始菌株假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243诱变处理 后得到的，参见专利CN103898004A。使用假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243菌株和假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243都能够制备得到26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物。
[0007] 上述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的制备方法，包括如下步骤： (1)将假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243或者假诺卡氏菌 Pseudonocardia autotrophica SIIA2243菌株接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养 液； (2) 将种子培养液接入发酵培养基中，摇床培养，向发酵液中补入维生素 D3,继续发酵 得发酵液； (3) 将步骤(2)的发酵液，用有机溶剂进行萃取，浓缩，制备柱分离后得到式(I)化合物。
[0008] 步骤（1)所述种子培养基的组分为:蛋白胨0.2~2%，玉米浆0.2~2%，葡萄糖0.5~ 5%，黄豆粉0.1~1.5%，氯化钠0.1~1.5%，磷酸二氢钾0.1~1.5%，其余为水，pH7.0~8.0。步 骤（1)所述摇床培养是摇瓶转速100~300r/min，温度20~35 °C，培养2~5天，得摇瓶种子 液。
[0009] 步骤(2)所述发酵培养基的组分为:蛋白胨0.2~2%，玉米浆0.2~2%，葡萄糖0.5~ 5%，黄豆粉0.1~1.5%，氯化钠0.1~1.5%，磷酸二氢钾0.1~1.5%，其余为水，pH7.0~8.0。步 骤（2)所述种子液培养的时间为1~4天，培养的温度为20~35°C，摇瓶转速100~300r/ min，补入维生素 D3，继续发酵1~10天。
[0010] 步骤(3)所述有机溶剂为乙酸乙酯，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩后获得的浓缩液 利用柱直径为20mm~IOOmm高压制备液相层析系统进行分离，获得26-甲基-25-羟基维生素 D3组分，即得式(I)化合物。
[0011] 本发明分离得到的26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物具有抑制癌细胞增殖的作 用，因此可用于制备抗癌药物。
[0012] 所述抗癌包括抗乳腺癌、抗肝癌。
[0013] 本发明具有如下有益效果： 本发明的26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物是从通过假诺卡氏菌发酵方式制备得到， 原材料价格低廉且易得，分离过程简单，所以26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的制备成本 低;所述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物具有抑制癌细胞增殖的作用，该化合物对乳腺癌 细胞(MDA-MB-435)、肝癌细胞(HepG2)均表现出较好的抗癌活性，可应用于制备抗癌药物， 应用前景广阔。
[0014]
【具体实施方式】： 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0015] 实施例1: 假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243发酵制备26-甲基-25-羟基维生 素 D3化合物为了便于理解本发明，下面将结合实施例来进一步详细描述本发明。除非另有 特指，本实施例中的灭菌条件为121°C，30分钟。％为质量百分比。
[0016] 1，培养基： 种子培养基:蛋白胨1.5%，玉米浆1.5%，葡萄糖1.5%，黄豆粉0.4%，氯化钠0. 5%，磷酸二 氢钾0.2%，其余为水，pH7.5。
[0017] 发酵培养基:蛋白胨1 · 5%，玉米浆1 · 5%，葡萄糖1 · 5%，黄豆粉0 · 4%，氯化钠0 · 5%，磷 酸二氢钾0.2%，其余为水，pH7.5， 2，发酵制备26-甲基-25-羟基维生素 D3 制种:SIIA2243斜面菌株挖块到装有100mL种子培养基的500ml三角烧瓶中，摇瓶转速 280r/min，温度29°C，培养3天，总共制得500ml种子液。
[0018] 发酵:取20ml种子液在无菌条件下移入装有200ml发酵培养基的750 ml三角烧瓶 中，共接种25瓶，摇瓶转速280r/min，温度29°C，培养3天，向每瓶发酵液中补入溶解有200mg 维生素 D3的溶液IOml，继续发酵5天后终止发酵。
[0019] 提取精制:终止发酵后，往约5000ml发酵液中加入5000ml乙酸乙酯，搅拌2hr，加入 破乳剂后静置过夜，分层后移去下层的发酵液，将乙酸乙酯萃取液移入浓缩瓶中进行减压 浓缩，所回收的有机溶剂乙酸乙酯又进行二次萃取，而减压浓缩后获得的浓缩液利用高压 制备液相层析系统进行分离，色谱条件:色谱柱DAC C18柱(50 _X250 mm，10 μπι);流动 相乙腈:水(85:15);流速40 ml/min;检测波长265 nm;进样量10 ml。收集目标组分，减 压浓缩至干后，获得26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物组分，即得式（I)化合物30mg。
[0020] 对其进行质谱及核磁共振分析检测。
[0021 ]化合物结构分析测试的数据如下： ESI-MS m/z 415.29[M]VhNMR(500MHz，CDC13) δ 2.38(ddd，J=5.1、10.5、14.2 Hz, lH)，2.15(dq， J=4.8、13.9 Hz, 1H)， 1.31~1.33(m， 1H)， 1.90~1.94(m，lH)，3.90 (ddq，J=4.0、9.4、13.5 Hz, lH)，2.56(dd, J=4.2、12.9 Hz, lH)，2.27(dd， J=9.5、12.6 Hz, lH),6.21(d, J=Il.7 Hz, lH),5.95(d, J=IO.9 Hz, 1H),2.79~2.83(m, 1H), 1.64 ~1.68(m,lH),1.35~1.37(m, 1H), 1.26~1.30(m,1H), 1.25~1.29(m, 1H), 1.96~1.98 (m, 1H), 1.22~1.26(m, 1H), 1.63~1.65(m, 1H), 1.50~1.52(m,1H), 1.26~1.30(m, 1H),1.83~ 1.85 (m,lH),1.94~1.98(m, lH),0.52(s, 3H),4.78(s, 1H), 5.01(s, 1H), 1.36~1.40(m, 1H), 0.90(d, J=7.0 Hz, 3H),1.23~1.27(m, 1H), 1.22~1.26(m,1H), 1.17~1.21(m, 1H), 1.46~1.50(m,lH),1.01~1.05(m, 2H),1.65(q, J=5.0 Hz,2H), 1.12(t, J=6.5^6.0 Hz, 3H)，1.42(s, 3H); 13CNMR(125MHz，CDC13)S32.0(CH2)，35.1 (CH2)，69.2 (CH), 45.9 (CH2),135.0( 0,122.3( CH), 117.5(CH), 142.1 ( C), 29.0(CH2), 145.0 (C), 23.6 (CH2), 40.5(CH2), 45.8(0,56.4 (CH),22.2 (CH2),27.7 (CH2),56.3 (CH),12.0 (CH3),112.4( CH2)36.0( CH),19.0 (CH3),29.6 (CH2), 23.5(CH2), 35.6 (CH2)77.3(C), 34.6 (CH2) ,17.3 (CH3),30.3 (CH3)0
[0022] C-3位立体构型的确定：（I)根据C-3位氢的耦合常数进行的判断，参考的是甾体 类三萜苷元C-3位羟基构型确定的方法。（2)目标物1的旋光度(α)为:+ 0.401°，测定条件： 20°C，浓度C 0.5g/100ml ;测定方法:参照中国药典维生素 D3旋光度的测定方法。同样条 件下测定25-羟基维生素 D3的旋光度(α)为+ 0.422°，说明目标物1同25-羟基维生素 D3的立 体构型一致，均为右旋体。
[0023]基于以上数据分析，最终确证该目标物为（5Ζ，7Ε)-9，10-开环胆留_5,7，10(19)_ 三烯-(26-甲基)-3β，25-二醇，即26-甲基-25-羟基维生素 D3，结构式如式(I)所示：
(I) 实施例2: 假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243发酵制备26-甲基-25-羟基维生 素 D3化合物。
[0024]详细操作参见实施例1，最终获得26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物组分，即得式 (I)化合物26mg。
[0025] 实施例3: 采用MTT法测试26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的抗癌活性。
[0026] MTT:3_(4，5_dimethyl-2-thiazolyl)_2，5_diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，是一种染料。
[0027]取对数生长期的乳腺癌细胞(MDA-MB-435)、肝癌细胞(HepG2)分别接种于96孔板， 用DMEM培养基将细胞稀释至I X IO4个/ml，每孔加入200yL已经稀释的细胞，每组设定五个 平行孔，另设空白孔(未接种细胞的孔)和对照孔(接种细胞但不含药物的DMEM培养基孔）， 37 °C，5%C〇2条件下培养24小时。
[0028] 将26-甲基-25-羟基维生素 D3配制为终浓度为0，0.1，0.5，1. 0，5. 0，10， 20, 30, 40, 50ymol/L的溶液，将已经培养了24小时的96孔板取出，小心吸去培养基，往每 孔加入不同浓度的26-甲基-25-羟基维生素 D3溶液200yL，继续培养48小时， 取MTT 50 mg溶解在25ml 0.01m〇l/L的磷酸盐缓冲液中，用0.22μπι滤膜过滤除菌，每孔 加入2mg/ml的MTT 20yL，孵育4小时，尽量吸出孔内培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMS0) 150yL，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪于570nm波长下测定各孔OD 值；以吸光度值对药物浓度对数作图，求出IC50值，结果用平均值±标准偏差表示。
[0029] 结果显示26-甲基-25-羟基维生素 D3对乳腺癌细胞（MDA-MB-435)、肝癌细胞 (HepG2)肿瘤细胞的IC50 (yg/mL)分别为 14·34± 1 ·89和 16·29± 1 ·96，这表明26-甲基-25-羟基维生素 D3具有明显的抗乳腺癌和抗肝癌作用。
【主权项】
1.26-甲基-25-羟基维牛素 D3化合物，其特征在于，其结构式如式（I)所示：(I)02. 根据权利要求1所述的26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的制备方法，其特征在于，包 括如下步骤： (1) 将假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243或者假诺卡氏菌 Pseudonocardia autotrophica SIIA2243菌株接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养 液； (2) 将种子培养液接入发酵培养基中，摇床培养，向发酵液中补入维生素 D3，继续发酵得 发酵液； (3) 将步骤(2)的发酵液，用有机溶剂进行萃取，浓缩，制备柱分离后得到式(I)化合物； 所述假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243菌株已在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，保藏日期是2013年7月17日，保藏号是 CGMCCNo.7935,所述假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243菌株是从广州白 云山的土壤样品中分离筛选得到，能够将维生素 D3转化为骨化二醇的原始菌株，假诺卡氏 菌Pseudonocardia autotrophica SIIA243菌株通过诱变处理得到了Pseudonocardia autotrophica SIIA2243菌株。3. 根据权利要求2所述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的制备方法，其特征在于，步骤 (1)所述种子培养基的组分为:蛋白胨〇. 2~2%，玉米浆0.2~2%，葡萄糖0.5~5%，黄豆粉0.1 ~1 · 5%，氯化钠0 · 1~1 · 5%，磷酸二氢钾0 · 1~1 · 5%，其余为水，pH7 · 0~8 · 0。4. 根据权利要求2所述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的制备方法，其特征在于，步骤 (1) 所述摇床培养是摇瓶转速100~300r/min，温度20~35°C，培养2~5天，得摇瓶种子液。5. 根据权利要求2所述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的制备方法，其特征在于，步骤 (2) 所述发酵培养基的组分为:蛋白胨0.2~2%，玉米浆0.2~2%，葡萄糖0.5~5%，黄豆粉0.1 ~1 · 5%，氯化钠0 · 1~1 · 5%，磷酸二氢钾0 · 1~1 · 5%，其余为水，pH7 · 0~8 · 0。6. 根据权利要求2所述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的制备方法，其特征在于，步骤 (2) 所述种子液培养的时间为1~4天，培养的温度为20~35°C，摇瓶转速100~300r/min， 补入维生素 D3,继续发酵1~10天。7. 根据权利要求2所述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物的制备方法，其特征在于，步骤 (3) 所述有机溶剂为乙酸乙酯，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩后获得的浓缩液利用柱直径为 20mm~IOOmm高压制备液相层析系统进行分离，获得26-甲基-25-羟基维生素 D3组分，即得 式(I)化合物。8. 权利要求1所述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物在制备抗癌药物中的应用。9. 根据权利要求8所述26-甲基-25-羟基维生素 D3化合物在制备抗癌药物中的应用，其 特征在于，所述抗癌包括抗乳腺癌、抗肝癌。
【文档编号】A61P35/00GK106008301SQ201610346213
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】曾志刚, 翟龙飞, 张敬, 凌燕, 席章姣
【申请人】中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所