黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法

黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法
【专利摘要】本发明公开一种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法，黑蚁原材料先经二氯甲烷溶剂室温冷浸提取后得到黑蚁滤渣，再将黑蚁滤渣采用质量百分比为60?80%甲醇溶液室温冷浸提取，提取后的甲醇浓缩液经冷冻干燥处理得甲醇浸膏，然后甲醇浸膏先后经过乙酸乙酯溶液、石油醚?乙酸乙酯混合溶液洗脱后，得到的馏分经进一步分离纯化最终提取出2个化合物，即大环内酯倍半萜骨架化合物。本发明采用70%的甲醇溶液浸渍提取，能够使大环内酯倍半萜骨架的化合物高度富集后尽可能多的提取出来，并能有效分离得到单体化合物。
【专利说明】
黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法
技术领域
[0001] 本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化 合物的提取方法。
【背景技术】
[0002] 黑蚁(Polyrhachzs vzczna Roger)是节肢动物门、昆虫纲、缺翅目、蚁科多刺蚁属 的昆虫，是一种及其远古的社会性昆虫，是经过国家卫生部门批准许可的唯一有作为药用 及食用双重价值的药品，据文献记载，黑蚁作为一种常见的中药具有补肾精，壮肾阳，益精， 强腰膝的功效。临床上主治肾虚劳损，腰膝酸痛，耳聋耳鸣，阳痿，遗精，早泄，宫冷不孕，带 下清稀等疾病。该研究的文献相关报道有郑巍等人从拟黑多刺蚁的三氯甲烷中分离纯化得 到化合物谷甾醇、甘油、十八烷酸单甘油酯、、十八烷酸、十八碳烯酸（油酸）、十八碳烯酸 单甘油酯、棕榈酸等化合物。中国科学院昆明植物所程永现研究员通过对食用黑蚁的研究， 先后从其90%乙醇提取物中分离纯化出了 13个含氮非肽化合物和6个新的多巴胺衍生物。进 而主要研究了这些化合物作为R0CK1/2抑制剂、神经干细胞增殖刺激剂、免疫抑制剂和抗炎 作用的功能等方面的研究，为黑蚁在中医药的临床应用提供了科学依据。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的是提供一种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法，该方法 是在活性指导下的有效分离，本发明采用70%的甲醇溶液浸渍提取，能够使大环内酯倍半萜 骨架的化合物高度富集后尽可能多的提取出来，并能有效分离得到单体化合物。
[0004] 本发明所采用的技术方案是：黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法，黑 蚁原材料先经二氯甲烷溶剂室温冷浸提取后得到黑蚁滤渣，再将黑蚁滤渣采用质量百分比 为60-80%甲醇溶液室温冷浸提取，提取后的甲醇浓缩液经冷冻干燥处理得甲醇浸膏，然后 甲醇浸膏先后经过乙酸乙酯溶液、石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱后，得到的馏分经进一步 分离纯化最终提取出2个化合物，即大环内酯倍半萜骨架化合物。
[0005] 作为本发明一种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法的进一步优化，所 述方法包括以下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料，清洗干净后放入45_50°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑 蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量5-10倍的二氯甲烷溶剂室温冷浸，48-50h 后过滤，将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量5-10倍的二氯甲烷重复提取，过滤，分别 收集滤液和滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤三、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为60-80 %的甲 醇溶液室温冷浸提取48-50h后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为60-80 %甲醇溶液室温冷浸提取，重复上述操作若干次，合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁 60-80 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-10-20°C冰箱中冷冻至结冰状，取出再放置于冷冻 干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑蚁的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤三得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，采用柱色谱法进行分离，先 用乙酸乙酯洗脱后，再将洗脱得到的馏分用石油醚-乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，洗脱得 到的馏分经进一步纯化得到化合物1和化合物2,即大环内酯倍半萜骨架化合物，结构式如 下：
化合物2。
[0006] 作为本发明一种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法的进一步优化，步 骤四所述的分离提纯的具体步骤为:将步骤三得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用 硅胶拌样后，利用湿法上柱，进行柱色谱分离;取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用7-10倍柱体积的乙酸乙酯洗脱，收集乙酸乙酯馏分，合并浓缩后得到乙酸乙酯提取浸膏，备 用； 取上述黑蚁的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油醚-乙酸乙酯溶液 进行梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯洗脱液的梯度比例依次为10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分别收集馏分，TLC检测合并相同馏分，得到不同馏分段共8个组分； 取梯度比例为8:2的石油醚-乙酸乙酯馏分段，进一步通过S印hadex LH-20凝胶色谱进 行纯化，收集合并馏分，经过TLC分析，分别得到化合物1和化合物2。
[0007] 作为本发明一种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法的进一步优化，梯 度比例为8:2的石油醚-乙酸乙酯馏分段进行5叩1^(1^1^-20凝胶色谱纯化过程中，流动相 采用摩尔比例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为〇.3ml/min。
[0008] 与现有技术相比，本发明至少具有下述优点及有益效果： 本发明提供的黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法是基于对孳生昆虫黑蚁 的抵抗多种致病性微生物的侵害或抗菌性能的研究，通过该方法提取得到2个大环内酯倍 半萜化合物，这两种化合物经药效学实验证明，具有良好的抗金黄色葡萄球菌，枯草杆菌， 大肠杆菌，绿脓杆菌的广谱抗菌活性。为进一步提升黑蚁的药用价值提供了新的科学依据， 并具有重要的理论价值和开发应用前景。
[0009] 本发明提供的方法是在活性指导下的有效分离，尤其适合天然微量化合物的追踪 获取，本发明采用70%的甲醇溶液浸渍提取，能够使大环内酯倍半萜骨架的化合物高度富集 后尽可能多的提取出来，并能有效分离得到单体化合物。本发明已经分离的大环内酯倍半 萜骨架的化合物具有广谱抗菌生物活性。
【具体实施方式】
[0010] -种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料，清洗干净后放入45-50°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑 蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量5-10倍的二氯甲烷溶剂室温冷浸，48-50h 后过滤，将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量5-10倍的二氯甲烷重复提取，过滤，分别 收集滤液和滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤三、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为60-80 %的甲 醇溶液室温冷浸提取48-50h后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为60-80 %甲醇溶液室温冷浸提取，重复上述操作若干次，合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁 60-80 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-10-20°C冰箱中冷冻至结冰状，取出再放置于冷冻 干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑蚁的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤三得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用硅胶拌样后，利用湿法上 柱，进行柱色谱分离;取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用7-10倍柱体积的乙酸乙酯洗 脱，收集乙酸乙酯馏分，合并浓缩后得到乙酸乙酯提取浸膏，备用； 取上述黑蚁的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油醚-乙酸乙酯溶液 进行梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯洗脱液的梯度比例依次为10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分别收集馏分，TLC检测合并相同馏分，得到不同馏分段共8个组分； 取梯度比例为8:2的石油醚-乙酸乙酯馏分段，进一步通过S印hadex LH-20凝胶色谱进 行纯化，流动相采用摩尔比例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为〇.3ml/min，收集合 并馏分，经过TLC分析，分别得到化合物1和化合物2，即大环内酯倍半萜骨架化合物，结构式 如下：
化合物2。
[0011] 这两个大环内酯倍半萜骨架的化合物是全新的倍半萜化合物，经过波谱数据分析 和理化鉴定推断他们的结构式如下，并被命名为： (1)化合物1，黑蚁素 A-l(/Wj^acAzSic/e U)，化学名称为:4，10，15_三甲基，1，3_ 二甲酰氨基，8-0-(2~甲基，3^甲氧基）丙烯酯基，11-(1-甲基，（6,7)驥十五环(5.10-二烯） 戊内酯-12化合物内酯化合物。
[0012] (2)化合物2,黑蚁素为，化学名称为：21_四甲基，1-(9)-环内酰胺基，3α-甲酰氨基，7-0-(27-甲基，3。甲氧基）丙烯酯基，13-(17，18_二甲基）异 丙基，21-甲基，双环[3,5，0]，癸烷驥环(5.6)戊内酯-14化合物。
[0013] 化合物波谱数据结构推断： 化合物1，黑蚁素 A-U/WjrAacAzsic/e d-乃淡黄色固体粉末。[a]D20 = -69.8°。高分 辨质谱测定分子量显示HRESI-MS m/z [M+H]+ 463.2395 (calc. 463.2399)，可推测该化 合物的分子式为C24H34N2〇7。红外图谱展示有酯基吸收峰在1736，1260cm-l;酰胺基吸收信号 1663,1432和660 cm-1 ;C=C双键吸收特征峰3052,1601和1493cm-l，建议该化合物分子结构 中可能含有上述官能团。化合物1的1HNMR (400MHz，CDC13)，核磁共振氢谱显示在芳区有 2个双键质子信号分别在δΗ 7.23(m，1H)和8.09(s，1H)，说明化合物中含有双键;另外还 有两个活泼財言号在3!18.00和8.11。在1!1~1?的含氧区有1个甲氧基信号在6!14.46((1(1， 3H)和在δΗ4.46和4.51处分别有一个质子信号，揭示化合物中还有两个含氧质子或连接在 氮上的质子;在化合物的饱和信号区含有7个质子信号在δΗ 2.23~1.20,在δΗ 0.98~0.91 是含有6个甲基的18个质子信号。在化合物的13C NMR (100MHz，CDC13)核磁共振图谱中显 示有24个碳信号，其中羰基信号6〇175.5，174.3，167.2和163.8分别显示有2个酯基和和 2个酰胺基的存在，这与红外图谱信号的分析一致。DEPT分析显示有2个亚甲基信号分别在δ c 41.9和26.1;7个次甲基信号163·6，129·5,74·0 X 2,57·4,50·1，48·3;5个季碳信号δ c 163·6，130·3，129·7 X 2和 127.9;6个甲基信号在23.3,21.8，19.6，17.9，16.1和 11.9。经与文献对照[1，2'3]和理化性质分析，初步判断该化合物为大环内酯类的新化合物。 分析化合物1的1 Η- 1Η COSY及HSQC相关图谱证明了该骨架结构应有的3个结构片段:C-2-C- 3-C-4-C-5、C-6-C-7-C-8-C-9和C-4 ' -C-2 ' -C-3 ' c^HMBC谱中，H-4 ' 与C-3 '（163 · 6)，甲氧 基Η与C-3'的相关信号表明C-3'直接和1个甲氧基相连;在HMBC谱中，还可以观测到Η-3与C-19 0(；167.2)和(：-14(3(；16.1)相关，揭示(：-3连有1个酰胺基；甲基!1-15与(：-1(3( ； 127.9)相关和酰胺活泼氢与〇1(3(；127.9)和(：-1〇0(；13〇.3)相关信号证实(：-1连接1个甲 酰胺基。圓8(：谱另外揭示的!1-8分别与(：-12 0(；175.5)和(：-1'0(；174.3)信号相关，表明 有两个酯键的存在。综上分析，可推段该化合物为4，10，15-三甲基，1，3-二甲酰氨基，8-0-(2~甲基，3^甲氧基)丙烯酯基，11-(1-甲基，（6,7)驥十五环(5.10-二烯)戊内酯-12化合物 内酯化合物。该化合物未见文献报道，因此为1个新的大环内酯类化合物，命名为黑蚁素 Α-1 (Polyrhachzside k_Y)。
[0014] 表1:化合物1的1H NMR和13C NMR数据归属
[1] ff. Hexz, P. s. Kalyanaraman and G. Rama Krishnan. J. Org. Chem. 42.2265.
[2] ff. Herz and .R. P. Sharma. J. Org. Chem. 41.1015(1976).
[3] 龚运淮天然有机化合物的13C匪R核磁共振化学位移，云南科技出版社，1986， P76. 化合物2,黑蚁素 U?)淡黄色粉末，[a]D2()= +75.6°。高分辨质谱 测定分子量显示HRESI-MS m/z [M+H]+ 463.2394(calc. 463.2399)，可推测该化合物的 分子式为C24H34N2〇 7。核磁共振图谱显示化合物2和化合物1非常相似，可推断化合物1是同类 大环内酯化合物的结构。在化合物2的1H匪R(400MHz，CDC13)图谱中，发现化合物2相比 上述化合物明显缺少一组芳氢，建议化合物2分子中只有一个双键结构。化合物2的13C NMR (100MHz，⑶C13)及结合它的DEPT谱数据也不同于上述化合物，碳谱中有21条线代表了化 合物中的24个碳信号，其中季碳信号62.2 X 2,和130.4在碳图谱中未出峰而仅显示在 DEPT图谱中。其他包括2个羰基碳信号在175.4和174.3,两个酰胺基信号分别在 167.2和163.6,2个季碳信号在130.4和54.7;11个次甲基信号分别在163.5，62.2 X 2,54.7，50.7，49.3，48.3，41.9，38.5，31.8，25.6;两个亚甲基信号是在41.9和 26.0; 5个甲基信号分别在δο 23.3,21.8,17.9,16.1和11.9另有1个甲氧基碳信号在 56.7。以上所述的波谱学特征结合其1Η-1Η COSY和HSQC谱证实该化合物具有典型的似化合 物1的大环饱和内酯的骨架结构。进一步化合物2的结构根据2D NMR被推断为含有饱和庚环 骨架的大环内酯化合物。在化合物2的HMBC谱中，相关信号交叉在H-1/C-11，H-8/C-ll和H-8/C-1表明了内酰胺环与饱和庚烷的存在，相关信号交叉在H-4/C-21，H-5/C-10和H-2/C-3、 C-4证明了3-酰胺基环戊烧的结构存在，相关彳目号交叉在H-13/C-14、C_7和H_3'/C-l '，揭不 了分子中环庚烷的7-取代结构和5,6连接的内酯环结构的推断。经与文献对照[4]，可推断该 化合物为大环内酯类的另一个新化合物，化学名称为:21-四甲基，1-(9)-环内酰胺基，3α-甲酰氨基，7-0-(27-甲基，甲氧基）丙烯酯基，13-(17,18-二甲基）异丙基，21-甲基，双 环[3，5，0]，癸烷驥环(5.6)戊内酯-14化合物。命名为黑蚁素 A-2(/?办rAadzsic/e d-2)。
[0015] 表2:化合物2的1H NMR和13C NMR数据归属
[4] ff. Hexz, P. S. Kalyanaraman and G. Rama Krishnan. J. Org. Chem. 1977， 42,2265. 抗菌活性试验： 本实验得到的大环内酯倍半萜骨架的化合物的抗菌活性实验的抑菌圈的大小及最小 抑菌浓度MI C值的大小如下表所示： 表3:黑蚁素 A(Poi/rAacAzsic/e d-2)最小抑菌浓度(MIC)值的测定
从表3的最小抑菌浓度MIC值测定结果可知，Polyrhachzside A-1抗枯草菌的最小抑菌 浓度MIC为156此/11^、抗金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度MIC为78狀/11^、抗大肠杆菌的最 小抑菌浓度MIC为78yg/mL、抗绿脓杆菌的最小抑菌浓度MIC为156yg/mL。
[0016] 表4:黑蚁素 A-2(Polyrhachzside A-2)。最小抑菌浓度(MIC)值的测定
从表4的最小抑菌浓度MIC值测定结果可知，Polyrhachzside A-2抗枯草杆菌的最小抑 菌浓度MIC为78狀/11^、抗金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度MIC为78狀/11^、抗大肠杆菌的最 小抑菌浓度MIC为78yg/mL、抗绿脓杆菌的最小抑菌浓度MIC为78yg/mL。
[0017] 为使本发明的内容更明显易懂，以下结合具体实施例，对本发明进行详细描述。
[0018] 实施例1: 一种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料1.5kg，清洗表面泥渍及除去存放处理用无机盐，清洗干净后放 入45°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量5倍的二氯甲烷溶剂室温冷浸，48h后过滤， 将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量5倍的二氯甲烷重复提取，过滤，分别收集滤液和 滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤三、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为60 %的甲醇 溶液室温冷浸提取48h后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为60 %甲醇 溶液室温冷浸提取，重复上述操作若干次，直至滤液中全部为质量百分比为60 %甲醇溶液， 合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁60 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-10°C冰箱中冷 冻至结冰状，取出再放置于冷冻干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑蚁的60%甲醇 浸膏，甲醇浸膏密封后放置于_80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤三得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用硅胶拌样后，利用湿法上 柱，进行柱色谱分离;取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用7倍柱体积的乙酸乙酯洗脱， 收集乙酸乙酯馏分，合并浓缩后得到乙酸乙酯提取浸膏，备用； 取上述黑蚁的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油醚-乙酸乙酯溶液 进行梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯洗脱液的梯度比例依次为10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分别收集馏分，TLC检测合并相同馏分，得到不同馏分段共8个组分； 取梯度比例为8:2的石油醚-乙酸乙酯馏分段，进一步通过S印hadex LH-20凝胶色谱进 行纯化，流动相采用摩尔比例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为〇.3ml/min，收集合 并馏分，经过TLC分析，分别得到化合物1和化合物2，即大环内酯倍半萜骨架化合物。
[0019] 实施例2: 一种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料2.5kg，清洗表面泥渍及除去存放处理用无机盐，清洗干净后放 入50°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量7倍的二氯甲烷溶剂室温冷浸，49h后过滤， 将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量7倍的二氯甲烷重复提取，过滤，分别收集滤液和 滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤三、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为70 %的甲醇 溶液室温冷浸提取49h后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为70 %甲醇 溶液室温冷浸提取，重复上述操作若干次，直至滤液中全部为质量百分比为70 %甲醇溶液， 合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁70 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于_15°C冰箱中冷 冻至结冰状，取出再放置于冷冻干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑蚁的7%甲醇 浸膏，甲醇浸膏密封后放置于_80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤三得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用硅胶拌样后，利用湿法上 柱，进行柱色谱分离；取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用10倍柱体积的乙酸乙酯洗 脱，收集乙酸乙酯馏分，合并浓缩后得到乙酸乙酯提取浸膏，备用； 取上述黑蚁的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油醚-乙酸乙酯溶液 进行梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯洗脱液的梯度比例依次为10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分别收集馏分，TLC检测合并相同馏分，得到不同馏分段共8个组分； 取梯度比例为8:2的石油醚-乙酸乙酯馏分段，进一步通过S印hadex LH-20凝胶色谱进 行纯化，流动相采用摩尔比例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为〇.3ml/min，收集合 并馏分，经过TLC分析，分别得到化合物1和化合物2，即大环内酯倍半萜骨架化合物。
[0020] 实施例3: 一种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法，包括以下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料3kg，清洗表面泥渍及除去存放处理用无机盐，清洗干净后放入 50°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量10倍的二氯甲烷溶剂室温冷浸，50h后过 滤，将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量10倍的二氯甲烷重复提取，过滤，分别收集滤 液和滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤三、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为80 %的甲醇 溶液室温冷浸提取50h后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为80 %甲醇 溶液室温冷浸提取，重复上述操作若干次，直至滤液中全部为质量百分比为80 %甲醇溶液， 合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁80 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-20°C冰箱中冷 冻至结冰状，取出再放置于冷冻干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑蚁的80%甲醇 浸膏，甲醇浸膏密封后放置于_80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤三得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用硅胶拌样后，利用湿法上 柱，进行柱色谱分离；取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用10倍柱体积的乙酸乙酯洗 脱，收集乙酸乙酯馏分，合并浓缩后得到乙酸乙酯提取浸膏，备用； 取上述黑蚁的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油醚-乙酸乙酯溶液 进行梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯洗脱液的梯度比例依次为10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分别收集馏分，TLC检测合并相同馏分，得到不同馏分段共8个组分； 取梯度比例为8:2的石油醚-乙酸乙酯馏分段，进一步通过S印hadex LH-20凝胶色谱进 行纯化，流动相采用摩尔比例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为〇.3ml/min，收集合 并馏分，经过TLC分析，分别得到化合物1和化合物2，即大环内酯倍半萜骨架化合物。
【主权项】
1. 黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法，其特征在于：黑蚁原材料先经二氯 甲烷溶剂室温冷浸提取后得到黑蚁滤渣，再将黑蚁滤渣采用质量百分比为60-80 %甲醇溶 液室温冷浸提取，提取后的甲醇浓缩液经冷冻干燥处理得甲醇浸膏，然后甲醇浸膏先后经 过乙酸乙酯溶液、石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱后，得到的馏分经进一步分离纯化最终提 取出2个化合物，即大环内酯倍半萜骨架化合物。2. 如权利要求1所述的黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法，其特征在于:包 括以下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料，清洗干净后放入45-50Γ烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑 蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量5-10倍的二氯甲烷溶剂室温冷浸，48-50h 后过滤，将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量5-10倍的二氯甲烷重复提取，过滤，分别 收集滤液和滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤三、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为60-80 %的甲 醇溶液室温冷浸提取48-50h后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为60-80 %甲醇溶液室温冷浸提取，重复上述操作若干次，合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁 60-80 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-10-20°C冰箱中冷冻至结冰状，取出再放置于冷冻 干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑蚁的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤三得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，采用柱色谱法进行分离，先 用乙酸乙酯洗脱后，再将洗脱得到的馏分用石油醚-乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，洗脱得 到的馏分经进一步纯化得到化合物1和化合物2,即大环内酯倍半萜骨架化合物，结构式如 下：化合物1; 化合物2。3. 如权利要求2所述的一种黑蚁中大环内酯倍半萜骨架化合物的提取方法，其特征在 于:步骤四所述的分离提纯的具体步骤为:将步骤三得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解 后，用硅胶拌样后，利用湿法上柱，进行柱色谱分离;取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样， 用7-10倍柱体积的乙酸乙酯洗脱，收集乙酸乙酯馏分，合并浓缩后得到乙酸乙酯提取浸膏， 备用； 取上述黑蚁的乙酸乙酯提取浸膏用乙酸乙酯溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油醚-乙酸乙酯溶液 进行梯度洗脱，石油醚-乙酸乙酯洗脱液的梯度比例依次为10:1、8: 2、6:4、4:6、2: 8、1:10和 〇: 10，分别收集馏分，TLC检测合并相同馏分，得到不同馏分段共8个组分； 取梯度比例为8:2的石油醚-乙酸乙酯馏分段，进一步通过Sephadex LH-20凝胶色谱进 行纯化，收集合并馏分，经过TLC分析，分别得到化合物1和化合物2。4. 如权利要求3所述的一种黑蚁中含氮化合物的提取方法，其特征在于:梯度比例为8: 2的石油醚-乙酸乙酯馏分段进行Sephadex LH-20凝胶色谱纯化过程中，流动相采用摩尔比 例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为〇.3ml/min。
【文档编号】A61P31/04GK106008428SQ201610346184
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】尹卫平, 李海迪, 高嘉屿, 刘坤, 刘华清
【申请人】河南科技大学