一种新的二萜类化合物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的二萜类化合物及其制备方法。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的二萜类化合物，可以从灯心草的干燥茎髓中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能够有效抑制HepG2细胞的生长增殖，且降低程度与化合物(Ⅰ)浓度呈现一定的剂量效应趋势，可以用来开发成治疗肝癌的药物。本发明化合物(Ⅰ)体外试验证明该化合物能够有效抑制HepG2细胞的生长增殖，且降低程度与化合物(Ⅰ)浓度呈现一定的剂量效应趋势，可以用来开发成治疗肝癌的药物。而且本发明化合物(Ⅰ)用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用，作为药物时，可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者，因此其应用范围较广。
【专利说明】
一种新的二萜类化合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从灯心草的干燥茎髓中分离得到的一种新的 二萜类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 灯心草别名灯芯草、灯草，为灯心草科植物灯心草Juncuse ffusus L.的干燥茎 髓。夏末至秋季割取茎，晒干，取出茎髓，理直，扎成小把。为多年生稀一年生草本，主产于江 苏、福建、四川、贵州、云南，通常生长在草甸、沼泽、水边及阴湿的环境中。味甘、淡，性微寒， 归心、肺、小肠经，是治疗心烦少眠、高热口渴、尿少涩痛、小儿疳积、口舌生疮等症的传统药 物。
[0003] 各国学者对灯心草属植物的化学成分进行了一系列研究，发现其化学成分比较复 杂，主要含二萜类、三萜类、苯并香豆素类、留类化合物，此外还含有黄酮类、糖类及苷类等 化合物。
[0004] 灯心草属植物在中国和日本都有悠久的药用历史，被收录于很多医药学著作。灯 心草属植物中大部分化合物为具有二氢菲和菲母核的二萜类化合物，并且都具有酚羟基， 因此许多化合物都具有较好的生物活性。灯心草具有抗藻活性、抗菌活性、抗湿疹活性、抗 氧化活性、抗病毒活性、镇静作用等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种新的二萜类化合物及其制备方法，该二萜类化合物从灯 心草的干燥茎髓中分离得到。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] -种新的二萜类化合物，具有下述结构式的化合物(I)，
[0008]
[0009] ( I) p
[0010] 所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)灯心草的干燥茎髓粉碎，用 75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和 的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙 酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱12个柱体 积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱物 浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1 和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0011] 进一步地，步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0012]进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0013] -种药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可 接受的载体。
[0014] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0015] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0017]本发明化合物（I)经体外试验证明该化合物（I)能够有效抑制HepG2细胞的生长增 殖，且降低程度与化合物（I)浓度呈现一定的剂量效应趋势，可以用来开发成治疗肝癌的药 物。而且本发明化合物(I)用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用，作为 药物时，可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者，因此其应用范围较广。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物(I)结构式；
[0019] 图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较；
[0020] 图3化合物（I)对HepG2及L02细胞增殖的影响(η = 3)。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0022]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0023] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0024] 制备方法：（a)将灯心草的干燥茎髓（8kg)粉碎，用80 %乙醇热回流提取（25L X 3 次），合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱 和的正丁醇(3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(363g)和正丁醇萃取 物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积， 再用75%乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏 (145g);(c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体 积）、50:1 (8个柱体积）、30:1 (6个柱体积）、15 :1 (8个柱体积)和1:1 (5个柱体积）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(47g)用正相硅胶进一步分离，依次用 体积比为20:1(8个柱体积）、15:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2(26g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百 分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯 的化合物（I)(39mg)。
[0025] 结构确证:册431]\^显示[]\1+他]+为111/2 483.1612，结合核磁特征可得分子式为 〇24112809，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据511( ??111，0130-(16,6001〇^):!1-1(5.03，(1，了 = 4.9)，H-2(4.47，br，d，J=4.9)，H-3(4.03，br，s)，H-5(2.77，s)，H-7(5.75，s)，H-9(2.88， s)，H-12(5.38，s)，H-14(2.61，d，J=16.0)，H-14(2.18，d，J=16.0)，H-15(5.81，dd，J = 17.8，11.2)，H-16(5.16，d，J=11.2)，H-16(4.98，d，J=17.8)，H-17(1.03，s)，H-19(1.43， s)，H-20(1 · 01，s)，2-0Ac(2 · 16，s)，12-0Ac(1 · 97，s);核磁共振碳谱数据δ。（ppm，DMS〇-d6， 150MHz):80.1(CH，1-C)，75.2(CH，2-C)，76.6(CH，3-C)，46.0(C，4-C)，57.1(CH，5-C)，194.0 (C，6-C)，125.8(CH，7-C)，155.9(C，8-C)，45.6(CH，9-C)，41.1(C，10-C)，201.1(C，11-C)， 86.6(CH，12-C)，40.6(C，13-C)，43.0(CH2，14-C)，139.8(CH，15-C)，116.0(CH2，16-C)，20.1 (CH 3，17-C)，175.2(C，18-C)，16.9(CH3，19-C)，20.1(CH3,20-C)，169.3(C，2-0Ac)，25.1 (〇1 3,2-(^)，170.1((：，12-(^)，25.3(〇13，12-(^);碳原子标记参见图1。红外光谱表明该 化合物含有羟基（3437CHT 1)和羰基（1758(31^1)基团。4和13C匪R谱表明该化合物含有两个 酮羰基(一个为不饱和酮羰基），一个酯羰基，两个乙酰氧基，单取代和三取代双键。此外，典 型的乙烯基[双二重峰5!15.81(了=17.8，11.2!^，!1-15)，两个双峰5!15.16(了=11.2!^，!1-16)，4.98(了=17.8他，!1-16)和3(：139.8((：-15)，116.0((：-16)和20.1((：-17)]和偕甲基[3 町.03(8，1^-17)]信号表明该化合物为二萜类化合物。腿8(：谱中，(：-13与16-17 ;(：-15与!1-12，H-16b，H2-14和Me-17;C-17与H-12，H2-14，H-15和H 2-16的相关性表明乙烯基和偕甲基位 于C-130C4O.6)位上。HMBC谱中C-18与Η-1，Η-3，Η-5和Me-19,以及C-1 与H-2和H-3的相关性 表明C-1和C-18之间存在内酯环。另外，C-18和Me-19与C-40C46.O)相连，HMBC谱中的C-4和 Me-19的耦合证实了上述结论。通过HMBC谱中C-6与H-5和H-14b;C-7与H-9和H2-14;C-8与H-9和 H2-14 的相关性可知α，β-不饱和酮基结构[SC194.0(C-6)，125.8(C-7MP155.9(C-8)W 及SH5.75(s，H-7)]位于C-5和C-9之间。HMBC谱中氢质子信号0!14.47，1^，(1，1 = 4.9泡和 5.38,8)与相应羰基碳0(：169.3和17〇.1)的相关性，表明(：-2和(：-12位分别连有一个乙酰氧 基。N0ESY谱中，H-1和Me-20的相关性表明它们为α取向；H-3与H-2和]^-19，]\^-19与!1-5的相 关性，表明它们为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数 据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基 本一致(图2)。
[0026]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0027] 一、材料和仪器
[0028] HepG2人肝癌细胞株购自中科院生物化学与细胞生物学研究所。L02正常人肝细胞 株由复旦大学中山医院肝癌研究所馈赠。化合物（I)自制，HPLC归一化纯度大于98% APMI-1640培养基、胰酶购自Gibco公司。标准小牛血清购自Biowest公司。3-(4,5-二甲基噻挫- 2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMS0)、台盼蓝(TrypanBLue)、二氯荧光素双 醋酸盐(DCFH-DA)均购自上海国药集团化学试剂有限公司。其他常用试剂均为分析纯。 [0029] 微量天平(瑞士梅特勒-托利多，METTLRERAE2000)。普通台式离心机(上海安亭科 学仪器厂）。数显电热恒温水浴箱(上海跃进医疗机械厂，HH.W21.600S)。二氧化碳细胞培养 箱(美国FormaScientif ic公司）。高速冷冻离心机(美国Thermo公司，IECMICROMAXRF)。超微 量紫外分光光度计(美国ThermoHsher公司，NanoDrop-1000)。紫外成像系统(上海复日科技 有限公司，FR-200A)。酶联免疫检测仪，荧光分光光度计(HitachiF2500)。
[0030] 二、试验方法
[0031] 1、细胞培养
[0032] 将细胞常规接种于含10% (体积分数)小牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37°C、 5 % C02浓度的培养箱中培养。
[0033] 2、化合物（I)干预培养液的配置
[0034] 将45.44mg化合物（I)溶于10mL二甲基亚砜(DMS0)制得储备液并分别稀释2倍、4 倍，分别得到2mmo 1 /L、4mmo 1 /L及8mmo 1 /L的化合物（I)应用液。进行细胞干预前，将5 OyL应 用液与4950yL常规培养液(含10%体积分数的小牛血清)充分混合，得到化合物（I)干预培 养液(2〇4111〇1/1^、4(^1]1〇1/1^、8(^1]1〇1/1^)。
[0035] 3、MTT法检测细胞存活率
[0036]取对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔200yL(5X103细胞）。培养12h待细胞 贴壁后，弃去原培养液，加入200此不同浓度的化合物（I)培养液(DMS0溶解化合物（I)后以 1 %体积分数与常规培养液混合，使化合物（I)终浓度为20μπι〇 1/L、40μπι〇 1/L、80μπι〇 1/L)，每 组6个平行孔。同时设6个溶剂(DMS0)对照孔。培养24h、48h、72h，每24小时更换化合物（I)干 预培养液。干预结束后，吸去培养液，向各孔加入20yLMTT溶液，37 °C孵育4h后吸去各孔上清 液，加入150yL DMS0，置摇床上低速震荡10min，待结晶充分溶解后，以DMS0调零，用酶联免 疫检测仪在490nm处测定各孔吸光度，计算细胞存活率（survival rate，SR)。SR =实验组 A49〇/对照组 A49QX100%
[0037] 4、台盼蓝染色測定存活细胞数
[0038] 将相同数量(2 X106)的细胞接种于细胞培养瓶，培养一段时间待细胞贴壁后，弃 去培养液，用洗细胞两遍后，加入5mL的化合物（I)干预培养液(20ym 〇l/L、40ym〇l/L、80y mol/L)。每组三瓶细胞，同时设立三瓶溶剂(DMS0)对照。培养48h后，用0.25 %胰酶消化细 胞，收集细胞悬液，台盼蓝染色测定细胞数。
[0039] 5、DCFH-DA法测定细胞内R0S活性
[0040]将相同数量(2 X106)的细胞接种于细胞培养瓶，培养一段时间待细胞贴壁后，吸 去原培养液，加入5mL化合物（I)干预培养液，继续培养48h后，弃去培养液，胰酶消化细胞， 收集细胞悬液于1.5mL EP管中，1500rpm离心5min，弃上清，向沉淀中加入lmL DCFH-DA，吹 打混匀，37°C孵育30min，加入roS终止反应，离心收集沉淀并溶解于lmL PBS，吹打成均匀细 胞悬液，用Hitachi-F2500焚光分光光度计测定荧光值。激发波长488nm，发射波长525nm。
[0041 ]三、结果及结论
[0042] 1、细胞生长存活率
[0043] HepG2细胞经化合物（I)干预培养24h、48h、72h后，低、中、高剂量组的细胞存活率 均显著低于溶剂对照组(P〈〇.05)，且细胞存活率下降的程度与化合物（I)干预浓度之间存 在一定剂量效应趋势(表1，aP〈〇. 05VS对照组;bP〈0.05VS低剂量组;eP〈0.05VS中剂量组）。在 同一化合物（I)干预浓度下，细胞存活率随着干预时间的增加而呈现下降的趋势。而同等条 件下，L02人正常肝细胞经化合物（I)干预后，细胞存活率无显著变化(表2)。台盼蓝染色细 胞计数结果与MTT-致(图3， aP〈0.05VS对照组;bP〈0.05VS低剂量组;CP〈0.05VS中剂量组）。 [0044] 2、细胞内R0S活性
[0045] HepG2人肝癌细胞经不同浓度化合物（I)干预后，与对照组相比，细胞内R0S水平显 著下降(p〈0.05)。结果见表3(aP〈0.05VS对照组;bP〈0.05VS低剂量组）。
[0046] 结论，采用不同浓度的化合物（I)对人肝癌细胞HepG2进行干预处理，经MTT比色及 台盼蓝染色细胞计数表明，化合物（I)能够有效抑制HepG2细胞的生长增殖，干预组细胞的 存活率较对照组显著降低，且降低程度与化合物（I)浓度呈现一定的剂量效应趋势，同时在 同一化合物（I)浓度下，细胞存活率随着干预时间的增加而呈现持续降低的趋势。与此同 时，相同剂量的化合物（I)干预对L02正常肝细胞并不产生抑制作用。
[0047] 表1化合物（I)对HepG2细胞生长存活率的影响(X土s，n = 6)
[0048]
[0049] 表2化合物（I)对L02细胞生长存活率的影响(X土s，n = 6)
[0050]
[0051 ] 表3化合物（I)对HepG2细胞R0S水平的影响（X 土 s，η = 6)
[0052] _
[0053] 实施例3
[0054] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0055] 实施例4
[0056] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服 液。
[0057] 实施例5
[0058] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0059] 实施例6
[0060] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0061 ] 实施例7
[0062] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0063] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种新的二萜类化合物，其特征在于，具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含以下操作步骤：（a)将灯 心草的干燥茎髓粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石 油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇 萃取物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再 用75%乙醇洗脱12个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c) 步骤(b)中75 %乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离， 依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组 分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗脱， 收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，用80%乙醇 热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化 合物(I)和药学上可接受的载体。
【文档编号】A61K31/366GK106008543SQ201610356780
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】董秋月
【申请人】杭州更蓝生物科技有限公司