一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rk3的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rk3的方法，该方法包括将三醇组人参皂苷溶解在发酵罐的去离子水中，通N2保护后在线灭菌，然后加有机酸溶液，和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O40·nH2O催化剂，其中Y选自P、Si、Fe或Zn，x为3或4，n为0?30的正整数，N2保护恒温恒压进行定向转化反应，最后收集反应产物进行纯化即可得到高纯度的人参皂苷Rk3。所得的在线灭菌条件为121℃，维持20min，在线灭菌前通N2保护，添加的有机酸为乳酸、苹果酸、柠檬酸、α?酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸或丙酮酸中的一种或几种的组合。本发明工艺简单易行，副反应少，产物纯度高，易于工业化生产。
【专利说明】 一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rk3的
方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rk3的方法，属于生物化工领域。
【背景技术】
[0002]人参的化学成分复杂，含有纤维素、皂苷、挥发油、糖类、蛋白质、维生素等。现代医学和药理学研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成分，它能代表人参的主要生理活性。人参皂苷(ginsenoside)是人参的主要有效成分，现在已经研究发现的人参皂苷已经超过50种。其中近些年研究最多且与肿瘤细胞凋亡相关的为人参皂苷Rg3与人参皂苷Rh2。这两种人参皂苷具有一定的抗肿瘤活性，对正常细胞基本无毒，与其他化疗药物(如顺铂、吉非替尼等)联合应用有协同减毒作用。人参皂苷通过调控肿瘤细胞增殖周期、诱导细胞分化和凋亡来发挥抗肿瘤作用。将肿瘤细胞诱导分化成正常细胞有利于控制肿瘤发展，诱导肿瘤细胞凋亡使细胞解体后形成凋亡小体，不引起周围组织炎症反应。
[0003]人参皂苷可通过五加科植物人参、西洋参、三七、假人参、姜状三七、竹节参等植物提取获得。日本学者北川勋于1980年开始陆续从人参中提取得到了人参皂苷20(R)-Rg3、人参皂苷Rh2，并发现对多种肿瘤细胞有明显的抑制作用。根据目前对人参皂苷系列化合物的研究结果来看，天然的植物提取物中的人参皂苷上携带的糖苷一般都有3?5个，而随着糖苷数量的减少，抗癌活性逐渐增强，我们联想到人参皂苷Rk3等多种去除一定数量糖苷的人参皂苷都会有良好的抗癌效果，经过我们对人生皂苷相关专利的检索，查询到专利CN103193846 A发明了一种人参皂苷Rk3和人参皂苷Rh4顺反异构体的制备方法，涉及人参皂苷Rk3与人参皂苷Rh4顺反异构体的分离方法，产量也仅仅达到毫克级水平，尚未发现有以三醇组人参皂苷为原料定向转化大规模生产人参皂苷Rk3方法，主要原因是目前人参皂苷去除糖苷的工艺中很多都要引入强酸、强碱，反应控制较为困难，副反应较多，对于人参皂苷母环的破坏也比较严重，造成除了目标产物之外的副产物较多，一方面转化后的收率很低，另一方面给后期的纯化造成了很大的困难，工业化成本较高，对于后期的产品开发带来困难，缺乏竞争力。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rk3的方法。
[0005]本发明的实现过程如下:
一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rk3的方法，包括如下步骤:在发酵罐中，将三醇组人参皂苷溶解于去离子水中，通^保护后在线灭菌，然后加有机酸溶液和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O4Q.nifeO催化剂，其中Y选自P、S1、Fe或Zn，x为3或4，η为0-30的正整数，在80?105°C下反应24?48h，然后经沉淀、洗涤、干燥得到目标产物。
[0006]所述的醇组人参皂苷选自人参皂苷Rgl、人参皂苷Re、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rf、人参皂苷Rhl。
[0007]所述的醇组人参皂苷的纯度大于80%，浓度为50?300g/L之间。
[0008]所述的发酵罐装水量不大于发酵罐有效容积的70%。
[0009]所述的灭菌条件为121°C，维持20min，且加热前通N2进行保护。
[0010]所述N2流速为发酵罐有效容积量的50%/min?200%/min，时间Imin?5min。
[0011]所述的有机酸选自乳酸、苹果酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸、丙酮酸，反应体系中所用的有机酸的浓度为0.01?0.1moI/L。
[0012]所述发酵罐的转速为50rpm?200rpm。
[0013]上述方法制备的目标产物可以利用工业化色谱柱对目标产物精制纯化。
[0014]利用上述方法合成的人参皂苷Rk3原料药制成硬胶囊、软胶囊、片剂、冲剂、滴丸或注射剂。
[0015]本发明的积极效果:本发明综合使用有机酸和杂多酸催化剂，催化效果得到大大提升;本发明采用相对温和的有机酸在生物反应器中的稳定条件下定向转化得到人参皂苷Rk3，将水溶性良好的三醇组人参皂苷定向转化为水溶性差的人参皂苷Rk3，转化率高，收率高，后期精制纯化工艺简单，生产成本低，有利于工业化生产，可显著提高原料药及成品药的市场竞争力。
【附图说明】
[0016]图1为人参皂苷Rgl转化为人参皂苷Rk3的示意图；
图2为人参皂苷Rk3标准品的液相色谱图；
图3为本发明方法生产得到人参皂苷Rk3的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0017]下面给出的实施例，是为了便于理解本发明。并不以任何方式限定本发明的权利要求和核心内容。
[0018]实施例1
将有效容积为100L的全自动发酵罐中加入65L的去离子水，然后加入3500g纯度为85%的人参皂苷Re(杂质为其他类型的人参皂苷及多糖)，通他，通气流量为50L/min，持续5min，然后停止通气开始加热在线灭菌，灭菌条件为121°C，维持20min。降温至105°C以下后，补加浓度为0.15moVL的无菌柠檬酸溶液5L和1g杂多酸H3PW12O4Q.5H20，然后加热发酵罐内液体至105°C并维持24h，同时保持搅拌转速为300rpm，反应结束后将所有液体放出于容器中静置12h，弃上清，将剩余底部含有沉淀的液体约6L离心弃上清，收集沉淀物并烘干，得到人参皂苷Rk3粗品约1940g，HPLC检测人参皂苷Rk3的纯度为94.6%。
[0019]对比实例:与上述制备方法类似，不同的是仅使用有机酸或杂多酸，人参皂苷Rk3粗品仅能得到不足1500g。
[0020]实施例2
将有效容积为500L的全自动发酵罐中加入300L的去离子水，然后加入90kg纯度为95%的人参皂苷Rgl(杂质为其他类型的人参皂苷及多糖)，通％，通气流量为350L/min，持续4min，然后停止通气开始在线灭菌，灭菌条件为121°C，维持20min。降温至90°C以下后，补加浓度为〇.6mol/L的无菌苹果酸溶液25L，浓度为0.8mol/L的无菌丁二酸溶液5L和20g杂多酸 H4SiW12〇4〇 ? 25H20,然后加热发酵罐至80°C并维持48h，同时保持搅拌转速为lOOrpm，反应结束后将所有液体放出静置于容器中24h，弃上清，底部约有100L固液混合物，再加入100L去离子水洗涤一次，再静置24h后弃上清，将底部混合物搅拌均匀后离心弃上清，收集沉淀物并烘干，得到人参皂苷Rk3粗品约65kg，HPLC检测人参皂苷Rk3的纯度为94.9%。[〇〇21]实施例3将有效容积为200L的全自动发酵罐中加入120L的去离子水，然后加入28kg纯度为90% 的人参皂苷Rhl(杂质为其他类型的人参皂苷及多糖)，通仏，通气流量为200L/min，持续 3min，然后停止通气开始在线灭菌，灭菌条件为121°C，维持20min。降温至100°C以下后，补加浓度为〇.2mol/L的无菌苹果酸溶液10L，浓度为0.2mol/L的a-酮戊二酸溶液10L，乳酸 225mL和50g杂多酸H3FeW12〇4〇 ? 30H20，然后加热发酵罐至95 °C并维持36h，同时保持搅拌转速为50rpm，反应结束后将所有液体放出在容器中静置24h，弃上清，将剩余底部含有沉淀的液体约40L离心弃上清，再加入40L去离子水洗涤一次，再静置24h后弃上清，将底部混合物搅拌均匀后离心弃上清，收集沉淀物并烘干，得到人参皂苷Rk3粗品约25kg，HPLC检测人参皂苷Rk3的纯度为93.8%。[〇〇22]实施例4将有效容积为50L的全自动发酵罐中加入30L的去离子水，然后加入10.5kg含量为90% 的三醇组人参皂苷(其中人参皂苷Rgl为8kg，人参皂苷Re为2.5kg，杂质为其他类型的人参皂苷及多糖)，通N2,通气流量为150L/min，持续lmin，然后停止通气开始在线灭菌，灭菌条件为121°C，维持20min。降温至100°C以下后，补加浓度为0.7mol/L的无菌反丁烯酸溶液5L 和20g杂多酸H3ZnW12〇4〇 ? 15H20,然后加热发酵罐至100°C并维持30h，同时保持搅拌转速为 200rpm，反应结束后将所有液体放出在容器中静置24h，弃上清，将剩余底部含有沉淀的液体约35L离心弃上清，再加入10L去离子水洗涤一次，再静置24h后弃上清，将底部混合物搅拌均匀后离心弃上清，收集沉淀物并烘干，得到人参皂苷Rk3粗品约7.5kg，HPLC检测人参皂苷1^3的纯度为95.6%。
【主权项】
1.一种利用三醇组人参皂苷大规模转化生产人参皂苷Rk3的方法，其特征在于:在发酵罐中，将三醇组人参皂苷溶解于去离子水中，通犯保护后在线灭菌，然后加有机酸溶液和催化量的Keggin结构的杂多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化剂，其中Y选自P、S1、Fe或Zn，x为3或4，n为0-30的正整数，在80?105°C下反应24?48h，然后经沉淀、洗涤、干燥得到目标产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的醇组人参皂苷选自人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rf、人参皂苷Rhl。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述的醇组人参皂苷的纯度大于80%，浓度为50?300g/L之间。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的发酵罐装水量不大于发酵罐有效容积的70%。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的灭菌条件为121°C，维持20min，且加热前通N2进行保护。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:N2流速为发酵罐有效容积量的50%/min?200%/min，时间 Imin?5min。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的有机酸选自乳酸、苹果酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸、丙酮酸，反应体系中所用的有机酸的浓度为0.01 -0.1mol/L08.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述发酵罐的转速为50rpm?200rpm。9.根据权利要求1至8所述的方法，其特征在于:利用工业化色谱柱对目标产物精制纯化。10.利用权利要求1所述方法合成的人参皂苷Rk3原料药制成硬胶囊、软胶囊、片剂、冲剂、滴丸或注射剂。
【文档编号】A61K31/704GK106008644SQ201610346366
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】范代娣, 惠俊峰, 段志广, 马沛, 李伟娜, 米钰, 朱晨辉, 马晓轩
【申请人】西北大学