一种谷胱甘肽的高效分离纯化方法
【专利摘要】本发明提供了一种谷胱甘肽的高效分离纯化方法，主要包括以下步骤：制备GSCu沉淀并稀释，加入硫化物生成Cu2S沉淀并置换出谷胱甘肽，离心，压滤或微滤，树脂纯化，减压浓缩，结晶，真空干燥。该谷胱甘肽的高效分离纯化方法将铜盐沉淀法与树脂纯化法有效地结合，最大限度地降低谷胱甘肽在提取过程的损失和变性，尽可能地排除杂质的干扰；操作简单，易于控制，处理周期短，能耗低，特别适合用于工业化生产。因此，本发明所提供的谷胱甘肽的高效分离纯化方法具有良好的应用前景与市场潜力。
【专利说明】
一种谷胱甘肽的高效分离纯化方法
技术领域
[0001]本发明属于生物化工领域，具体涉及一种谷胱甘肽的高效分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]谷胱甘肽(Glutath1ne，GSH)，全称γ_L_谷氨酸_L_半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的含巯基的生物活性三肽化合物，是生物体内重要的非蛋白巯基化合物之一。
[0003]谷胱甘肽普遍存在于动植物细胞和微生物中，尤其在酵母、小麦胚芽以及人和动物肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体中含量较为丰富。它主要以还原型(GSH)和氧化型(GSSH)两种形态存在，其中在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽，本发明中提及的谷胱甘肽均是指还原型的谷胱甘肽。谷胱甘肽具有多种生理功能，尤以抗氧化和整合解毒作用最为突出，同时谷胱甘肽在细胞增殖、凋亡、成纤维过程中也扮演着重要角色。随着研究的不断深入，谷胱甘肽在临床医学、保健品、食品添加剂以及动物饲料等方面的应用正引起广泛的关注，市场前景需求量正日益加大。
[0004]然而，国内生产谷胱甘肽的工艺还不够成熟，其发展瓶颈主要在于发酵水平低下，后续提纯工艺收率低，因而所得产品纯度低、质量差、成本高。解决上述问题对实现我国GSH大规模产业化，改变GSH原料依赖进口的尴尬局面并推动我国医学工业、保健行业和食品工业的发展有着十分重要的意义，同时具有良好的经济效益和社会效益。
[0005]随着发酵工艺条件的优化及其菌种选育的多种方法的发展，发酵法已经成为国内外生产谷胱甘肽最普遍的方法，然而未能有效实现低成本、高收率、高纯度地从发酵液获得谷胱甘肽一直是谷胱甘肽产业化的障碍，也日益成为研究的热点之一。
[0006]现有技术中，已报道的关于从发酵液中提纯分离出GSH的方法主要有:铜盐法、离子交换法、亲和层析法、双水相萃取、反胶束萃取等。其中，铜盐法作为一种传统的提取方法，选择性强，收率高且易于操作，有很强的实用价值;然而，在操作过程中，容易引入杂质而造成产品纯度不高。离子交换法也是一种提纯GSH的常用手段，但是，所用填料成本偏高且使用寿命偏短，生产周期长且废水处理量大，因而在工业生产中常被限制。其中，亲和层析法是一种有效分离GSH的方法，但含汞树脂稳定性差且易泄露，因此不宜在食品药品领域应用。应用双水相萃取法分离GSH，虽然效率较高，但由于双水相组成系统一般比较昂贵，生产成本高，这使得它在技术上的优势被削弱。其中，反胶束萃取谷胱甘肽是一种很有发展潜力的方法，但其工业化大规模应用还不成熟，目前还处于实验室研究阶段。
[0007]由此可见，现有技术尚未能提供一种适于工业化生产的分离纯化谷胱甘肽的方法。
【发明内容】
[0008]针对上述现有技术中存在的缺陷与不足，为了获得一种适于工业化生产的分离纯化谷胱甘肽的方法，发明人研发出一种从大肠杆菌发酵液中分离纯化谷胱甘肽的方法，其将铜盐沉淀法与树脂纯化法巧妙地有效结合，通过铜盐沉淀法提取谷胱甘肽液，利用离子交换树脂除去色素等杂志以提高纯度，再浓缩、结晶，得到纯的谷胱甘肽晶体。
[0009]因此，本发明所提供的技术方案为:
一种谷胱甘肽的高效分离纯化方法，包括以下步骤:
(1)将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀；向所述GSCu沉淀中加入纯水，充分搅拌，使GSCu沉淀悬浮液的匀浆湿重为300-500g/L;
(2)向所述GSCu沉淀悬浮液中加入硫化物，搅拌反应，生成Cu2S沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；
(3)将所述谷胱甘肽母液离心，得到含谷胱甘肽的上清液；
(4)对所述上清液进行压滤或微滤，用于除去颗粒杂质；
(5)将步骤(4)所得的滤液上样于阳离子交换树脂或大孔吸附树脂，洗涤平衡后，以解吸附溶液进行洗脱，得到谷胱甘肽溶液；
(6)将所述谷胱甘肽溶液在-0.07Mpa-O Mpa压力下且在55?65°C下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；
(7)采用乙醇溶液对谷胱甘肽浓缩液进行结晶操作，得到谷胱甘肽晶体粗品；
(8)真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到纯的谷胱甘肽晶体。
[0010]优选地，上述谷胱甘肽的高效分离纯化方法的步骤(2)中，以150?250rpm的搅拌速度进行搅拌反应45?60 min。
[0011 ]优选地，上述谷胱甘肽的高效分离纯化方法中，所述硫化物选自以下任一种:硫化氢，硫化钠，硫化钾和硫化铵。
[0012]优选地，上述谷胱甘肽的高效分离纯化方法的步骤(4)中，所述压滤或微滤采用的滤布或滤膜的孔径为0.45μπι。
[0013]优选地，上述谷胱甘肽的高效分离纯化方法中，所述阳离子交换树脂选自以下任一种:DOOl大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，HD-8大孔强酸型树脂，D-61大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂;所述大孔吸附树脂选自以下任一种:SP207大孔吸附树脂，XDA-1大孔吸附树脂，DA201-C大孔吸附树脂。
[0014]优选地，上述谷胱甘肽的高效分离纯化方法的步骤(3)中，还包括:使用盐酸或磷酸或硝酸调节所述上清液的pH至2?4。
[0015]优选地，上述谷胱甘肽的高效分离纯化方法的步骤(5)中，采用阳离子交换树脂时相应使用的解吸附溶液为氢氧化铵水溶液、氯化钠水溶液或盐酸;采用大孔吸附树脂时相应使用的解吸附溶液为乙醇水溶液。
[0016]优选地，上述谷胱甘肽的高效分离纯化方法的步骤(6)中所述的谷胱甘肽浓缩液的浓度为380?420 g/Lo
[0017]优选地，上述谷胱甘肽的高效分离纯化方法的步骤(7)为:向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55?65°C的50?60%的乙醇溶液，接着使用盐酸或磷酸或硝酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的PH至2?4，以150?250 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度65?75%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品。
[0018]优选地，上述谷胱甘肽的高效分离纯化方法的步骤(8)为:在-0.07Mpa?OMpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到纯度多98%的谷胱甘肽晶体。
[0019]由于本发明所提供的谷胱甘肽的高效分离纯化方法将铜盐沉淀法与树脂纯化法有效地结合;在铜盐沉淀阶段，利用GSH与氧化亚铜络合生成沉淀的特性完成固液分离，从而除去大部分的蛋白质和盐分，初步浓缩提纯了 GSH，利于下一步的树脂纯化;在树脂纯化阶段，由于蛋白质和盐分等干扰成分的减少，提高了树脂对GSH的吸附量，从而进一步提高了生产效率。因此，本发明所提供的谷胱甘肽的高效分离纯化方法充分利用两者的优点，解决了谷胱甘肽不易于大规模工业化生产的技术问题;此外，所述分离纯化方法操作简单，易于控制，处理周期短，能耗低，因而生产成本低，特别适合用于工业化生产。因此，本发明所提供的谷胱甘肽的高效分离纯化方法具有良好的应用前景与市场潜力。
【具体实施方式】
[0020]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。
[0021]第一方面，本发明提供了一种谷胱甘肽的高效分离纯化方法，包括以下步骤:
(1)将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀；向所述GSCu沉淀中加入纯水，充分搅拌，使GSCu沉淀悬浮液的匀浆湿重为300-500g/L;
(2)向所述GSCu沉淀悬浮液中加入硫化物，搅拌反应，生成Cu2S沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；
(3)将所述谷胱甘肽母液离心，得到含谷胱甘肽的上清液；
(4)对所述上清液进行压滤或微滤，用于除去颗粒杂质；
(5)将步骤(4)所得的滤液上样于阳离子交换树脂或大孔吸附树脂，洗涤平衡后，以解吸附溶液进行洗脱，得到谷胱甘肽溶液；
(6)将所述谷胱甘肽溶液在-0.07Mpa-O Mpa压力下且在55?65°C下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液；
(7)采用乙醇溶液对谷胱甘肽浓缩液进行结晶操作，得到谷胱甘肽晶体粗品；
(8)真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到纯的谷胱甘肽晶体。
[0022]在一个优选实施例中，步骤(2)中，以150?250 rpm的搅拌速度进行搅拌反应45?60
mino
[0023]在一个优选实施例中，所述硫化物选自以下任一种:硫化氢，硫化钠，硫化钾和硫化铵。
[0024]在一个优选实施例中，步骤(4)中，所述压滤或微滤采用的滤布或滤膜的孔径为0.45ym0
[0025]在一个优选实施例中，所述阳离子交换树脂选自以下任一种:DOOl大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，HD-8大孔强酸型树脂，D-61大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂；所述大孔吸附树脂选自以下任一种:SP207大孔吸附树脂，XDA-1大孔吸附树脂，DA201-C大孔吸附树脂。
[0026]在一个优选实施例中，步骤(3)中，还包括:使用盐酸或磷酸或硝酸调节所述上清液的pH至2?4。
[0027]在一个优选实施例中，步骤(5)中，采用阳离子交换树脂时相应使用的解吸附溶液为氢氧化铵水溶液、氯化钠水溶液或盐酸;采用大孔吸附树脂时相应使用的解吸附溶液为乙醇水溶液。
[0028]在一个优选实施例中，步骤(6)中所述的谷胱甘肽浓缩液的浓度为380?420g/L。
[0029]在一个优选实施例中，步骤(7)为:向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55?65°C的50?60%的乙醇溶液，接着使用盐酸或磷酸或硝酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2?4，以150-250 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度65?75%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品。
[0030]在一个优选实施例中，步骤(8)为:在-0.07 Mpa~0 Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到纯度多98%的谷胱甘肽晶体。
[0031]下述谷胱甘肽的分离纯化实施例均按照本发明所提供的技术方案实施，其中所使用的试剂或原料如无特别说明均能从公开商业途径获得，所述步骤如无特别说明则均为常规处理操作。
[0032]实施例1
将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步骤进行分离纯化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入纯水，充分搅拌，定容至4L，得到GSCu沉淀悬浮液;将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中通入硫化氢，并以250 rpm的转速搅拌反应I小时，生成仏^沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液;用转速为6000 rpm离心机离心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入盐酸调节pH至3，用0.45μηι的滤膜过滤上清液除去颗粒杂质，收集滤液3.5L，上样于HD-8大孔强酸型树脂，柱体积为1.5m X 20cm，上样流速为50mL/min，洗涤平衡后，以1.5%盐酸溶液进行洗脱，洗脱流速为100mL/min，得到GSH溶液;将所述GSH溶液在-0.07 Mpa压力下且在65°C下减压浓缩，使GSH浓度达到400g/L，即制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55°C的50 %的乙醇溶液，接着使用盐酸调节pH至3，以200 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度65%的乙醇溶液洗涤2次，得到谷胱甘肽晶体粗品；最后，在-0.07 Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到174g谷胱甘肽晶体，经高效液相(HPLC)检测纯度为98.6%,总收率为72.5%。
[0033]所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下:理论值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;测量值:C 39.11%、Η 5.54%、0 31.25%。
[0034]实施例2
将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步骤进行分离纯化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入纯水，充分搅拌，定容至4L，得到GSCu沉淀悬浮液;将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中通入硫化氢，并以200 rpm的转速搅拌反应50分钟，生成Cu2S沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用转速为6000 rpm离心机离心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入磷酸调节pH至3，用0.45μηι的滤膜过滤上清液除去颗粒杂质，收集滤液3.5L，上样于DOOl大孔强酸性苯乙稀系阳离子交换树脂，柱体积为1.5m X 20cm，上样流速为50mL/min，洗涤平衡后，以2.0%盐酸溶液进行洗脱，洗脱流速为100mL/min，得到GSH溶液;将所述GSH溶液在-0.05Mpa压力下且在60 °C下减压浓缩，使GSH浓度达到400g/L，即制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至60°C的55%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节pH至3，以200 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度70%的乙醇溶液洗涤3次，得到谷胱甘肽晶体粗品；最后，在-0.07 Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到17 0.6 g谷胱甘肽晶体，经高效液相(H P L C)检测纯度为9 8.4 %，总收率为71.1%。
[0035]所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下:理论值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;测量值:C 39.07%、Η 5.57%,O 31.26%。
[0036]实施例3
将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步骤进行分离纯化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入纯水，充分搅拌，定容至4L，得到GSCu沉淀悬浮液;将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中通入硫化氢，并以150 rpm的转速搅拌反应45分钟，生成仏^沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用转速为6000 rpm离心机离心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸调节pH至2，用0.45μηι的滤膜过滤上清液除去颗粒杂质，收集滤液3.5L，上样于SP207大孔吸附树脂，柱体积为1.5m X 20cm，上样流速为50mL/min，洗涤平衡后，以20 %乙醇水溶液进行洗脱，洗脱流速为100mL/min，得到GSH溶液;将所述GSH溶液在-0.03Mpa压力下且在65 °C下减压浓缩，使GSH浓度达到400g/L，即制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至65°C的60 %的乙醇溶液，接着使用磷酸调节pH至2，以250 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度75%的乙醇溶液洗涤4次，得到谷胱甘肽晶体粗品；最后，在-0.01 Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到178.6g谷胱甘肽晶体，经高效液相(HPLC)检测纯度为98.9%，总收率为74.4%。
[0037]所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下:理论值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;测量值:C 39.09%^H 5.59%、0 31.23%。
[0038]实施例4
将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步骤进行分离纯化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入纯水，充分搅拌，定容至4L，得到GSCu沉淀悬浮液;将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中通入硫化氢，并以200 rpm的转速搅拌反应60分钟，生成Cu2S沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用转速为6000 rpm离心机离心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入磷酸调节PH至2，用0.45μπι的滤膜过滤上清液除去颗粒杂质，收集滤液3.5L，上样于SP207大孔吸附树脂，柱体积为1.5m X 20cm，上样流速为50mL/min，洗涤平衡后，以20 %乙醇水溶液进行洗脱，洗脱流速为100mL/min，得到GSH溶液;将所述GSH溶液在-0.07Mpa压力下且在65 V下减压浓缩，使GSH浓度达到400g/L，即制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55 0C的60 %的乙醇溶液，接着使用磷酸调节pH至3，以200 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度65%的乙醇溶液洗涤4次，得到谷胱甘肽晶体粗品；最后，在-0.05 Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到164.4 g谷胱甘肽晶体，经高效液相(HPLC)检测纯度为98.6%,总收率为68.5%。
[0039]所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下:理论值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;测量值:C 39.07%、Η 5.59%、0 31.25%。
[0040]实施例5
将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步骤进行分离纯化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入纯水，充分搅拌，定容至4L，得到GSCu沉淀悬浮液;将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中加入硫化钠，并以200 rpm的转速搅拌反应60分钟，生成Cu2S沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用转速为6000 rpm离心机离心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸调节pH至2，用0.45μηι的滤膜过滤上清液除去颗粒杂质，收集滤液3.5L，上样于HD-8大孔强酸型树脂，柱体积为1.5m X 20cm，上样流速为50mL/min，洗涤平衡后，以1.5%盐酸溶液进行洗脱，洗脱流速为100mL/min，得到GSH溶液;将所述GSH溶液在-0.06Mpa压力下且在55 °C下减压浓缩，使GSH浓度达到400g/L，即制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55°C的55 %的乙醇溶液，接着使用盐酸调节pH至4，以150 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度70%的乙醇溶液洗涤2次，得到谷胱甘肽晶体粗品；最后，在-0.04Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到153.8g谷胱甘肽晶体，经高效液相(HPLC)检测纯度为98.2%，总收率为64.1%。
[0041 ] 所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下:理论值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;测量值:C 39.10%、Η 5.56%、0 31.26%。
[0042]实施例6
将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步骤进行分离纯化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入纯水，充分搅拌，定容至4L，得到GSCu沉淀悬浮液;将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中加入硫化钾，并以250 rpm的转速搅拌反应45分钟，生成Cu2S沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用转速为6000 rpm离心机离心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入盐酸调节pH至4，用0.45μηι的滤膜过滤上清液除去颗粒杂质，收集滤液3.5L，上样于HD-8大孔强酸型树脂，柱体积为1.5m X 20cm，上样流速为50mL/min，洗涤平衡后，以2.5%盐酸溶液进行洗脱，洗脱流速为100mL/min，得到GSH溶液;将所述GSH溶液在OMpa压力下且在65°C下减压浓缩，使GSH浓度达到400g/L，即制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至600C的55 %的乙醇溶液，接着使用盐酸调节pH至3，以200 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度65%的乙醇溶液洗涤3次，得到谷胱甘肽晶体粗品；最后，在-0.04Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到150.5 g谷胱甘肽晶体，经高效液相(HPLC)检测纯度为98.4%,总收率为62.7%。
[0043]所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下:理论值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;测量值:C 39.09%^H 5.57%,O 31.25%。
[0044]实施例7
将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步骤进行分离纯化: 取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入纯水，充分搅拌，定容至4L，得到GSCu沉淀悬浮液;将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中加入硫化铵，并以150 rpm的转速搅拌反应50分钟，生成仏^沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用转速为6000 rpm离心机离心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸调节pH至2，用0.45μηι的滤膜过滤上清液除去颗粒杂质，收集滤液3.5L，上样于SP207大孔吸附树脂，柱体积为1.5m X 20cm，上样流速为50mL/min，洗涤平衡后，以20 %乙醇水溶液进行洗脱，洗脱流速为100mL/min，得到GSH溶液;将所述GSH溶液在-0.02Mpa压力下且在60°C下减压浓缩，使GSH浓度达到400g/L，即制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55°C的50%的乙醇溶液，接着使用稀硝酸调节pH至3，以150 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度75%的乙醇溶液洗涤2次，得到谷胱甘肽晶体粗品；最后，在-0.06Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到153.1 g谷胱甘肽晶体，经高效液相(HPLC)检测纯度为98.4%，总收率为63.8%。
[0045]所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下:理论值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;测量值:C 39.09%^H 5.59%、0 31.22%。
[0046]实施例8
将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步骤进行分离纯化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入纯水，充分搅拌，定容至4L，得到GSCu沉淀悬浮液;将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中通入硫化氢，并以150 rpm的转速搅拌反应60分钟，生成仏^沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用转速为6000 rpm离心机离心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸调节pH至3，用0.45μηι的滤膜过滤上清液除去颗粒杂质，收集滤液3.5L，上样于HD-8大孔强酸型树脂，柱体积为1.5m X 20cm，上样流速为50mL/min，洗涤平衡后，以1.5%盐酸+0.3mo 1/L氯化钠水溶液进行洗脱，洗脱流速为lOOmL/min，得到GSH溶液;将所述GSH溶液在-0.07Mpa压力下且在65 °C下减压浓缩，使GSH浓度达到400g/L，即制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至60°C的60%的乙醇溶液，接着使用盐酸调节pH至3，以150 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度65%的乙醇溶液洗涤2次，得到谷胱甘肽晶体粗品；最后，在-0.05Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到178.8 g谷胱甘肽晶体，经高效液相(HPLC)检测纯度为98.7%,总收率为74.5%。
[0047]所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下:理论值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;测量值:C 39.06%^H 5.56%、0 31.27%。
[0048]实施例9
将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步骤进行分离纯化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入纯水，充分搅拌，定容至4L，得到GSCu沉淀悬浮液;将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中加入硫化铵，并以250 rpm的转速搅拌反应60分钟，生成Cu2S沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用转速为6000 rpm离心机离心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入盐酸调节pH至3，用0.45μηι的滤膜过滤上清液除去颗粒杂质，收集滤液3.5L，上样于HD-8大孔强酸型树脂，柱体积为1.5m X 20cm，上样流速为50mL/min，洗涤平衡后，以1.5%盐酸溶液进行洗脱，洗脱流速为100mL/min，得到GSH溶液;将所述GSH溶液在OMpa压力下且在65°C下减压浓缩，使GSH浓度达到400g/L，即制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至600C的50 %的乙醇溶液，接着使用盐酸调节pH至3，以200 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度75%的乙醇溶液洗涤3次，得到谷胱甘肽晶体粗品；最后，在-0.02Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到134.Sg谷胱甘肽晶体，经高效液相(HPLC)检测纯度为98.5%,总收率为56.2%。
[0049]所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下:理论值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;测量值:C 39.09%^H 5.59%、0 31.23%。
[0050]实施例10
将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步骤进行分离纯化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入纯水，充分搅拌，定容至4L，得到GSCu沉淀悬浮液;将GSCu沉淀悬浮液转移至另一容器中，向所述GSCu沉淀悬浮液中加入硫化铵，并以200 rpm的转速搅拌反应60分钟，生成Cu2S沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用转速为6000 rpm离心机离心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入盐酸调节pH至2，用0.45μηι的滤膜过滤上清液除去颗粒杂质，收集滤液3.5L，上样于SP207大孔吸附树脂，柱体积为1.5m X 20cm，上样流速为50mL/min，洗涤平衡后，以1.5%盐酸溶液进行洗脱，洗脱流速为lOOmL/min，得到GSH溶液;将所述GSH溶液在-0.07 Mpa压力下且在65 V下减压浓缩，使GSH浓度达到400g/L，即制得谷胱甘肽浓缩液；向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55 0C的50 %的乙醇溶液，接着使用磷酸调节pH至3，以200 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度65%的乙醇溶液洗涤2次，得到谷胱甘肽晶体粗品；最后，在-0.07Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到134.Sg谷胱甘肽晶体，经高效液相(HPLC)检测纯度为98.6%,总收率为56.2%。
[0051 ] 所制得谷胱甘肽晶体的元素分析如下:理论值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;测量值:C 39.07%、Η 5.57%,O 31.26%。
[0052]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1.一种谷胱甘肽的高效分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将新鲜制备的氧化亚铜溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀；向所述GSCu沉淀中加入纯水，充分搅拌，使GSCu沉淀悬浮液的匀浆湿重为300-500g/L; (2)向所述GSCu沉淀悬浮液中加入硫化物，搅拌反应，生成⑶^沉淀并置换出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液； (3)将所述谷胱甘肽母液离心，得到含谷胱甘肽的上清液； (4)对所述上清液进行压滤或微滤； (5)将步骤(4)所得的滤液上样于阳离子交换树脂或大孔吸附树脂，洗涤平衡后，以解吸附溶液进行洗脱，得到谷胱甘肽溶液； (6)将所述谷胱甘肽溶液在-0.07Mpa-O Mpa压力下且在55?65°C下减压浓缩，制得谷胱甘肽浓缩液； (7)采用乙醇溶液对谷胱甘肽浓缩液进行结晶操作，得到谷胱甘肽晶体粗品； (8)真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到纯的谷胱甘肽晶体。2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，以150?250 rpm的搅拌速度进行搅拌反应45?60 min。3.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的高效分离纯化方法，其特征在于，所述硫化物选自以下任一种:硫化氢，硫化钠，硫化钾和硫化铵。4.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤(4)中，所述压滤或微滤采用的滤布或滤膜的孔径为0.45μπι。5.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的高效分离纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂选自以下任一种:D001大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，HD-8大孔强酸型树脂，D-61大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂;所述大孔吸附树脂选自以下任一种:SP207大孔吸附树脂，XDA-1大孔吸附树脂，DA201-C大孔吸附树脂。6.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，还包括:使用盐酸或磷酸或硝酸调节所述上清液的PH至2?4。7.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤(5)中，采用阳离子交换树脂时相应使用的解吸附溶液为氢氧化铵水溶液、氯化钠水溶液或盐酸;采用大孔吸附树脂时相应使用的解吸附溶液为乙醇水溶液。8.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤(6)中所述的谷胱甘肽浓缩液的浓度为380?420 g/Lo9.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤(7)为:向所述谷胱甘肽浓缩液中加入预热至55?65°C的50?60%的乙醇溶液，接着使用盐酸或磷酸或硝酸调节谷胱甘肽乙醇溶液的PH至2?4，以150?250 rpm的转速缓慢搅拌，缓慢析出晶体;充分析晶后，抽滤，用浓度65?75%的乙醇溶液洗涤2~4次，得到谷胱甘肽晶体粗品。10.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的高效分离纯化方法，其特征在于，步骤(8)为:在-.0.07 Mpa-O Mpa的压力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶体粗品，得到纯度多98%的谷胱甘肽晶体。
【文档编号】C07K5/037GK106008664SQ201610593413
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】刘世领, 王德正
【申请人】上海青平药业有限公司