一种修饰量子点的新型环状多肽配体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种修饰量子点的新型环状多肽配体(ATTO?H6),属于纳米生物技术领域。本发明中的新型环状多肽配体包括用于和量子点发生FRET的染料ATTO 590(1)、用于多肽成环序列(2)、用于结合量子点的组氨酸间隔序列(3)、用于多肽折叠序列(4),各序列之间以肽键相结合。该配体合成方法简单,通过6个组氨酸间隔序列与量子点结合,大大提高了配体与量子点的结合速率及稳定性,可以作为纳米荧光探针广泛应用于生物标记。
【专利说明】
一种修饰量子点的新型环状多肽配体
技术领域
[0001] 本发明涉及纳米生物技术领域,具体涉及一种修饰量子点的新型环状多肽配体。
【背景技术】
[0002] 与传统的有机染料相比,量子点(QDs)具有更优异的光谱性质,如激发光谱宽且连 续分布,而发射光谱呈对称分布且宽度窄,颜色可调,并且光化学稳定性高,不易光解 (Marcel BJ,Mario M,Peter G,et al.Science 1998,281,2013-2016)。这些优越的性能使 QDs在体内细胞成像和生物特定标记等方面都得到了广泛应用,它正在并将日益成为分子 细胞成像研究中非常重要的一种探针工具。因此,具有高性能的水溶性量子点的合成受到 了密切关注。
[0003] 基于QDs的传感器的发展高度依赖于新的配体与其的自组装。亲和金属驱动的量 子点因为其高可控性已经有效运用到功能化量子点中。QDs表面的Zn原子和多组氨酸残基 的金属亲和协调作用,含有组氨酸残基的蛋白质和多肽能够直接接到QDs表面的Zn原子,这 种方法具有很好的稳定性,已逐渐成为生物标记中一种常用的方法。研究表明组氨酸个数 (NS6)对多肽配体和量子点自组装有影响,发现长组氨酸序列可加强结合亲和力。然而,由 于空间位阻,超过6个组氨酸残基的多肽序列很难提高结合力(Wang,J.H.,Li,J.Y.,Chen, Υ·,et al.Electrophoresis 2015,36,2419-2424·)。因此,组氨酸的数量和结构对多肽配 体起到至关重要的作用,对于设计高效多肽配体和量子点自组装具有重大意义。此外,尽管 组氨酸标签是最流行的融合标签之一,它也可能影响目标蛋白和它们的活性和三级结构。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是:为了克服现有多肽配体与QDs结合速度慢、稳定性差 等问题,限制其在生物领域中的普及使用;为了解决组氨酸个数(NS6)对多肽配体和量子 点自组装有影响,长组氨酸序列可加强结合亲和力,然而由于空间位阻,超过6个组氨酸残 基的多肽序列很难提高结合力的技术问题。,本发明提供一种与QDs结合速度快,而且稳定 性好的新型环状多肽配体。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种修饰量子点的新型环状多肽配 体,其特征在于:包括用于和量子点发生FRET的染料ΑΤΤ0 590(1 )、用于多肽成环序列(2)、 用于结合量子点的组氨酸间隔序列(3)、用于多肽折叠序列(4),各序列之间以肽键相结合。
[0006] 所述的用于和量子点发生FRET的染料ATTO 590( 1)能作为受体接受量子点的激发 光再发出新的波长的发射光;所述的用于成环的序列(2)为2个半胱氨酸序列;所述的用于 结合量子点的组氨酸间隔序列(3)为6个组氨酸间隔其他氨基酸序列;所述的用于多肽折叠 序列(4)为一个D型脯氨酸和一个L型脯氨酸序列。
[0007] 本发明所述的量子点为含有Zn的量子点,如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdS e/ZnSe或者 CdTe/ZnSe〇
[0008] 采用上述的技术方案后,本发明取得的有益效果:本发明设计了环状含有组氨酸 (Η)的新型的多肽配体(ATTO 590-ATT0-HCHVHdPlPHLHCH,ATT0-H6)。通过D型和L型的脯氨酸 使多肽折叠,然后再通过两个半胱氨酸的巯基形成二硫键,从而使整个多肽结构成为环状, 这种新颖的结构将使所有组氨酸结合在Zn 2+量子点的表面上,可大大减小空间位阻,因此显 示出更好的结合力;本发明提供的修饰量子点的新型环状多肽配体,合成方法简单,可重复 性高,与量子点结合速度快,稳定性高,解决了现有量子点多肽配体稳定性不足而导致其在 生物体内的不稳定,进一步拓展了量子点一一多肽复合物作为纳米荧光探针在生物中的应 用。
【附图说明】
[0009] 图1是修饰QDs的新型环状多肽配体(ATTO-HCHVHdPlPHLHCH)的结构示意图,图中:
[0010] 1是用于和量子点发生FRET的染料ΑΤΤ0 590;
[0011] 2是用于多肽成环序列;
[0012] 3是用于结合量子点的组氨酸间隔序列;
[0013] 4是用于多肽折叠序列。
[0014]图2是用荧光毛细管电泳检测ATT0-H6与QDs结合的电泳图,其中:
[0015] 图 A 中,a,QDs;b,ATT0-H6: QD = 4:1; c,ATT0-H6: QD = 8:1; d,ATT0-H6: QD = 16:1。
[0016] 图 B为相同序列的直链多肽ATTO-HCHVHPPHLHCH 和QDs结合,a,QDs; b,ATT0-H6: QD =8:1; c,ATT0-H6: QD = 16:1; d,ATT0-H6: QD = 32:1;
[0017] 图3不同浓度咪唑在毛细管内检测ATT0-H6与QDs结合的稳定性曲线。
【具体实施方式】
[0018] 本发明将就以下实施例作进一步说明,但应了解的是,这些实施例仅为例示说明 之用,而不应被解释为对本发明实施的限制。
[0019] 实施例1
[0020] 本发明所述的方法采用常规的固相Fmoc法,即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基 酸去保护后露出氨基,通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键,从而将氨基酸连接 到树脂上,使肽链从C端向N端延伸。
[0021] 1、基本材料:
[0022] (1)树脂与连接分子:固相Fmoc法选择的树脂为Rink Amide-ChemTVfatdx?树脂。 这种树脂具有非常好的溶胀性,可以使肽链之间更好地进行缩合反应,且有足够的网络空 间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为连接分子,将多肽分子固定到树脂上。
[0023] (2)单体:合成所用单体为经化学修饰的α-氨基酸。
[0024] 2、反应步骤:
[0025]第一步,将第一个氨基酸共价连接到树脂上
[0026]加入适当的缩合剂如HBTU和HOBt,使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成 氨基酸的固定;
[0027]第二步,去保护
[0028]采用碱性溶剂20%哌啶去除氨基上的Fmoc,暴露出氨基。
[0029]第三步,激活和交联
[0030] 采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基,与树脂上的氨基交联,形成肽 键。
[0031] 第四步,重复第二步和第三步,反复循环添加单体氨基酸,按照HCHVHdPlPHLHCH序 列的顺序从右到左合成,直到合成完成。
[0032] 3、合成后成环及处理:
[0033] (1)洗脱和脱保护:用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树脂上洗脱下来,并脱除 保护基。
[0034] (2)HPLC 分析纯化。
[0035] (3)冻干后用NaHC03和Na2C03来做巯基脱氢反应,使两个半胱氨酸的巯基形成二硫 键,从而整个多肽成环状。
[0036] (4)再次HPLC分析纯化,冻干后保存。
[0037] 通过上述方法,合成环状多肽序列411'0-!1〇^!^^^1^〇1以1'1'0-册)。
[0038] 4、QDs和ATT0-H6在毛细管内作用研究:
[0039] 在毛细管内,先进样QDs 10s,间隔10s,再进样ATT0-H6 10s。实验结果表明,ΑΤΤ0- H6与QDs的结合反应在16:1达到平衡(如图2A,曲线d);而对照实验没有成环的ATT0-H6与 QDs的结合在32:1才达到平衡(如图2B,曲线d)。
[0040] 为了检测新型环状多肽配体与QDs结合的稳定性,在QDs与ATT0-H6进样后,再进样 取代分子Im。实验结果表明,加入大量取代分子后,部分ATT0-H6会从QDs表面被取代下来 (如图3)。
[0041] 测试条件:
[0042]用荧光毛细管电泳检测ATT0-H6与QDs的结合,电泳条件:25mM硼酸缓冲液(pH 9.3),电压为181^。[00]=2.54]?。
[0043] 对照实验,用相同序列的直链多肽ATTO-HCHVHPPHLHCH和QDs结合,检测波长,实线 为565nm检测QDs,虚线为625nm检测ΑΤΤ0 590〇
[0044]用不同浓度咪唑在毛细管内检测ATT0-H6与QDs结合的稳定性。电泳条件:25mM硼 酸缓冲液(pH 9.3),电压为 181^^170-^:00 = 32:1,^0==2.541^
[0045] 实施例2
[0046]多肽合成步骤参照实施例1,按照HCHLHdPlPHLHCH序列的顺序从右到左合成。合成 新型环状多肽配体序列:ATTO-HCHLHdPlPHLHCH。
[0047] 实施例3
[0048]多肽合成步骤参照实施例1,按照HCHVHdPlPHVHCH序列的顺序从右到左合成。合成 新型环状多肽配体序列:ATTO-HCHVHdPlPHVHCH
[0049] 按照实施例1的方法将实施例2~3得到的多肽序列分别与QDs用毛细管电泳分析, 检测条件与实施例1相同,检测结果发现它们都能和QDs稳定结合。
[0050] 实施例4
[00511多肽合成步骤参照实施例1,按照HCHVHPPHLHCH序列的顺序从右到左合成。合成多 肽配体序列:ATTO-HCHVHPPHLHCH。结果表明,该多肽配体与ATT0-H6相比,结合效率大大降 低(参照图2B)。
[0052]通过上述实施例可以看出,本发明的新型环状多肽配体可以实现量子点与多肽配 体的快速结合,并且稳定性高,操作方便。
[0053]以上述依据本发明的理想实施例为启示,通过上述的说明内容,相关工作人员完 全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内,进行多样的变更以及修改。本项发明的技术 性范围并不局限于说明书上的内容,必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
【主权项】
1. 一种修饰量子点的新型环状多肽配体,其特征在于:该新型环状多肽配体包括用于 和量子点发生FRET的染料ATTO 590(1)、用于多肽成环序列(2)、用于结合量子点的组氨酸 间隔序列(3)、用于多肽折叠序列(4),各序列之间以肽键相结合。2. 根据权利要求1所述的一种修饰量子点的新型环状多肽配体,其特征在于:所述用于 和量子点发生FRET的染料ATTO 590(1)能作为受体接受量子点的激发光再发出新的波长的 发射光。3. 根据权利要求1所述的一种修饰量子点的新型环状多肽配体,其特征在于:所述的用 于成环的序列(2)为2个半胱氨酸序列。4. 根据权利要求1所述的一种修饰量子点的新型环状多肽配体,其特征在于:所述的用 于结合量子点的组氨酸间隔序列(3)为6个组氨酸间隔其他氨基酸序列。5. 根据权利要求1所述的一种修饰量子点的新型环状多肽配体,其特征在于:所述的用 于多肽折叠序列(4)为一个D型脯氨酸和一个L型脯氨酸序列。6. 根据权利要求1所述的一种修饰量子点的新型环状多肽配体,其特征在于:所述的量 子点为含有Zn的量子点,如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。
【文档编号】C07K7/08GK106008671SQ201610374856
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】王建浩, 张晨澄, 邱琳, 蒋鹏举, 柳丽, 王车礼, 滕万, 滕一万, 陈瑶
【申请人】常州大学