一种沙枣种子抗菌多肽的制备方法及其用图
【专利摘要】本发明涉及一种沙枣种子抗菌多肽的制备方法及其用途，该方法先将干燥的沙枣种子进行粉碎、脱脂处理之后，采用醋酸提取，丙酮沉淀，再利用反相硅胶柱层析（C18）分离纯化即得到沙枣种子抗菌部位。将得到的沙枣种子抗菌部位利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析成分结果显示：其由分子量4400Da?14000Da之间的多种多肽组成的多肽与蛋白质混合物，该部位被验证其有效的抑制白色念珠菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性。可作为原料或辅助剂用于制备保健品或其他功能性食品中的用途。
【专利说明】
一种沙枣种子抗菌多肽的制备方法及其用途
技术领域
[0001 ]本发明涉及沙枣种子抗菌多肽的制备方法及其用途
【背景技术】
[0002] 沙率是胡颓子科(Elaeagnus)胡颓子属落叶乔木或小乔木，它是可直接食用，是一 种新疆维吾尔族人民喜爱的果品。在《中国药典维吾尔分册》中记载，主要药理活性有抗氧 化、抗增殖、抗溶血、抗过敏、抑菌杀菌、抗病毒等，有较高的研究和药用价值。沙枣还有健脾 胃，安神，镇静，止泻涩肠的功用。沙枣除饲用外，还是很好的造林、绿化、薪炭，防风、固沙树 种。沙枣作为饲料，在中国西北已有悠久的历史。其叶和果是羊的优质饲料。在西北冬季风 暴天气，沙枣林则是羊群避灾保畜的场所。
[0003] 通过国内外有关沙枣种子化学成分和生物活性研究的文献调查结果显示，目前沙 枣的化学成分报道主要集中在多糖、黄酮和挥发油，除此以外，沙枣中的蛋白质、脂肪和其 它也有相关报道，但目前未见沙枣种子的蛋白和多肽的研究报道，在种子往往蛋白较多;沙 枣是新疆特色药用植物，收录于《中国药典维吾尔分册》，分布广，资源丰富，具有很大的药 用和经济价值。所以，我们以新疆产沙枣种子为研究对象，系统的研究其果实、果仁中的多 肽成分，寻找有生物活性的多肽，同时也为开发、利用新疆特色药用植物资源提供理论依 据。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于，提供一种新疆的可食植物-沙枣种子抗菌多肽的制备方法及其 用途，该方法先将干燥的沙枣种子进行粉碎、脱脂处理之后，采用醋酸提取，丙酮沉淀，再利 用反相硅胶柱层析(C 18)分离纯化即得到沙枣种子抗菌多肽。将得到的沙枣种子抗菌镀钛利 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析成分结果显示:其由分子量4400Da-14000Da之间的多种多肽组 成的多肽与蛋白质混合物，该多肽被验证其有效的抑制白色念珠菌，大肠杆菌和金黄色葡 萄球菌活性。可作为原料或辅助剂用于制备保健品或其他功能性食品中的用途。
[0005] 本发明所述的一种沙枣种子抗菌多肽的制备方法，按下列步骤进行：
[0006] a、将沙枣果实用水洗掉，将种子进行清洗自然晒干、粉碎，用石油醚脱脂得到脱脂 沙枣种子；
[0007] b、将步骤a中得到的脱脂沙枣种子，在室温下，用浓度为10%醋酸按料液比为w/v =1:7提取沙枣种子总多肽，温度20°C，过滤取上清液，再按v/v = 1:5将上清液倒入无水丙 酮中过夜沉淀，在温度4°C，12000r/min条件下离心3次，每次15min，将每次的沉淀物用冷却 的无水丙酮洗涤，再将沉淀物自然晒干，得到总多肽提取物，计算得率和蛋白含量；
[0008] C、将步骤b中提取物，加入预处理好的填料为C18的反相高效液相RP-HPLC柱，用体 积浓度为15%乙醇平衡，再用乙醇梯度洗脱，分开收集流出液，浓缩冷冻干燥即可得到具有 抗菌作用的沙枣种子抗菌多肽。
[0009] 所述方法获得的沙枣种子抗菌部位在抑制白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球 菌活性中的用途。
[0010] 所述方法获得的沙枣种子抗菌多肽在制备保健品或其他功能性食品中的用途。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明沙枣种子和标准蛋白15%SDS-PAGE考马斯染色图，其中1为沙枣种子 抗菌多肽，Μ为标准蛋白（甲状旁腺激素1-34，4.1KD;抑肽酶，6.5KD;甲状旁腺激素1-84， 9.5KD;溶菌酶，14.4KD;胰蛋白酶抑制剂，20KD;磷酸丙糖异构酶，27KD;猪胃蛋白酶，35KD; 卵清蛋白，45KD;牛血清白蛋白，66KD);
[0012]图2为本发明对白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌三个菌的活性作用图，其 中SA为金黄色葡萄球菌;EC为白色念珠菌;CA为大肠杆菌。
[0013] 图3为本发明沙枣种子多肽粗体物质谱图。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1
[0015] a、将300g沙枣果实用水洗掉，种子进行清洗自然晒干、粉碎，用石油醚脱脂得到脱 脂沙枣种子48g;
[0016] b、将步骤a中得到的脱脂沙枣种子，在室温下，用浓度为10%醋酸按料液比为w/v =1:7在搅拌下提取沙枣种子总多肽，温度20°C，时间2小时，过滤取上清液，再按v/v= 1: 5 将上清液倒入无水丙酮中过夜沉淀，在温度4°C，12000r/min条件下离心3次，每次15min，将 每次的沉淀物用冷却的无水丙酮洗涤，再将沉淀物自然晒干，得到总多肽提取物，利用双缩 脲法测总的蛋白含量，540nm波长紫外检测，总蛋白含量为72.6% ;
[0017] c、将步骤b中总多肽提取物，加入预处理好的填料为C18的反相高效液相RP-HPLC柱 子，用体积浓度为15%乙醇平衡，再用乙醇梯度洗脱，分开收集流出液，浓缩冷冻干燥即可 得到具有抗菌作用的沙枣种子抗菌多肽。
[0018] 实施例2
[0019]利用琼脂平板法检测样品对三种菌的抑菌作用，并测定样品对三种菌的抑菌环大 小，以此判断样品的抑菌能力：
[0020]革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌于LB液体培养基中， 175rpm、温度37°C，过夜培养至0D600在2.0左右（1 X 106CFU/mL)，取过夜培养的菌液10 yL 与8mL含0.7 %琼脂的LB培养基混匀后平铺在含25mL 1.5 %琼脂的LB培养基上，当顶层琼脂 凝固后，滴加用〇.22μπι微孔滤膜滤后的样品溶液，温度37°C过夜培养，测量抑菌环直径。以 氨苄青霉素为阳性对照，生理盐水为阴性对照。
[0021 ]表1沙枣种子抗菌多肽的抗菌结果(M±m)
[0022]
[0023] 实施例3
[0024] 串联质谱由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器将离子预分离或加能量修 饰，由第二级质量分析器分析结果;本实验参考蛋白质酶解的方法采用串联质谱将沙枣种 子粗体多肽进行质谱分析，质谱分析得到分子量分别为5492.9Da，6551.5Da，4400.5Da和 2837Da的四个多肽分子。
【主权项】
1. 一种沙枣种子抗菌多肽的制备方法，其特征在于按下列步骤进行： a、 将沙枣果实用水洗掉，将种子进行清洗自然晒干、粉碎，用石油醚脱脂得到脱脂沙枣 种子； b、 将步骤a中得到的脱脂沙枣种子，在室温下，用浓度为10%醋酸按料液比为w/v=l: 7提 取沙枣种子总多肽，温度20°C，过滤取上清液，再按v/v=l:5将上清液倒入无水丙酮中过夜 沉淀，在温度4°C，12000r/min条件下离心3次，每次15min，将每次的沉淀物用冷却的无水丙 酮洗涤，再将沉淀物自然晒干，得到总的多肽提取物，计算得率和蛋白含量； c、 将步骤b中提取物，加入预处理好的填料为C18的反相高效液相RP-HPLC柱，用体积浓 度为15%乙醇平衡，再用乙醇梯度洗脱，分开收集流出液，浓缩冷冻干燥即可得到具有抗菌 作用的沙枣种子抗菌多肽。2. 根据权利要求1所述方法获得的沙枣种子抗菌多肽在抑制白色念珠菌、大肠杆菌和 金黄色葡萄球菌活性中的用途。3. 根据权利要求1所述方法获得的沙枣种子抗菌部位在制备保健品或其他功能性食 品中的用途。
【文档编号】A23L33/18GK106008686SQ201610356003
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】阿布力米提·伊力, 阿吉艾克拜尔·艾萨, 艾合米丁·外力, 肖开提·萨力霍
【申请人】中国科学院新疆理化技术研究所