人α1抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法
【专利摘要】本发明涉及一种人α1抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法，其包含以下步骤：1)将人α1抗胰蛋白酶以巴氏消毒法进行处理；2)将步骤1)所得人α1抗胰蛋白酶进行超滤除菌过滤和分装，然后进行冻干处理；3)将步骤2)所得冻干后人α1抗胰蛋白酶进行终端干热灭活处理；其中，步骤3)中的干热灭活处理的温度为100℃±2℃，灭活时间为60?90分钟。本发明的方法操作简单、成本低、易于推广。
【专利说明】
人α1抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物制品生物技术领域，具体公开一种人α?抗胰蛋白酶的病毒灭活方 法。
【背景技术】
[0002] 人α 1抗胰蛋白酶(α 1 -ant i tryps iη，α 1 AT或ΑΑΤ)，是机体内的一种丝氨酸蛋白酶抑 制剂，具有蛋白酶抑制作用的一种急性时相反应蛋白，分子量为53KDa，PI范围为4.7-5.0， 血浆中含量约为2g/L，占蛋白质总量的3%-4%，是一种糖蛋白，含有10%-12%糖。
[0003] 血源性AAT的制备，主要从血浆或低温乙醇的组分IV沉淀开始，经过复溶、PEG沉 淀、离子交换层析等分离纯化步骤制得冻干制品。
[0004] 血液制品安全性的要求不断提高，目前，血液制品需要2种及以上的病毒灭活方法 和步骤，以保证制品安全，血液制品常用的病毒灭活方法主要采用S/D法、巴氏法和纳米膜 过滤法等。S/D法是去除包膜病毒的有效方法。但是采用S/D方法后需要增加去除S/D步骤。 纳米膜过滤法对包膜和非包膜病毒都有效果，纳米膜过滤的透过速度与蛋白浓度成反比， 纳米膜过滤前后目标蛋白的生物学活性，结构和稳定性等并无明显变化，20nm滤膜比35nm 滤膜孔径更严苛，病毒去除效果更佳，但是纳米膜过滤成本高昂。
[0005] 本发明使用的人α?抗胰蛋白酶原料已经经过巴氏法处理，巴氏法有效去除包膜病 毒的有效方法。终端干热法作为第二种病毒灭活方法，是将制品分装至终容器冻干后，进行 的加热灭活。干热后制品外观呈乳白色或淡黄色疏松体，易复溶，而且干热过程可以有效灭 活细小病毒。
【发明内容】
[0006] 为了克服上述技术问题，本发明公开了一种操作简单，成本低廉的终端病毒灭活 方法在应用于人α?抗胰蛋白酶制品，可以取得良好的病毒灭活效果。发明人发现KKTC90分 钟终端干热法可以灭活人α?抗胰蛋白酶制品中的指示病毒>4LgTCID 5Q/0. lml。
[0007] 本发明一个方面提供了一种人α?抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法，其包含以下步 骤：
[0008] 1)将人α?抗胰蛋白酶以巴氏消毒法进行处理;然后经过超滤透析将人α?抗胰蛋白 酶浓缩至终浓度
[0009] 2)将步骤1)所得人α?抗胰蛋白酶进行除菌过滤和分装，然后进行冻干处理；
[0010] 3)将步骤2)所得冻干后人α?抗胰蛋白酶进行终端干热灭活处理；
[0011] 其中，步骤3)中的干热灭活处理的温度为100°C±2°C，灭活时间为60-90分钟。
[0012] 其中，步骤2)中冻干所使用的冻干保护剂为氯化钠、甘露醇、磷酸盐、甘氨酸等氨 基酸和或其它氨基酸盐酸盐。
[0013] 其中，步骤2)中冻干程序为预冻、退火、预冻、一次升华、二次升华。
[0014] 其中，步骤3)中干热灭活的温度为100°C±2°C，灭活时间为90分钟。
[0015] 其中，灭活的指示病毒选自细小病毒。
[0016] 其中，处理步骤不包含纳米膜过滤法或S/D法的步骤。
[0017] 其中，最终使得加入到人α?抗胰蛋白酶制品中的指示病毒滴度灭活值不低于 4LgTCID5〇/0.1ml〇
[0018] 本发明另一个方面提供了上述方法获得的人α?抗胰蛋白酶制品。
[0019] 有益效果
[0020] 血液制品的制备工艺至少应该包括两步病毒灭活步骤，人α?抗胰蛋白酶的病毒灭 活方法主要采用巴氏法和纳米膜过滤法，虽然纳米膜过滤法是目前最有效的病毒去除方 法，可以有效去除截留孔径以上的脂包膜和非脂包膜病毒，但因其价格昂贵应用受限。而巴 氏法已为较为成熟的病毒灭活方法广泛用于人血白蛋白等生物制品，且经过多年的临床试 验表明，巴氏法作为病毒灭活方法，其安全性已经得以证明。S/D法采用离子表面活性剂和 去污剂，需要后续纯化步骤将其去除，以避免对人体的危害。
[0021] 本发明创造性的采用终端干热法作为人α?抗胰蛋白酶的病毒灭活方法之一。该方 法具有以下优点：
[0022] 1.为终端容器灭活，是将制品冻干后，进行的加热灭活，灭活后即为成品，无后续 纯化步骤，降低无菌风险。
[0023] 2.成本低，易于推广。
[0024] 3.方法操作简单，易于批量放大及工业化生产，应用前景乐观。
【具体实施方式】 [0025] 实施例1
[0026] 1、制备得到的冻干前的人α?抗胰蛋白酶样品，以巴氏法进行处理。
[0027] 2、按样品：病毒溶液为9:1(V:V)的比例加入指示病毒(猪细小病毒PPV)，分装为 l〇ml/瓶留取冻干前样品取2瓶立即放置-80°C保存，即为原点样品。其余样品进行冻干。冻 干完成后留取冻干后样品，为阳性对照样，其余样品进行100°C±2°C终端干热灭活处理90 分钟，为实验组样品。
[0028] 3、将每个冻干和灭活后样品用灭菌注射用水复溶待检，原点样品从-80°C取出，室 温融化待检。测定每个样品中的残余病毒滴度。
[0029]表1.终端干热法灭活人α?-抗胰蛋白酶制品中PPV结果 [0030]
[0031]试验结果表明：终端干热法可以分别有效灭活人α 1-抗胰蛋白酶制品中PPV多 4.17LgTCID50/0.1ml〇
[0032] 实验例2
[0033] 1、制备得到的冻干前的人α?抗胰蛋白酶样品，以巴氏法进行处理。
[0034] 2、按样品：病毒溶液为9:1(V:V)的比例加入指示病毒(猪细小病毒PPV)，分装为 l〇ml/瓶留取冻干前样品取2瓶立即放置-80°C保存，即为原点样品。其余样品进行冻干。冻 干完成后留取冻干后样品，为阳性对照样，其余样品进行100°C±2°C终端干热灭活处理90 分钟，为实验组样品。
[0035] 3、将每个冻干和灭活后样品用灭菌注射用水复溶待检，原点样品从-80°C取出，室 温融化待检。测定每个样品中的残余病毒滴度。
[0036] 表2.终端干热法灭活人α?-抗胰蛋白酶制品中PPV结果
[0037]
[0038]试验结果表明：终端干热法可以分别有效灭活人α 1 -抗胰蛋白酶制品中PPV多 4.07LgTCID5〇/0.1ml〇
[0039] 实验例3
[0040] 1、制备得到的冻干前的人α?抗胰蛋白酶样品，以巴氏法进行处理。
[0041 ] 2、按样品：病毒溶液为9:1 (ν: ν)的比例加入指示病毒(猪细小病毒PPV)，分装到终 容器中，分装为l〇ml/瓶，留取冻干前样品取2瓶立即放置-80°C保存，即为原点样品。其余样 品进行冻干。冻干完成后留取冻干后样品，为阳性对照样，其余样品进行100 °C ± 2 °C终端干 热灭活处理90分钟，为实验组样品。
[0042] 3、将每个冻干和灭活后样品用灭菌注射用水复溶待检，原点样品从-80°C取出，室 温融化待检。测定每个样品中的残余病毒滴度。
[0043] 表3.终端干热法灭活人α?-抗胰蛋白酶制品中PPV结果
[0044]
[0045]试验结果表明：终端干热法可以有效灭活人α 1 -抗胰蛋白酶制品中ΡΡ V多 4.7LgTCID50/0.1ml〇
[0046] 实验例4
[0047] 1、制备得到的冻干前的人α?抗胰蛋白酶样品，冻干后效价为31.4。
[0048] 2、采用实施例1-3的方法制备用灭菌注射用水复溶待检，原点样品从-80°C取出， 室温融化待检。测定每个样品中的残余病毒滴度，测定不含病毒样品的效价。
[0049]
[0050] 实验结果显示：本发明人α?抗胰蛋白酶冻干保护剂对目的蛋白的活性保护效果 好。且可以有效灭活加入制品中的非包膜指示病毒(猪细小病毒）。
【主权项】
1. 一种人α?抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法，其包含以下步骤： 1) 将人α?抗胰蛋白酶以巴氏消毒法进行处理，然后经过超滤透析将人α?抗胰蛋白酶浓 缩至终浓度； 2) 将步骤1)所得人α 1抗胰蛋白酶进行分装，然后进行冻干处理； 3) 将步骤2)所得冻干后人α?抗胰蛋白酶进行终端干热灭活处理； 其中，步骤3)中的干热灭活处理的温度为100 °C ± 2 °C，灭活时间为45-180分钟（优选为 60-90分钟）。2. 根据权利要求1所述的人α?抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法，其中，除巴氏消毒法和 干热灭活处理外，不包含其它病毒灭活方法。3. 根据权利要求1所述的人α?抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法，其中，灭活的指示病毒 选自猪细小病毒。4. 根据权利要求2所述的人α?抗胰蛋白酶制品的病毒灭活方法，其中，其它病毒灭活方 法为纳米膜过滤法或S/D法。5. 根据权利要求1-4任一项所述的灭活方法获得的人α?抗胰蛋白酶制品。
【文档编号】C07K14/81GK106008706SQ201610605182
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月28日
【发明人】李陶敬, 邹莉, 彭焱, 周雁翔, 周志军, 林连珍, 胡勇, 邢延涛, 邓志军, 李娟 , 陈克金, 詹骞, 岳胜兰, 李策生
【申请人】武汉生物制品研究所有限责任公司