一种辣根过氧化物酶与抗体片段的融合蛋白及应用
【专利摘要】本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白由抗溶菌酶抗体或其可变区片段与辣根过氧化物酶报告基因蛋白串联而成，本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法和应用。该融合蛋白用于以免疫标记技术为基础的免疫检测，保持了良好的酶和抗体的生物学活性，具有较高的检测效率。
【专利说明】
一种辣根过氧化物酶与抗体片段的融合蛋白及应用
技术领域
[0001 ]本发明公开了一种融合蛋白及其免疫学应用，属于基因工程和免疫学领域。
【背景技术】
[0002] 抗体(Antibody，Ab)是指一类在抗原物质刺激机体免疫系统后形成的、具有与相 应抗原物质发生特异性结合反应的免疫球蛋白。抗体是免疫应答的重要产物，主要存在于 血液、组织液和外分泌液中，因此将抗体介导的免疫称为体液免疫。抗体分子由B淋巴细胞 产生，它由两条完全相同的重链以及两条完全相同且在哺乳动物中高度保守的的轻链组 成。IgG的分子重量大约是160kDa，其是一个复杂的分子，Η链和L链展开分别形成4个和2个 结构域。免疫球蛋白的两条轻链与两条重链由二硫键连接形成一个四肽链分子，构成免疫 球蛋白分子的单体。免疫球蛋白单体中四条肽链两端游离的氨基或羧基的方向是一致的， 分别称为氨基端(Ν端)和羧基端(C端）。在Ig单体分子的Ν端，轻链的1/2与重链的1/4氨基酸 排列顺序随抗体特异性不同而变化，故称这个区域为可变区（Variable region，V区）。此V 区赋予抗体以结合抗原的特异性。在Ig多肽链的C端，轻链的其余1/2和重链的3/4部分，氨 基酸数量、种类、排列顺序及含糖量都比较稳定，故称为恒定区（Constant Region，C区）。恒 定区不仅可作为Ig的骨架，还具有许多其他重要的生物学活性。在V区某些特定位置上，其 氨基酸残基的组成和排列顺序比可变区内其他位置上的氨基酸残基更易变化，故称这些部 位为超变区（Hypervariable Region，HV区），如轻链的第26~32、48~55、90~95三个部位， 重链的第31~37,51~68,84~91，101~110四个部位的氨基酸残基变化特别剧烈。轻链、重 链上的超变区位置大致相当。可变区中其他变化较少的部分称为骨架氨基酸残基 (Framework Residues，FR区）。Ig与特异抗原决定簇结合的位置就在超变区，所以现在又称 超变区为互补决定簇区（Complementary Reterminant Region，CDR)。抗体的高变区、抗体 的抗原结合部位和抗体的独特型决定簇存在于相同的Ig结构上，即抗体分子可变区球形顶 端凹陷的立体结构。
[0003] 多克隆抗体(Polyclonal Antibody，PcAb)是由多克隆B细胞群产生的、针对多种 抗原决定簇的混合抗体。因为天然抗原是由多种抗原分子组成的，每种抗原分子又含有许 多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应的B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应的 抗体。单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)是指由一个B细胞活化、增殖、分化产生的 子代细胞克隆分泌的、针对一个抗原决定簇的抗体，即由单一B细胞克隆合成的均一抗体。 一种单克隆抗体的Ig氨基酸排列顺序完全相同，其抗原特异性、和相应抗原结合的亲和性 也完全相同。
[0004] 1975年Koehler和Milstein采用细胞融合技术将小鼠免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细 胞融合，形成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞既保存了骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有免 疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。然后运用有限稀释法等技术可从杂交瘤细胞中挑 选出能稳定分泌抗体的单个细胞，进一步促进其增殖成为一个细胞克隆，分泌出均一 1性的 单克隆抗体。杂交瘤技术的建立使人们生产大量均一单克隆抗体的愿望成为了现实。由于 单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、可以大量生产等许多优点，已被广泛用作诊断 检测试剂，提高了常规免疫学检测技术在疾病诊断和分析研究中的敏感性、特异性、准确性 和检测速度。免疫学检测方法就是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞 及其分泌的细胞因子的实验方法。随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新 的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾 病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。为提高抗原和抗体检测的敏感性，将 已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接 测出微量的抗原或抗体。常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物 质等，这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术 (Immunolabelling Technique)。免疫标记不仅大大提高了试验敏感性，若与光镜或电镜技 术相结合，能对组织或细胞内的待测物质作精确定位，从而为基础与临床医学研究及诊断 提供方便。免疫标记技术大致分为两大类:一类属于免疫组织化学技术，用于组织切片或其 他标本中抗原的定位。另一类称为免疫测定(Immunoassay )，用于液体标本中抗原或抗体的 测定，例如免疫酶技术(Immunoenzymatic Technique)。最早应用的免疫酶技术是免疫酶组 织化学染色，即用标记的抗体与标本中的抗原发生特异性结合，当加入酶的底物时，在酶的 作用下经一系列生化反应产生有色物质，借助光镜作出定位判断。目前，应用最广泛的是酶 联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)。该法特异性强，敏感性 高，既可检测抗体，又能测定可溶性抗原。ELISA常采用的酶为辣根过氧化物酶(Hosradish Peroxidase，HRP)或者碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)，其底物分别是二氨基苯胺 (DAB)和对硝基苯磷酸二钠盐(PNPP)，底物被分解则显色，可目测或借助酶标仪比色。
[0005] 辣根过氧化物酶标记抗体，是将辣根过氧化物酶与特异性抗体经适当方法连接而 成。酶标记抗体的质量主要取决于酶的纯度、活性及抗体的亲和力，其次要有良好的制备方 法。目前，高质量的辣根过氧化物酶，国内已有商品供应，是从植物辣根中分离纯化的酶分 子。辣根过氧化物酶与抗体交联的采用的是过碘酸钠法。过碘酸法是先利用NaI0 4把酶分子 表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率可达70%， 99%的抗体与酶结合，是目前最常用的方法。在标记过程中需要使用化学试剂，会影响酶和 抗体的生物学活性，标记效率不能达到100%，而且费时费力，最后还需要对酶标抗体进行 纯化以去除多余的化学试剂和未标记的抗体和酶分子，从一次标记反应到拿到纯化的酶标 抗体需要至少1周的时间。
[0006] 由于常规的抗体分子量大，达到160kD，而且由2条重链和2条轻链构成，融合标记 酶后，分子量要达到200kD以上，对抗体的表达会产生不利的影响，稳定性也会变差。单链抗 体是基因工程抗体的一种，是将抗体的重链和轻链可变区通过柔性多肽串联起来的一种具 有抗原结合活性的抗体片段。由单一肽链构成，分子量小，只有30kD左右，可以用于融和标 记辣根过氧化物酶。由于获得的ScFv片段和完整抗体具有相同的抗原结合特性，因此，可以 利用此方法标记ScFv，通过竞争性酶联免疫吸附实验，检测实验动物或人血清中治疗性抗 体的浓度变化，进行药代动力学实验。另外，在单峰骆驼的血清中除传统的H 2L2型IgG外，还 存在一种缺失轻链的天然抗体。这种H2型同型二聚体抗体称为只有重链的抗体(HCAbs)。 HCAbs的重链可以形成三个结构域:N-末端域一序列可变区(VHH)，铰链域和两个恒定区。H2 型抗体的重链中与传统抗体重链的第一个恒定区（VH1)等价的部分已经缺失，称为单域抗 体。去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kD，大约10纳米的直径，被称为纳米抗体 (Nbs)。相似的缺乏轻链的功能性抗体同样以混合物的状态存在于非哺乳动物例如鲨鱼和 鼠鲨。与传统抗体片段，如Fab，ScFv等相比，Nbs因其相对分子质量小，而具有一些独特的性 质，例如免疫原性低、可溶性好、稳定性强、穿透性强、易表达等特性。
[0007] 基于现有技术在标记技术存在着标记效率低，酶和抗体的生物学活性因化学试剂 标的影响而有所下降的技术问题，因此，发明一种能够保持酶和抗体的生物学活性的免疫 标记技术已成为本技术领域之现实需求，以实现高效快速的免疫检测。
[0008] 本发明的目的就是提供一种酶和抗体的生物学活性不受化学标记的影响，又能实 现高效的免疫标记和检测功能的融合蛋白和应用方法。
【发明内容】
[0009] 基于上述发明目的，发明人意欲采用基因重组表达的方式，表达抗体和标记酶的 重组融合蛋白，从工程细胞的培养基上清或者破碎的工程细胞质中直接纯化抗体和标记酶 的融合蛋白，获得酶标抗体，用于相关的免疫学检测，具体而言，就是利用抗鸡卵清溶菌酶 的纳米抗体，制备检测鸡卵清溶菌酶浓度的纳米抗体标记酶融合蛋白，并将其应用于实际 的免疫检测中。
[0010] 因此，本发明首先提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白由抗溶菌酶抗体或其可变 区片段与辣根过氧化物酶串联而成。本发明所述的融合蛋白是在DNA水平上将编码抗体或 者抗体可变区片段的基因和编码辣根过氧化物酶的报告基因融合后，通过重组表达的方 法，在如大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞或者哺乳动物细胞中表达的重组融合蛋白。
[0011]抗体或抗体片段和报告基因蛋白的融合方式，可以是在抗体片段的氨基端或者羧 基端融合一个或几个报告基因蛋白，也可以在抗体片段的氨基端或者羧基端分别融合一个 或几个报告基因蛋白，或者是在报告基因蛋白的氨基端或者羧基端分别融合一个或者几个 抗体片段的基因。在两端分别融合报告基因蛋白或者抗体片段的融合蛋白中，所述融合蛋 白中的报告基因蛋白和抗体片段可以是不同的报告基因蛋白或不同的抗体片段，分别针对 同一抗原的不同抗原决定簇或不同的抗原分子。
[0012] 在一个优选的实施方案中，所述纳米抗体可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 不。
[0013] 在另一个优选的实施方案中，所述辣根过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:3 所示。
[0014] 在抗体片段和辣根过氧化物酶间可以添加间隔序列以使抗体片段和报告基因能 够各自表达和形成自身的空间构型，不造成抗体片段和报告基因蛋白的空间位阻，都具有 相应的生物学活性，间隔序列可以是(GGGGS) n柔性多肽或者其它的间隔序列。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述纳米抗体的可变区与报告基因蛋白由连接肽 (GGGGS) n连接，其中η位1 -6中的任一整数
[0016] 优选地，所述纳米抗体的可变区可以位于融合蛋白的氨基端，所述报告基因蛋白 位于融合蛋白的羧基端，η = 3。
[0017] 优选地，所述纳米抗体的可变区也可以位于融合蛋白的羧基端，所述报告基因蛋 白位于融合蛋白的氨基端，η = 3。
[0018] 本发明优选的序列是(GGGGSM乍为抗体片段和报告基因蛋白的间隔序列。为了便 于纯化融合蛋白，在融合蛋白的任意位置可以增加多聚组氨酸标签，表达后的重组融合蛋 白可以采用镍柱金属螯合层析的方法进行纯化。
[0019] 第二，本发明还提供了一种编码上述融合蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如 SEQ ID N0:5或6所示。
[0020] 第三，本发明提供了一种含有上述核苷酸序列的载体，所述载体为p⑶NA3.1。
[0021]第四，本发明还提供了一种含有上述载体的细胞，所述细胞为293T细胞。
[0022]第五，本发明提供了一种制备上述融合蛋白的方法，所述方法包括：
[0023] (1)使用p⑶NA3.1构建表达抗溶菌酶的纳米抗体的可变区和辣根过氧化物酶的融 合表达载体，其中所述抗溶菌酶的纳米抗体可变区的核苷酸编码序列为SEQ ID N0:2,所述 辣根过氧化物酶的核苷酸编码序列为SEQ ID N0:4;
[0024] (2)将步骤(1)获得的载体转化入宿主细胞293T;
[0025] (3)收获所述融合蛋白。
[0026] 最后，本发明提供了上述融合蛋白在抗体片段所针对的溶菌酶抗原的体外检测中 的应用，如酶联免疫吸附反应(EIA)、酶联免疫双抗体夹心法(ELISA)、免疫组化和免疫荧光 实验或者Western检测，以及抗体药物体内代谢动力学的检测实验。
[0027] 在传统的免疫标记技术中，辣根过氧化物酶标记在蛋白的赖氨酸残基位置。在纳 米抗体的抗原结合区，赖氨酸一般出现在CDR区，是抗原的结合区域，因此标记辣根过氧化 物酶后，可能阻断了纳米抗体与抗原的结合，导致不能显色，因此传统的标记技术难以应用 到纳米抗体这一新型抗体上。而本发明提供的融合蛋白克服了这一技术缺陷，特定的序列 组合保证了融合蛋白中纳米抗体和辣根过氧化物酶各自形成了空间构型，使其各自具有相 应的生物学活性。本发明的融合蛋白具有溶菌酶纳米抗体识别和结合抗原的能力，而融合 的辣根过氧化物酶可以作用于其底物DAB显色，因此获得的溶菌酶纳米抗体辣根过氧化物 酶融合蛋白可以作为针对溶菌酶的酶标抗体，用于溶菌酶浓度的免疫检测；也可以作为溶 菌酶纳米抗体的竞争性抗体，用于体内药代动力学实验。本发明将溶菌酶纳米抗体HRP融合 蛋白用于纳米抗体体内药代动力学的研究，在建立的纳米抗体血清浓度检测的标准曲线中 显示，在0. l-10ug/ml的浓度范围内，吸光度和纳米抗体的浓度呈良好的相关性。同时，竞争 性酶联免疫吸附方法检测显示，在注射溶菌酶纳米抗体后，大鼠血清中溶菌酶纳米抗体的 浓度30分钟后血清中的浓度快速下降，3小时后基本完全代谢掉。显示出由于纳米抗体的分 子量较低，具有较短的血清半衰期较短，这一结果符合纳米抗体的技术效果预期，也充分证 明了本发明融合蛋白在实际应用中的前景。
【附图说明】
[0028] 图1.本发明融合蛋白的结构示意图；
[0029] 图2 · pCDNA-NHPl 和 pCDNA-NHP2 的酶切鉴定图谱；
[0030] 图3 · NHP-1和NHP-2融合蛋白的SDS-PAGE电泳图谱；
[0031 ]图4.溶菌酶纳米抗体辣根过氧化物酶融合蛋白酶联免疫检测结果图；
[0032]图5.大鼠血清溶菌酶纳米抗体浓度检测标准曲线图；
[0033]图6.大鼠血清中溶菌酶纳米抗体的药代动力学研究。
【具体实施方式】
[0034]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0035] 实施例1:制备实施例
[0036] 1.根据SEQ ID N0:1的溶菌酶纳米抗体的氨基酸序列和SEQ ID N0:3辣根过氧化 物酶的氨基酸序列，优化获得在哺乳动物细胞中表达的溶菌酶和辣根过氧化物酶cDNA序列 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4。
[0037] 2.在溶菌酶纳米抗体和辣根过氧化物酶序列中添加柔性连接肽(GGGGS)3，分别获 得表达NHP-1和NHP-2的DNA序列SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6。人工合成二种DNA序列。图1显 示了所述融合蛋白的三种连接方式，在所述融合蛋白的氨基酸还可以有信号肽，以利于融 合蛋白的分泌表达。
[0038] 3.分别将NHP-1和NHP-2基因克隆到真核表达载体pCDNA3.1的EcoRI和Hindlll酶 切位点中，获得表达载体P⑶NA-NHP1和p⑶NA-NHP2(图2)。图2中，1.未酶切的p⑶NA-NHP1; 2·Aflll/Avrll双酶切后的pCDNA-NHPl;3·未酶切的pCDNA-NHP2;4·Af lll/Avrll双酶切后 的PCDNA-NHP2。
[0039] 4.293T细胞的转染：已培养48小时的293T细胞，弃掉培养皿中的培养基，用1ml的 PBS溶液洗涤两次。
[0040] 5.用Tip头加入lml Trypsin液，消化1分钟（37°C，5%C02)。用手轻拍培养瓶壁，观 察到细胞完全从壁上脱落下来为止。加入lml的含血清培养基终止反应。用Tip头多次吹吸， 使细胞完全分散开。
[0041 ] 6.将培养液装入离心管中，lOOOrpm离心5min。用培养液重悬细胞，细胞计数后选 择0.8 X 106个细胞加入一个35mm培养皿。将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞 后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。将培养皿转入C02培养箱中培养，第二天转染。
[0042] 7.转染试剂的准备:将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。震荡 后将试剂放在一 20°C保存，使用前还需震荡。选择合适的混合比例（1:1一1:2/脂质体体积： DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的 DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。将混合液在室温放置10-15分钟。 [0043] 8.吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。加入混合液，将细 胞放回培养箱中培养一个小时。到时后，移除混合液，之后加入完全无血清培养基继续培养 48 - 72小时。
[0044] 9.纳米抗体辣根过氧化物酶融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测：取10微升培养3天后 转染的293T细胞培养基上清，分别加10微升还原（含beta巯基乙醇）和非还原电泳（不含 beta巯基乙醇）的上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴冷却后，上15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶， 120V电泳30-40分钟至溴酚蓝到达胶的底部，取下凝胶，在考马斯亮蓝溶液中染色过夜，脱 色后观察重组蛋白的表达情况。（参见图3)。
[0045]纳米抗体辣根过氧化物酶融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测：取10微升培养3天后转 染的293T细胞培养基上清，分别加10微升还原(含beta疏基乙醇）和非还原电泳（不含beta 巯基乙醇）的上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴冷却后，上15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，120V电 泳30-40分钟至溴酚蓝到达胶的底部，取下凝胶，在考马斯亮蓝溶液中染色过夜，脱色后观 察重组蛋白的表达情况(参见图3)。图3中，1.293T细胞上清(还原）；2.293T细胞上清(非还 原）；3. ΝΗΡ-1转染293Τ细胞上清(还原）；4. ΝΗΡ-1转染细胞上清(非还原）；5. ΝΗΡ-2转染细胞 上清(还原）；6.ΝΗΡ-2转染细胞上清(非还原）。从图3的SDS-PAGE电泳结果可以看出，ΝΗΡ-1 和ΝΗΡ-2融合蛋白在293Τ细胞的培养基上清中有显著的分泌表达，纯度也较高，其中非还原 的蛋白迀移率较还原蛋白的迀移率偏高，说明融合蛋白中纳米抗体和辣根过氧化物酶各自 形成了空间构型，应该具有相应的生物学活性。
[0046]实施例2.融合蛋白免疫活性的检测
[0047] 取鸡卵清溶菌酶，用roS配制成10ug/ml的溶液，取96孔酶标板，每孔100微升包被 过夜。第二天用PBST冲洗各孔，用0.5%的BSA溶液封闭1小时，取100微升转染后的293T细胞 培养基上清，加入孔中，室温避光放置1小时，PBST冲洗3次，加100微升DAB显色底物，室温避 光反应15分钟，目测观察显色情况(参见图4)。图4中，1.空白对照NHP-1转染293T细胞上清； 2.溶菌酶包被4 X稀释NHP-1转染293T细胞上清；3.溶菌酶包被10 X稀释NHP-1转染293T细 胞上清;4.溶菌酶包被4 X稀释NHP-2转染293T细胞上清;5.溶菌酶包被10 X稀释NHP-2转染 293细胞上清;6.空白对照NHP-2转染293T细胞上清。
[0048]从图4中可以看出，在包被了溶菌酶的孔中，有辣根过氧化物酶的特异显色，而在 对照孔中，没有显色，证明融合蛋白具有溶菌酶纳米抗体识别和结合抗原的能力，而融合的 辣根过氧化物酶可以作用于其底物DAB显色，因此获得的溶菌酶纳米抗体辣根过氧化物酶 融合蛋白可以作为针对溶菌酶的酶标抗体，用于溶菌酶浓度的免疫检测。也可以作为溶菌 酶纳米抗体的竞争性抗体，用于体内药代动力学实验。
[0049] 实施例3.纳米抗体的辣根过氧化物酶化学标记
[0050] 将5mg辣根过氧化物酶溶于0.5ml 0 . lmol/L NaHC〇3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaI〇4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。加0.75ml 0. lmol/L Na2C03混匀，然后加 入0.75ml纯化的抗溶菌酶纳米抗体（15mg/ml)，混勾。称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一 支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用 (避光)3小时或4°C过夜。用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20体积新鲜配制 的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时 (或4°C过夜）。将交联物转入30kD分子量截留的超滤管中，4°C3000转离心30分钟，加等体积 PBS，继续离心3次，去除标记试剂和未标记的纳米抗体，获得辣根过氧化物酶标记的溶菌酶 纳米抗体。
[0051 ]辣根过氧化物酶化学标记的溶菌酶纳米抗体的酶联免疫吸附实验:如步骤10所述 的方法，用PBS配制鸡卵清溶菌酶成10ug/ml的溶液，每孔100微升包被取96孔酶标板过夜。 洗涤封闭后，各孔分别加1:10，1:100和1:1000稀释的纯化后的HRP标记纳米抗体100微升， 室温避光放置1小时，PBST冲洗3次，加100微升DAB显色底物，室温避光反应15分钟，目测观 察显色情况。
[0052]各孔中均未见明显的显色。由于HRP是标记在蛋白的赖氨酸残基位置，在纳米抗体 的抗原结合区，赖氨酸一般出现在CDR区，是抗原的结合区域，因此标记HRP后，可能阻断了 纳米抗体与抗原的结合，因此不能显色。
[0053]实施例4.溶菌酶纳米抗体HRP融合蛋白用于纳米抗体体内药代动力学的研究
[0054] 取大鼠血清，分别加入0.1，0.5，2，10，50和200ug/ml浓度的溶菌酶纳米抗体。取鸡 卵清溶菌酶，用PBS配制成10ug/ml的溶液，取96孔酶标板，每孔100微升包被过夜。第二天用 PBST冲洗各孔，用0.5 %的BSA溶液封闭1小时，将混合有溶菌酶纳米抗体的大鼠血清稀释50 倍后，分别取50微升加入到96孔板中，每个浓度重复3个孔，在每个孔中，再加入50微升含有 10ug/ml溶菌酶纳米抗体辣根过氧化物酶融合蛋白的PBS缓冲液，室温孵育2小时。PBST洗涤 96孔板3次后，加入DAB显色，0.2M硫酸终止反应后，在450nm波长条件下读取吸光度值，建立 纳米抗体血清浓度检测的标准曲线(参见图5)，从图5中可以看出，在0. l-10ug/ml的浓度范 围内，吸光度和纳米抗体的浓度呈良好的相关性。
[0055] 取体重200克左右的Wistar大鼠，按照10mg/kg体重的剂量，通过尾静脉注射的方 法，给大鼠注射溶菌酶纳米抗体。每隔30分钟取血一次，共取8次。按照前述的竞争性酶联免 疫吸附方法检测大鼠血清中溶菌酶纳米抗体的浓度。由于纳米抗体的分子量较低，可以通 过肾脏排泄掉，因此其血清半衰期较短，30分钟后血清中的浓度快速下降，3小时后基本完 全代谢掉(参见图6)。
【主权项】
1. 一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由抗溶菌酶抗体或其可变区片段与辣根 过氧化物酶报告基因蛋白串联而成。2. 根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述抗体为纳米抗体，其可变区片段的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 1所不。3. 根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于，所述辣根过氧化物酶报告基因蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID NO:3所示。4. 根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述纳米抗体的可变区与报告基因蛋白由 连接肽(GGGGS) n连接，其中η为1 -6中的任一整数。5. 根据权利要求4所述的蛋白，其特征在于，所述纳米抗体的可变区位于融合蛋白的氨 基端，所述报告基因蛋白位于融合蛋白的羧基端，η = 3。6. 根据权利要求4所述的蛋白，其特征在于，所述纳米抗体的可变区位于融合蛋白的羧 基端，所述报告基因蛋白位于融合蛋白的氨基端，η = 3。7. -种编码权利要求5或6所述蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:5或6所示。8. -种含有权利要求7所述核苷酸序列的载体，其特征在于，所述载体为pCDNA3.1。9. 一种含有权利要求8所述载体的细胞，其特征在于，所述细胞为293T细胞。10. -种制备权利要求1-5任一所述融合蛋白的方法，所述方法包括： (1) 使用PCDNA3.1构建表达抗溶菌酶的纳米抗体的可变区和辣根过氧化物酶的融合表 达载体，其中所述抗溶菌酶的纳米抗体的可变区的核苷酸编码序列为SEQ ID N0:2,所述辣 根过氧化物酶的核苷酸编码序列为SEQ ID N0:4; (2) 将步骤（1)获得的载体转化入宿主细胞293T; (3) 收获所述融合蛋白。11. 权利要求1-6任一所述融合蛋白在针对溶菌酶的免疫检测方法中的应用。
【文档编号】C12N5/10GK106008720SQ201610356626
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】宋海鹏, 李敏, 王庆东
【申请人】深圳市国创纳米抗体技术有限公司