一种重组β-hNGF-Fc融合蛋白、制备方法及用图

一种重组β-hNGF-Fc融合蛋白、制备方法及用图
【专利摘要】本发明公开了一种重组β?hNGF?Fc融合蛋白、制备方法及用途。其依次由人βNGF、短肽接头和人IgG Fc所示氨基酸序列组成。所述重组β?hNGF?Fc融合蛋白在摩尔基础上，具有与人NGF相当或更高的体外生物活性。本发明还保护含有所述重组β?hNGF?Fc融合蛋白的重组子和细胞株，具有用于周围神经病变、神经损伤的恢复及神经生长因子长效化应用的用途。
【专利说明】
一种重组β-hNGF-Fc融合蛋白、制备方法及用途
技术领域
[0001] 本发明涉及重组生物技术领域，尤其设计一种重组β-hNGF-Fc融合蛋白、制备方法 及用途。
【背景技术】
[0002] 神经生长因子(NGF)作用广泛，其中β亚单位是NGF的活性区。目前商品化的β-mNGF 如恩经复?>(Ν0ΒΕΧ)，是从成年雄性小鼠颂下腺分离和纯化获得。广泛应用于眼科、神经外 科、骨科、神经内科、儿科、内分泌科神经萎缩、神经变性、外伤修复等疾病的治疗。正因为注 射用鼠神经生长因子的需求不断增长，而今的NGF产品具有两点潜在的缺陷：1、由于是鼠源 蛋白质，其具有潜在的免疫原性;2、需要大量的合格的雄性小鼠颂下腺，这成了保证产量需 求的一大瓶颈。而通过原核表达系统（如E.coli)重组表达NGF，具有无法进行蛋白翻译后修 饰的缺点。
[0003] 通常所说的β-hNGF是118个氨基酸成熟肽。在人体内，β-NGF的表达有下列过程:1. β-NGF编码序列（723bp)翻译为prepr〇-hNGF(241aa)，包括信号肽（l-18aa)、导肽（19-121aa)、成熟肽（122-241aa);2。内质网上，信号肽被水解，形成pro-hNGF，包括导肽与成熟 肽。导肽末端有4个氨基酸残基（118-121aa)Arg-Ser-Lys-Arg，为哺乳动物前提蛋白加工酶 识别位点，导肽在高尔基体中被前体蛋白加工酶水解，形成hNGF(120aa); 3.hNGF在7S hNGF 中γ亚基作用下切除C端的ArgAla形成成熟肽（118aa)。
[0004] IgG类的免疫球蛋白是人体内丰富的蛋白质。其体内半衰期可高达21天。已有许多 将IgGde Fc区域与其他蛋白质结合成融合蛋白从而提高半衰期的报导。原型融合蛋白通过 IgG Fc铰链区的半胱氨酸残基连接为二聚体，是蛋白质类似于IgG分子。Fc融合蛋白在体内 表现出同种类型人IgG相当的体内外外物动力学特征。这种方法已用于一些临床上很重要 的细胞因子(如IL-2)。
[0005] 在NGF临床应用中，存在着注射部位疼痛或注射测下肢疼痛的不良反应，这与NGF 参与疼痛神经反应有关。因此开发长效化NGF，减少患者给药次数与频率，有利于缓解患者 的不良反应。综上所述，开发重组人β神经生长因子Fc融合蛋白的制备方法，具有重要的临 床价值。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种与人NGF相当或更高的体外生物活性的重组β-hNGF-Fc融合蛋白。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供一种重组β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述重 组β-hNGF-Fc融合蛋白依次由人0NGF、短肽接头和人IgG Fc所示氨基酸序列组成。
[0008] 进一步，所述短肽接头序列为不多于20个氨基酸的序列;优选的，所述短肽接头含 有甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸中至少两个氨基酸的序列；更优选的，所述短肽接头序 列为赖氨酸-苏氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-缬 氨酸-谷氨酸所示序列。
[0009] 进一步，所述的人IgG Fc片段含人IgG铰链区、CH2和CH3区。
[0010]进一步，所述融合蛋白所示序列如SEQ ID N0:1所示;优选的，所述融合蛋白所对 应的核酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0011] 进一步，所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白在摩尔基础上，具有与人NGF相当或更高的 体外生物活性。
[0012 ]本发明还提供一种重组子，其特征在于，含有所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白序列。
[0013] 本发明还提供一种细胞株，其特征在于，含有权利要求6所述重组子。
[0014] 进一步，所述细胞株为哺乳动物细胞株;优选的，所述哺乳动物细胞株为CH0细胞 衍生的细胞株。
[0015] 本发明还提供一种重组β-hNGF-Fc融合蛋白制备方法，其特征在于，所述方法包 括:构建含β-hNGF-Fc融合蛋白的重组表达载体；
[0016] 将重组表达载体转染入哺乳动物细胞，并筛选高效稳定表达的细胞株；
[0017] 发酵培养所得高效稳定表达的细胞株，收集培养液并纯化细胞分泌出的β-hNGF-Fc融合蛋白。
[0018] 进一步，所述β-hNGF-Fc的蛋白序列如SEQ ID NO: 1所示，优选的，所对应的β-hNGF-Fc核酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0019] 进一步，所述哺乳动物细胞为CH0细胞、人ΝΙΗ293细胞、COS细胞或MDCK细胞及它们 的衍生细胞系。
[0020] 所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白，所述重组子或所述细胞株用于周围神经病变、神经 损伤的恢复及神经生长因子长效化应用的用途。
[0021] hNGF-hFc融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。其中l-18aa为信号肽，19-121aa为前导肽，122-239aa为成熟肽，240-251aa为连接短肽，252-478aa为人IgG Fc片段， 其中252-270aa为铰链区，271-376aa为CH2区，377-478aa为CH3区。经重组分泌表达获得的 hNGF-hFc融合蛋白结构为成熟肽-连接短肽-hFc。所对应的核酸序列如SEQ ID N0:2所示， 其中l-54bp为hNGF信号肽序列；55-363bp为hNGF导肽序列；364-717bp为hNGF成熟肽序列； 718-753bp为连接短肽序列，该序列为赖氨酸-苏氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘 氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-缬氨酸-谷氨酸;754-1437bp为hlgG Fc段序列。
[0022]人NGF在体内以前体的形式合成，包括信号肽、前导肽和成熟肽。前导肽在NGF的表 达、折叠、分泌中起到了重要作用。前导肽中有两个保守区域为NGF表达、酶解形成成熟肽以 及分泌所必须的。研究证明，前导肽在NGF折叠过程中，起到了分子内分子伴侣的作用，有助 于NGF的正确折叠。前导肽包含潜在的N糖基化位点，N糖基化修饰后，有助于NGF转运出内质 网。因而与直接表达成熟hNGF序列相比，本发明中添加前导肽序列将利于hNGF的外源重组 表达，促进蛋白进行正确的表达后折叠、修饰及分泌，形成具有生物学活性的成熟hNGF。
[0023]人免疫球蛋白的Fc区域在免疫反应中起到重要作用。IgG的效应子功能由Fc介导 的两种机制实现:1.结合细胞表面Fc受体(FcgRs)，引起抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)途 径，由杀伤细胞通过吞噬作用或裂解作用而摄食病原体;2.与第一补体成分C1的Clq部分结 合，引发依赖于补体的细胞毒性（CDC)途径，从而裂解病原体。在IgG四种亚型中，IgGl和 IgG3能有效地结合FcgR，IgG4与FcgR的亲和力比IgGl或3低一个数量级，IgG2则不结合 FcgR。人IgGl和3可有效结合Clq，并激活补体级联反应，而IgG2对补体的结合作用很弱， IgG4不激活补体级联反应。hNGF-hFc用于人体治疗时，其与受体结合时，应避免较强的免疫 效应子作用而引起的细胞裂解。故本发明中，经比对IgG四种亚型序列，设计了一种来自人 IgG2及IgG4的混合人IgG Fc序列，用于减弱其免疫效应子作用。该序列混合了人IgG2的铰 链区及IgG4的CH2区和CH3区序列，并进行了密码子优化。
[0024]本发明其中一实施例显示β-hNGF-Fc具有比hNGF更强的体外稳定性，提示其具有 长效化应用的潜力。
[0025]本发明提供一种重组人β神经生长因子Fc融合蛋白（β-hNGF-Fc)的制备方法，其特 征在于，包括如下步骤：
[0026] 1)表达载体的构建：
[0027] 可使用多种哺乳动物细胞表达载体，表达载体中包含以下可操作性相连的元件： 启动子、外源序列插入位点、筛选标记基因。优选的，启动子与插入片段间包含增强子或内 含子等调控原件，以增强插入片段的表达。优选地，所述启动子为CMV启动子、PGK启动子、 RSV启动子或SV40启动子中的任意一种及它们的衍生启动子，用于启动β-hNGF-Fc与筛选标 记基因的表达。所述筛选标记基因为二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、谷氨酰胺合成酶(GS)基 因和抗生素抗性基因（新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、博来霉素抗性基因或多色霉素 抗性基因）中的任意一种。
[0028] 人工合成β-hNGF-Fc序列，插入表达载体得到融合蛋白表达载体。插入方式可为限 制性内切酶介导的克隆、TA克隆、非依赖性克隆(Ligase IndependnetClone)。
[0029] 获得的重组融合蛋白表达载体转化入E.coli T0P10,挑取阳性克隆，PCR鉴定、质 粒酶切鉴定和测序鉴定阳性克隆。鉴定获得的阳性克隆冻存于15%甘油中。
[0030] 2)工程细胞株的构建；
[0031] 可使用多种哺乳动物细胞系。优选地，所述细胞系为中国仓鼠 CH0细胞、人NIH293 细胞、C0S细胞或MDCK细胞及它们的衍生细胞系。
[0032] 将上述重组表达载体转染至哺乳动物细胞中，一种优选的转染方法是脂转染，也 可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉淀、电穿孔、原生质融合。
[0033] 转染后，依照筛选标记基因，筛选稳定表达细胞，并进行培养。通过极限稀释法对 稳定表达细胞进行亚克隆，并通过IgG Fc ELISA测定各单克隆表达量，筛选出表达量较高 的稳定表达单克隆细胞株。
[0034] 3)纯化分离 β-hNGF-Fc
[0035] 发酵培养高效稳定表达细胞株，一种优选的培养模式为流加方式进行补料培养。 至细胞活力低于70 %结束。
[0036]收集发酵培养产物，并纯化分离β-hNGF-Fc。多种层析方法均可以用于β-hNGF-Fc 的分离纯化，包括离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤。优选的方法是使用 Protein A亲和层析纯化分离β-hNGF-Fco
【附图说明】
[0037] 图1是pCHOl.O载体图谱图；
[0038] 图2是β-hNGF-Fc阳性克隆PCR验证电泳图谱；
[0039] 图3是β-hNGF-Fc阳性克隆质粒酶切验证电泳图谱；
[0040] 图4是AKTAPuriferlOO层析系统Protein A亲和层析纯化β-hNGF-Fc谱图；
[0041 ]图 5是 SDS-PAGE 分析 β-hNGF-Fc 图；
[0042]图6是β-hNGF-Fc融合蛋白刺激TF-1细胞增殖的剂量效应曲线图。
[0043] 图7是β-hNGF-Fc与hNGF体外活性与时间曲线图。
【具体实施方式】
[0044] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例 中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明 书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0045] 实施例1 :pCH01.0-hNGF-hFc表达载体的构建
[0046] hNGF-hFc核酸序列如SEQIDN0:2所示，翻译所得的氨基酸序列如SEQIDN0:l所 不。
[0047] SEQ ID N0:1 如下所示：
[0048] 1 MSM.FYTLIT AFLIGIQAEP HSBSNVPAGH TIPQAHWTKL QHSLDTALRR ARSAPAAAIA 61 ARVAGQTRNI TVDPRLFKKR RLRSPR￥LFS TQFPREMDT QDLDFEVGGA APFNRTHRSK 121 KSSSHFIFHR GEFSVCDSVS VWVaDKTTAT D1KGKEVMVL GEVNiNNSVF KQYFFETKCK 181 DPNPVDSGCR GIDSKHTOSY CTTTHTFVKA LTMDGKQAAW RFIRIDTACV CYLSRKAVRK 241 丁GGGSGGGSV ERKCCVECPP CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSQE 3:D1 DPEVQFMYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP 301 SSIEKTISKA KGQPREPQyY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN 421 NYKTTPPVLD S0GSFFLYSR LTYDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK*
[0049] 其中l-18aa为信号肽，19_121aa为前导肽，122_239aa为成熟肽，240_251aa为连接 短肽，252-478aa为Fc片段，经重组分泌表达获得的hNGF-hFc融合蛋白结构为成熟肽-连接 短肽 -hFc。
[0050] SEQ ID NO:2如下所示：
[0051] 1 ATGTCCATGT TGTTCTACAC TCTGATCACA GCTTTTCTGA TCGGCATACA GGCGGAACCA 61 CACTCAGAGA GG^aTGTCCG TGCAGGACAG ACCATCCCCC AAGCCCACTG GACTftAACTT 121 CAGCATTCCC TTGACACTGC CCTTCGCAGA GCCCGCAGCG CCCCGGCAGC GGCGATAGCT 181 GCACGCGTGG CGGGGCAGAC CCGCAACATT ACTGTGGACC CCAGGCTGTT TAAAAAGCGG 241 CGACTCCGTT CACCCCGTGT GCTGTTTAGC ACCCAGCCTC CCCGTGAAGC TGCAGACACT 301 CAGGATCTGG acttcgaggt cggtggtgct gcccccttca acaggactca caggagcaag
[0052] 361 CGGTCATCAT CCCA'rCCC灯 CneCACAGG GGCGMlTCr Cem'GTGTta CAGTGTCAGC 421 GTGTGGGTTG GGGAJAAGAG CAGGGCCACA GACATCAAGG GCAAGaGGT GATGGTGTTG 481 GGAGAGCTGA ACATTAACAA CAGTOTATTC AAACACTACT TTTTTGAaC GAAGTGCGGS 54:1 GAC€CAAATC CCGTTGACM GGGSTGCCGG GGCATTGACT CAAAGCACTG GMCTGATAT 601 TGTACCACGA CTCACACCTT TGTCAAGGCG CtGACCATeG ATGGGASGCA GGCTGCCTGG 661 C6GTTXATGG GGATAGATAC GGGCTGTGTG TGTaiGCTCA GGAGGAAGGC TGTGAGAAAA 72:1 ACXGGCGGCG GCTCAGGAGG AGGAXCAGTG GAACGGAAAT GCTGCGXCGA AXGCCeACCA 781 TGCCCAGCTC CACCAGTCGC TGGACCAAGC GTCTTCTTGT TCCCACCAAA GCCAAAGGAC 84:1 ACCTTGATGA TTAGCCGGAC CCCAGAAGTC ACCTGCGTCG TCGTCGACGT CAGCCAGGAA 901 GACCCAGAAG TCCAGTTCAA CTGGTACGTC GACGGAGTCG AAGTCCACAA CGCTAAGACC 961 AAGCCACGGG AAGAACAGTT CAACAGCACC TACCGGGTCG TCAGCGTCTT GACCGTCTTG 1021 CACCAGGACT GGTTGAACGG AAAGGAATAC AAGTGCAAGG TCAGCAACAA GGGATTGCCA 1081 AGCAGCATTG AAAAGACCA丁 TAGCAAGGCT AAGGGACAGC CACGGGAACC ACAGGTCTAC 1141 ACCTTGCCAC CAAGCCAGGA AGAAATGACC AAGAACCAGG TCAGCl'TGAC CTGCTTGGTC 1201 AAGGGATTCT ACCCAAGCGA CATTGCTGTC GAATGGGAAA GCAACGGACA GCCAGAAAAC 12S1 AACTACAAGA CCACCCCACC AGTCTTGGAC AGCGACGGAA GCTTCTTCTT GTACAGCCGG 1321 TTGACCGTCG ACAAGAGCCG GTGGCAGGAA GGAAACGTCT TCAGCTGCAG CGTCATGCAC 1381 GAAGCTTTGC ACAACCACTA GACCCAGAAG AGCTTGAGCT TGAGCTTGGG AMGTGA
[0053] 其中l-54bp为hNGF信号肽序列；55-363bp为hNGF导肽序列；364-717bp为hNGF成熟 肽序列；718-753bp为连接短肽序列，该序列为赖氨酸-苏氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝 氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-缬氨酸-谷氨酸;754-1437bp为hlgG Fc段序列。 [0054] 通过化学合成的办法合成序列SEQ ID N0:3,序列的上下游分别引入Xba I酶切位 点和BstZ17I酶切位点及保护碱基，Xba I酶切位点与ATG起始序列间引物Kozak序列 GCCACC。其中，TCTAGA为Xba I酶切位点（一 -所示），agacccaagctggctagc为保护碱基 (__所示hGTATAC为BstZ17I酶切位点（一-------._所示），ctagactcgagcggccgc为保护碱基（ 所示）。
[0055] SEQ ID N0:3如下所示：
[0056] .1 AGACCCAAGC TGGCTAGCTC TAGAGCCACC ATGTCCATGT TGTTCTACAC TCTGAICACA 61 GCTTTTCTGA TCGGCATACA GGCGGAACCA CACTCAGAGA GCAATGTCCC TGCAGGACAC 121 ACCATCCCCC AAGCCCACTG GACTAAACTT CAGCATTCCC TTGACACTGC CCTTCGCAGA 181 GCCCGCAGCG CCCCGGCAGC GGCGATAGCT GCACGCGTGG CGGGGCAGAC CCGCAACAH
[0057] 241 ACTGTGGACC CQGGCTGIT TAAAAAGCGG CGACTCCGTT CACCCCC/FGT GCTGTTTAGC 301 ACCCAGCCTC CCCGTGAAGC TGCAGACACT CAGGATCTGG ACTTCGAGGT CGGTGGTGCT 361 GCCCCCTTCA ACAGGACTCA CAGGAGCAAG CGGTCATCAT CCCATCCCAT CTTCCACAGG 421 GGCGAATTCT CGGTGTGTGA CAGTGTCAGC GTGTGGGTTG GGGATAAGAC CACCGCCACA 481 GACATCAAGG GCAAGGAGGT GATGGTGTTG GGAGAGGTGA ACATTAACAA CAGTGTATTC 541 AAACAGTACT TTTTTGAGAC CAAGTGCCGG GACCCAMTC CCGTTGACAG CGGGTGCCGG 6Q1 GGCATTGACT CAAAGCACTG GAACTCATAT TGTACCACGA CTCACACCTT TGTCAAGGCG 661 CTGACCATGG ATCGCAAGCA GGCTGCCTGG CGGTTTATCC GGATAGATAC GGCCTGTGTG 721 TGTGTGCTCA GCAGGAAGGC TGTGAGAAAA ACTGGCGGCG GCTCAGGAGG AGGATCAGTG 7&1 GAACGGAAAT GCTGCGTCGA ATGCCCACCA TGCCCAGCTC CACCAGTCGC TGGACCAAGC 841 GTCTTCTTGT TCCCACCAAA GCCMAGGAC ACCTTGATGA TTAGCCGGAC CCCAGAAGTC 901 ACCTGCGTCG TCGTCGACGT CAGCCAGGAA GACCCAGAAG TCCAGTTCAA CTGGTACGTC 961 GACGGAGTCG /\AGTCC7\CAA CGCTAAGACC AAGCCACGGG AAGAACAGTT CAACAGCACC 1021 TAGCGGGTCG TCAGCGTCTT GACCGTCTTG CACCAGGACT GGTTGAACGG AAAGGAATAC 1081 AAGTGGMGG TCAGCAACM. GGGATTGCCA AGGAGCATT6 AAMGACGAT TAGCAJGGCI 1141 AAGGGACAGG CACGGGAACC AGAGGTCTAC ACCTTGCGAC CAAGCGAGGA AGAAATGACG 1201 AAGAACCAGG 丁CA6CTTGAC CTGCTT€fiTC AAGG6ATTCT ACCCAAGCGA CATTGCTGTC 1261 GMTGGGMA GCMCGGAGA GGCAGAAAAC AACTACMGA CCACCCCACC AGTCTTGGAC 1321 AGCGACGGAA GCTTCTTCTT GTACAGCCGG TTGACCGTCG ACMGAGCCG GTGGCMGAA 1381 GGAAilCGTGT TGAGCTGCAG CGTCATGGAC GAASCTTTGC ACMCCACTA CACCGAGAAG 1441 AGCTTGAGCI TGAGCTTG6G AAAGTGACXA TACCTAGACT CgAfiCGGCCG C
[0058] 本实施例中使用的表达载体为pCHO 1.0，载体图谱如图1所示。由位点1开始，该载 体含PGK启动子-DHFR基因表达框，用于表达DHFR基因；EF2/CMV混合启动子-插入序列表达 框，用于表达插入的的β-hNGF-Fc序列;PGK启动子-嘌呤霉素抗性基因表达框，用于表达嘌 呤霉素抗性基因。含该载体的细胞克隆可使用甲氨蝶呤(MTX)及嘌呤霉素进行双重筛选。 [0059] 利用限制性内切酶Xba I与BstZ17I双酶切合成序列，利用限制性内切酶Avr Π 与 BstZl71双酶切质粒pCHOl. 0，其中Xba I与Avr Π 为同尾酶。然后乙醇沉淀回收纯化酶切产 物。使用T4DNA Ligase将酶切产物进行连接反应得到重组表达载体pCHOl .Ο-hNGF-hFc。将 连接产物转化至E.coliToplO(Novagen)，经菌液PCR鉴定(结果见图2，Μ为marker，1和2为检 测的菌落，均有1500bp左右的明显条带，说明1和2均为PCR鉴定阳性的菌落）、质粒酶切鉴定 (结果见图3，M为marker，1为检测质粒的酶切结果，从图中可以看到有1500bp左右的清晰条 带，说明检测质粒酶切鉴定结果正确）和测序鉴定后，将序列正确的pCHOl.O-hNGF-hFc克 隆-80°C冻存于15%甘油中，备用。
[0060] 实施例2:0-hNGF_Fc重组细胞株的构建与筛选
[0061 ]质粒纯化:使用质粒大提试剂盒提取纯化质粒PCH01.0-hNGF-hFc，使用Bio-Spec-Nano测定质粒的浓度及纯度。用于转染的质粒其浓度需彡1.Oyg/yl，A260/A280 = 1.7-1.9。 若浓度不足，使用异丙醇沉淀质粒并浓缩至适当浓度。
[0062] CH0细胞活化:从液氮中取出冻存的CH0细胞，去除保护液，加适量⑶FortiCHO培 养基至细胞密度为5 X 105，于125ml摇瓶中，37°C，100r/min，5 %⑶2条件下培养。细胞密度 至2 X 106时，使用适量培养基稀释至5 X 105，直至细胞活力达90 %以上。
[0063]转染:转染当天，细胞密度为IX 106,活力应大于90%。细胞、转染试剂、质粒的比 例见表1:
[0064] 表1转染体系配置
[0065]
[0066] 按上表，准备15ml CH0细胞，取1.5ml CD FortiCHO培养液，加入15yg质粒 pCHOl. 0-hNGF-hFc，混匀，加入45μ1转染试剂，混匀，室温静置20min，然后将转染反应混合 物加入至细胞中，轻轻混匀。细胞置于37°C，100r/min，5%C02条件下培养。任意体积的细胞 均可以进行转染，转染试剂与DNA也可以其它比例进行混合。
[0067] 稳定表达细胞的筛选:转染24h后，将细胞密度稀释至3 X105,加入MTX至终浓度 100nM，37 °C，100r/min，5 % C02条件下继续培养。细胞密度至5 X 105时，稀释至3 X 105，直至 细胞活力达80 %以上，表明细胞已适应该浓度选择压力。然后递增MTX的浓度，依次为 200nM、500nM、1000nM。通过极限稀释法进行亚克隆，通过抗IgGFcELISA测定β-hNGF-Fc表 达量，挑选分泌表达水平高的单克隆。
[0068] 实施例3 :f3-hNGF-Fc的重组表达、分离纯化及定性
[0069] 重组表达
[0070]将实施例2中获得的β-hNGF-Fc重组细胞株进行流加培养。种子细胞培养至密度2 X106,活力90%以上即可接种发酵，发酵初始密度5X105。每天测定细胞的密度、活力以及 培养液中葡萄糖含量，并补充FeedC培养基，使培养液中葡萄糖终浓度为4g/L。细胞活力< 70 %时发酵结束。离心收集培养液，用于分离纯化。
[0071 ] Protein A亲和层析分离纯化β-hNGF-Fc
[0072] 使用AKTAPuriferlOO层析系统来进行亲和层析，色谱柱为HiTrapMabSelect lmL。 仪器操作按操作指南进行，A1栗为Buffer A( 50mM磷酸盐缓冲液，lOOmMNaCl，pH7.0)，B1栗 为Buf f er B(50mM醋酸盐缓冲液，pH3.5)。
[0073] 清洗：以0.1M NaOH，流速lml/min，冲洗ProteinA凝胶柱5个柱体积(CV)，再用超纯 水以流速1 m 1 /m i η清洗5 c v，去除P r 〇 t e i η A凝胶上的杂志残留。
[0074] 平衡:Buffer A以lml/min流速冲洗10CV，以维持ProteinA凝胶环境适合β-hNGF- Fc与ProteinA的结合。
[0075] 上样:澄清过滤后的发酵液以lml/min的速率通过ProteinA凝胶，使β-hNGF-Fc与 ProteinA能特异性的结合。
[0076] 冲平:Buffer A以lml/min流速冲洗至280nm吸收值低于0.01。
[0077] 洗脱：以lml/min流速，Buffer B冲洗ProteinA凝胶，收集洗脱峰。
[0078] 中和:洗脱峰收集样品用2mol/L Tris-Cl，pH9.0调pH至5.6。
[0079] 结果见图4。从图中可以看出：pH降低至3.5后，洗脱得到一个单一的、尖锐的洗脱 峰。SDS-PAGE分析:SDS-PAGE检测分析纯化得到的β-hNGF-Fc。使用12 %分离胶。结果显示， 还原条件下，纯化的蛋白迀移至约40kDa，无显著聚合物与杂蛋白存在。结果见图51为 marker，1为纯化的蛋白。
[0080] 实施例4:体外生物活性分析
[0081] 参照2015版《中国药典》鼠神经生长因子生物学活性测定法，第二法：TF-1细胞/ MTS比色法。
[0082] TF-1细胞法是基于TF-1细胞系的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)高度依 赖性，利用NGF与TF-1细胞表面的NGF高亲和力受体TrkA结合后诱导TF-1细胞增殖的特点， 建立的一种新的NGF活性测定方法。该方法目前已成为检测重组人神经生长因子(rhNGF) WHO参考品的标准方法。
[0083] TF-1细胞培养:TF-1细胞株用完全培养基于37°C、5 %二氧化碳培养箱中培养，控 制细胞浓度为每lml含1.0 X 105~5.0 X 105个细胞，传代后第二天用于NGF生物学活性测定。 细胞悬液制备：取足量细胞培养液l〇〇〇rpm离心5min，弃去上清，收集TF-1细胞。加入5ml基 础培养基重悬细胞，lOOOrpm离心5min后弃去上清，如此洗3次后重悬于基础培养基并配成 每lml约含6.0X10 4个细胞的细胞悬液，置于37°C、5%二氧化碳条件下备用。
[0084] 标准品溶液制备:取1支分装好的重组人神经生长因子活性标准品（购自英国国家 生物学标准和质控物研究所(NIBSC)，货号93/556)，用基础培养基稀释10倍，至每lml含 100U〇
[0085] 检品溶液制备：检品用基础培养基进行预稀释，每步稀释最大不超过10倍，至每 lml 约含 100U。
[0086]检品梯度制备：
[0087] 96孔细胞培养板选取除第1列和第12列外的相邻两列作为标准品列或检品列； [0088]在96孔细胞培养板的检品列和标准品列除A孔外，每孔加入100μ1基础培养基；
[0089] 检品列或标准品列Α孔每孔分别加入150μ1检品洛液或标准品洛液；
[0090] 自Α行至Η行将检品溶液或标准品溶液进行3倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释 度做2个复孔，每孔分别留100μ1溶液，弃去孔中多余溶液；
[0091] 向检品列和标准品列每孔加入100μ1细胞悬液，向空白列每孔加入200μ1无菌水； [0092]将96孔细胞培养板放入湿盒中，于37°C、5%二氧化碳的培养箱中静置培养66-72h〇
[0093] 检品列和标准品列每孔加入MTS溶液20μ1后将96孔板放回湿盒中，于37°C、5 %二 氧化碳的培养箱中静置培养3h。
[0094] 将96孔细胞培养板放入酶标仪，以550nm为参比波长，在波长490nm处测定吸光度， 记录测定结果。
[0095] 结果判定：
[0096] 试验数据采用SoftMax?Pro 5Software数据分析软件进行处理，并编入按下式计 算结果：
[0097] 检品生物学活性(U/ml) = Pr X (Ds X Es) /(Dr X Er)
[0098] 式中，Pr为标准品生物学活性，U/ml;
[0099] Ds为检品预稀释倍数；
[0100] Dr为标准品预稀释倍数；
[0101] Es为检品相当于标准品半效量的稀释倍数；
[0102] Er为标准品半效量的稀释倍数。
[0103] 检品比活性(U/mg)=检品生物学活性/蛋白含量。
[0104] β-hNGF-Fc融合蛋白刺激TF-1细胞增殖剂量的效应曲线如图6，四参数如表2所示， 拟合方程为y = (A-D) / (1+(x/C Γ B) +D。从图中可以看出，β-hNGF-Fc融合蛋白与标准品的剂 量效应曲线一致，说明该条件下，β-hNGF-Fc刺激TF-1细胞的效应与hNGF相近。该曲线均符 合四参数拟合方程。计算表明β-hNGF-Fc融合蛋白的比活为3.57X 105U/mg。按摩尔质量换 算，相对于β-hNGF比活> 1 X 106U/mg，与标准品的比活相当。活性实验表明，β-hNGF-Fc具有 与hNGF相当的体外生物学活性。
[0105] 表2剂量效应参数
[0106]
[0107] 实施例5:体外稳定性分析
[0108] 分别取β-hNGF-Fc及hNGF(重组人神经生长因子活性标准品（购自英国国家生物学 标准和质控物研究所(NIBSC)，货号93/556)，浓度为0.05ymol/ml，溶于pH 7.0、50mM磷酸盐 缓冲液中，放置于37°C保温。每周取样测定活性残留量，以初始比活为100%相对活性，实验 设置三个重复。变化曲线如图7所示，其中NGF活性标准品即为hNGF。从图中看出，经过4周， β-hNGF-Fc的活性损失较hNGF缓慢，hNGF活性残留2.24 %，而β-hNGF-Fc活性残留27.38 %。 结果显示β-hNGF-Fc的体外稳定性显著强于hNGF。该结果提示β-hNGF-Fc具有长效化应用前 景。
[0109] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨 的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种重组β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白依次由人β NGF、短肽接头和人IgG Fc所示氨基酸序列组成。2. 如权利要求1所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述短肽接头序列为不多 于20个氨基酸的序列;优选的，所述短肽接头含有甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸中至少 两个氨基酸的序列；更优选的，所述短肽接头序列为赖氨酸-苏氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨 酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-缬氨酸-谷氨酸所示序列。3. 如权利要求1所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的人IgG Fc片段含人 IgG铰链区、CH2和CH3区。4. 如权利要求1所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白所示序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示;优选的，所述融合蛋白所对应的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。5. 如权利要求1-4任一项所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白，其特征在于，所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白在摩尔基础上，具有与人NGF相当或更高的体外生物活性。6. -种重组子，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白序 列。7. -种细胞株，其特征在于，含有权利要求6所述重组子;优选的，所述细胞株为哺乳动 物细胞株;更优选的，所述哺乳动物细胞株为CHO细胞衍生的细胞株。8. -种重组β-hNGF-Fc融合蛋白制备方法，其特征在于，所述方法包括： 构建含β-hNGF-Fc融合蛋白的重组表达载体； 将重组表达载体转染入哺乳动物细胞，并筛选高效稳定表达的细胞株； 发酵培养所得高效稳定表达的细胞株，收集培养液并纯化细胞分泌出的β-hNGF-Fc融 合蛋白。9. 如权利要求8所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白制备方法，其特征在于，所述β-hNGF-Fc的 蛋白序列如SEQ ID ΝΟ:1所示;优选的，所对应的β-hNGF-Fc核酸序列如SEQ ID NO:2所示； 任选的，所述哺乳动物细胞为CHO细胞、人NIH293细胞、COS细胞或MDCK细胞及它们的衍 生细胞系。10. 权利要求1-5任一项所述重组β-hNGF-Fc融合蛋白，权利要求6所述重组子或权利要 求7所述细胞株用于周围神经病变、神经损伤的恢复及神经生长因子长效化应用的用途。
【文档编号】C12N5/10GK106008722SQ201610617323
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】张文宇, 黄奋飞, 章永垒, 白羊, 陈星 , 阮卡, 陈胜亮, 葛平辉, 邹有土, 马燕玲, 王明灶
【申请人】未名生物医药有限公司