一种透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料的制备方法，属于复合材料领域。本发明对鸡软骨分别进行碱处理、酶解处理、脱色处理，再进行提纯后通过透析和纳滤膜纳滤得纯小分子硫酸软骨素，将硫酸软骨素和透明质酸进行交联反应得到复合材料，本发明制备得到高纯度小分子硫酸软骨素，与透明质酸之间有具有非常好的生物相容性，将其和透明质酸进行交联反应，可利用透明质酸能渗入真皮，促进皮肤吸收等特性从而提高硫酸软骨素的生物活性和生物利用率，制备得到的复合材料可以广泛应用于药品、保健食品以及化妆品行业的原料。
【专利说明】
一种透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料的制备方法
技术领域
[0001]本发明公开了一种透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料的制备方法，属于复合材料领域。
【背景技术】
[0002]硫酸软骨素是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，通常由动物软骨组织中提取的硫酸软骨素的相对分子量(Mr)—般在20000Da以上，对于(Mr)降低到1000Da或更低时，称其为低分子硫酸软骨素。现有生产技术均先由动物软骨得到硫酸软骨素成品，再经过降解得到低分子量硫酸软骨素产品，或直接购买市售硫酸软骨素原料制备低分子量硫酸软骨素产品。其工艺需要重复进行纯化、沉淀、干燥等操作，工序繁杂且成本高。另外，国内硫酸软骨素降解工艺研究较少，常见的降解方法有酶法、酸法、过氧化氢法等，但均有其不完善的地方。与普通硫酸软骨素相比，低分子硫酸软骨素经口服更容易被吸收，所以生物利用度更高，其保健医疗生物活性更明显，被认为是新一代的(硫酸软骨素)产品，具有良好的应用开发前景。
[0003]低分子硫酸软骨素具有影响破骨细胞分化、促软骨形成、促真皮纤维细胞生成等作用，更有利于骨关节炎的治疗和关节功能的恢复，抗自由基氧化能力更强。低分子量硫酸软骨素可以作为一种抗阿尔茨海默病的候选活性成分，用于制备治疗、改善或预防认知功能衰退相关的神经系统疾病的药物，因小分子的多糖更易于通过血脑屏障，更容易作用于学习记忆相关的大脑海马区，对Αβ诱导产生的神经细胞毒性具有抑制作用。
【发明内容】
[0004]本发明主要解决的技术问题:针对制备小分子硫酸软骨素制备工艺复杂，纯度和收率低，而且应用时人体吸收率低的问题，提供了一种透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料的制备方法，本发明对鸡软骨分别进行碱处理、酶解处理、脱色处理，再进行提纯后通过透析和纳滤膜纳滤得纯小分子硫酸软骨素，将硫酸软骨素和透明质酸进行交联反应得到复合材料，本发明制备得到高纯度小分子硫酸软骨素，与透明质酸之间有具有非常好的生物相容性，将其和透明质酸进行交联反应，可利用透明质酸能渗入真皮，促进皮肤吸收等特性从而提高硫酸软骨素的生物活性和生物利用率，制备得到的复合材料可以广泛应用于药品、保健食品以及化妆品行业的原料。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)称取300?500g鸡软骨，按固液比1:8与水混合，混合后用质量分数25%氢氧化钠溶液调节PH为7.5?8.5，放入锅中沸腾煮制2?3h，取出冷却后剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，放入烘箱中在50?600C下干燥5?6h，干燥后粉碎、过筛得40?50目软骨颗粒；
(2)将上述软骨颗粒按质量比1:5与质量分数95%乙醇溶液混合，加入总质量0.5?0.7%碳酸氢钠粉末，搅拌混合后浸泡I?2h，向浸泡液中加入氯化钠固体，使氯化钠在浸泡液中的浓度为3?5%，继续浸泡2?3h后过滤取出得滤渣；
(3)将上述滤渣按固液比1:7溶于水中，调节pH为8?9后向其中加入滤渣质量3?5%胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比I: 2的混合酶，并在50?60°(:保温酶解3?4h，酶解后对酶解液加热至沸腾，灭酶处理2?3min，灭酶后过滤得到粗硫酸软骨素溶液；
(4)将上述粗硫酸软骨素溶液中加入溶液质量5?10%活性炭，在60?70°C下脱色40?50min，脱色后过滤，将滤液用质量分数5%盐酸调节pH至6?7，调节后加入溶液体积2?3倍质量分数90%乙醇溶液，静置待沉淀完全析出后过滤，得滤渣即为硫酸软骨素，最后将硫酸软骨素按质量比1:80溶解蒸馏水中，将溶液用截留分子量为5000?6000Da透析袋透析20?30h，将透析液用纳滤膜进行纳滤浓缩，脱除平均分子量小于2500Da硫酸软骨素和杂质，将得到的浓缩液喷雾干燥即可得到高纯度小分子硫酸软骨素；
(5)在装有搅拌器的三口烧瓶中，分别加入3?5g上述制备得到的硫酸软骨素、0.8?1.2g透明质酸和100?120mL蒸馏水，搅拌至固体溶解，向溶解液中加入总体积50?60%pH为7.5磷酸盐缓冲液，放入冰水浴中，在O?5 °C下加入8?1mL质量分数30%双氧水和0.1?
0.3g过氧化二异丙苯，搅拌交联15?25min后移入水浴中在40?60 °C下继续交联I?2h，交联结束后停止反应，将反应物抽真空冷冻干燥，即可得到透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料。
[0006]本发明的应用方法:可将本发明制备得到复合材料制成治疗关节的软膏，药物组合是每10g中含6?8g本发明制备的复合材料，0.4?0.6g乙酰水杨酸钠、0.5?1.0g抗坏血酸，0.6?0.8g维生素E，0.3?0.5g肝素，I?3g烧基酸聚氧乙稀醚，10?12g甘油，剩下为白凡士林，在乳油中乳化即可得到，用于关节局部使用的软膏，利于骨关节炎的治疗和关节功能的恢复。
[0007]本发明的有益效果是:
(1)本发明制备得到硫酸软骨素纯度达到92%以上，分子量在2500?6000Da;
(2)透明质酸之间有具有非常好的生物相容性，将其和透明质酸进行交联反应，可利用透明质酸能渗入真皮，促进皮肤吸收等特性从而提高硫酸软骨素的生物活性和生物利用率；
(3)本发明制备工艺简单，成本低，制备得到的复合材料可以广泛应用于药品、保健食品以及化妆品行业的原料。
【具体实施方式】
[0008]称取300?500g鸡软骨，按固液比1:8与水混合，混合后用质量分数25%氢氧化钠溶液调节PH为7.5?8.5，放入锅中沸腾煮制2?3h，取出冷却后剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，放入烘箱中在50?600C下干燥5?6h，干燥后粉碎、过筛得40?50目软骨颗粒;将上述软骨颗粒按质量比1:5与质量分数95%乙醇溶液混合，加入总质量0.5?
0.7%碳酸氢钠粉末，搅拌混合后浸泡I?2h，向浸泡液中加入氯化钠固体，使氯化钠在浸泡液中的浓度为3?5%，继续浸泡2?3h后过滤取出得滤渣;将上述滤渣按固液比1: 7溶于水中，调节pH为8?9后向其中加入滤渣质量3?5%胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比I: 2的混合酶，并在50?60 °(:保温酶解3?4h，酶解后对酶解液加热至沸腾，灭酶处理2?3min，灭酶后过滤得到粗硫酸软骨素溶液;将上述粗硫酸软骨素溶液中加入溶液质量5?10%活性炭，在60?70 °C下脱色40?50min，脱色后过滤，将滤液用质量分数5%盐酸调节pH至6?7，调节后加入溶液体积2?3倍质量分数90%乙醇溶液，静置待沉淀完全析出后过滤，得滤渣即为硫酸软骨素，最后将硫酸软骨素按质量比1:80溶解蒸馏水中，将溶液用截留分子量为5000?6000Da透析袋透析20?30h，将透析液用纳滤膜进行纳滤浓缩，脱除平均分子量小于2500Da硫酸软骨素和杂质，将得到的浓缩液喷雾干燥即可得到高纯度小分子硫酸软骨素;在装有搅拌器的三口烧瓶中，分别加入3?5g上述制备得到的硫酸软骨素、0.8?1.2g透明质酸和100?120mL蒸馏水，搅拌至固体溶解，向溶解液中加入总体积50?60%pH为7.5磷酸盐缓冲液，放入冰水浴中，在O?5°C下加入8?1mL质量分数30%双氧水和0.1?0.3g过氧化二异丙苯，搅拌交联15?25min后移入水浴中在40?60 °C下继续交联I?2h，交联结束后停止反应，将反应物抽真空冷冻干燥，即可得到透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料。
[0009]实例I
称取300g鸡软骨，按固液比1:8与水混合，混合后用质量分数25%氢氧化钠溶液调节pH为7.5，放入锅中沸腾煮制2h，取出冷却后剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，放入烘箱中在50°C下干燥5h，干燥后粉碎、过筛得40目软骨颗粒;将上述软骨颗粒按质量比I: 5与质量分数95%乙醇溶液混合，加入总质量0.5%碳酸氢钠粉末，搅拌混合后浸泡Ih，向浸泡液中加入氯化钠固体，使氯化钠在浸泡液中的浓度为3%，继续浸泡2h后过滤取出得滤渣;将上述滤渣按固液比I: 7溶于水中，调节pH为8后向其中加入滤渣质量3%胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比1: 2的混合酶，并在50°C保温酶解3h，酶解后对酶解液加热至沸腾，灭酶处理2min，灭酶后过滤得到粗硫酸软骨素溶液;将上述粗硫酸软骨素溶液中加入溶液质量5%活性炭，在60°C下脱色40min，脱色后过滤，将滤液用质量分数5%盐酸调节pH至6，调节后加入溶液体积2倍质量分数90%乙醇溶液，静置待沉淀完全析出后过滤，得滤渣即为硫酸软骨素，最后将硫酸软骨素按质量比1:80溶解蒸馈水中，将溶液用截留分子量为5000Da透析袋透析20h，将透析液用纳滤膜进行纳滤浓缩，脱除平均分子量小于2500Da硫酸软骨素和杂质，将得到的浓缩液喷雾干燥即可得到高纯度小分子硫酸软骨素;在装有搅拌器的三口烧瓶中，分别加入3g上述制备得到的硫酸软骨素、0.Sg透明质酸和10mL蒸馏水，搅拌至固体溶解，向溶解液中加入总体积50%pH为7.5磷酸盐缓冲液，放入冰水浴中，在O°C下加入8mL质量分数30%双氧水和0.1g过氧化二异丙苯，搅拌交联15min后移入水浴中在40°C下继续交联lh，交联结束后停止反应，将反应物抽真空冷冻干燥，即可得到透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料。
[0010]可将本发明制备得到复合材料制成治疗关节的软膏，药物组合是每10g中含Sg本发明制备的复合材料，0.6g乙酰水杨酸钠、1.0g抗坏血酸，0.Sg维生素E，0.5g肝素，3g烷基酚聚氧乙烯醚，12g甘油，剩下为白凡士林，在乳油中乳化即可得到，用于关节局部使用的软膏，利于骨关节炎的治疗和关节功能的恢复。
[0011]实例2
称取400g鸡软骨，按固液比1:8与水混合，混合后用质量分数25%氢氧化钠溶液调节pH为8.0，放入锅中沸腾煮制2.5h，取出冷却后剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，放入烘箱中在55 °C下干燥5.5h，干燥后粉碎、过筛得45目软骨颗粒;将上述软骨颗粒按质量比I: 5与质量分数95%乙醇溶液混合，加入总质量0.6%碳酸氢钠粉末，搅拌混合后浸泡1.5h，向浸泡液中加入氯化钠固体，使氯化钠在浸泡液中的浓度为4%，继续浸泡2.5h后过滤取出得滤渣;将上述滤渣按固液比I: 7溶于水中，调节pH为8.5后向其中加入滤渣质量4%胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比I: 2的混合酶，并在55°C保温酶解3.5h，酶解后对酶解液加热至沸腾，灭酶处理2.5min，灭酶后过滤得到粗硫酸软骨素溶液;将上述粗硫酸软骨素溶液中加入溶液质量7%活性炭，在65 0C下脱色45min，脱色后过滤，将滤液用质量分数5%盐酸调节pH至6.5，调节后加入溶液体积2.5倍质量分数90%乙醇溶液，静置待沉淀完全析出后过滤，得滤渣即为硫酸软骨素，最后将硫酸软骨素按质量比I: 80溶解蒸馏水中，将溶液用截留分子量为5500Da透析袋透析25h，将透析液用纳滤膜进行纳滤浓缩，脱除平均分子量小于2500Da硫酸软骨素和杂质，将得到的浓缩液喷雾干燥即可得到高纯度小分子硫酸软骨素；在装有搅拌器的三口烧瓶中，分别加入4g上述制备得到的硫酸软骨素、1.0g透明质酸和I 1mL蒸馏水，搅拌至固体溶解，向溶解液中加入总体积55%pH为7.5磷酸盐缓冲液，放入冰水浴中，在3 °C下加入9mL质量分数30%双氧水和0.2g过氧化二异丙苯，搅拌交联20min后移入水浴中在50°C下继续交联1.5h，交联结束后停止反应，将反应物抽真空冷冻干燥，即可得到透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料。
[0012]可将本发明制备得到复合材料制成治疗关节的软膏，药物组合是每10g中含7g本发明制备的复合材料，0.5g乙酰水杨酸钠、0.7g抗坏血酸，0.7g维生素E，0.4g肝素，2g烷基酚聚氧乙烯醚，Ilg甘油，剩下为白凡士林，在乳油中乳化即可得到，用于关节局部使用的软膏，利于骨关节炎的治疗和关节功能的恢复。
[0013]实例3
称取500g鸡软骨，按固液比1:8与水混合，混合后用质量分数25%氢氧化钠溶液调节pH为8.5，放入锅中沸腾煮制3h，取出冷却后剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，放入烘箱中在60°C下干燥6h，干燥后粉碎、过筛得50目软骨颗粒;将上述软骨颗粒按质量比I: 5与质量分数95%乙醇溶液混合，加入总质量0.7%碳酸氢钠粉末，搅拌混合后浸泡2h，向浸泡液中加入氯化钠固体，使氯化钠在浸泡液中的浓度为5%，继续浸泡3h后过滤取出得滤渣;将上述滤渣按固液比I: 7溶于水中，调节pH为9后向其中加入滤渣质量5%胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比1: 2的混合酶，并在60°C保温酶解4h，酶解后对酶解液加热至沸腾，灭酶处理3min，灭酶后过滤得到粗硫酸软骨素溶液;将上述粗硫酸软骨素溶液中加入溶液质量10%活性炭，在70°C下脱色50min，脱色后过滤，将滤液用质量分数5%盐酸调节pH至7，调节后加入溶液体积3倍质量分数90%乙醇溶液，静置待沉淀完全析出后过滤，得滤渣即为硫酸软骨素，最后将硫酸软骨素按质量比1:80溶解蒸馈水中，将溶液用截留分子量为6000Da透析袋透析30h，将透析液用纳滤膜进行纳滤浓缩，脱除平均分子量小于2500Da硫酸软骨素和杂质，将得到的浓缩液喷雾干燥即可得到高纯度小分子硫酸软骨素;在装有搅拌器的三口烧瓶中，分别加入5g上述制备得到的硫酸软骨素、1.2g透明质酸和120mL蒸馏水，搅拌至固体溶解，向溶解液中加入总体积60%pH为7.5磷酸盐缓冲液，放入冰水浴中，在5 °C下加入1mL质量分数30%双氧水和0.3g过氧化二异丙苯，搅拌交联25min后移入水浴中在60 °C下继续交联2h，交联结束后停止反应，将反应物抽真空冷冻干燥，即可得到透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料。
[0014]可将本发明制备得到复合材料制成治疗关节的软膏，药物组合是每10g中含Sg本发明制备的复合材料，0.6g乙酰水杨酸钠、1.0g抗坏血酸，0.Sg维生素E，0.5g肝素，3g烷基酚聚氧乙烯醚，12g甘油，剩下为白凡士林，在乳油中乳化即可得到，用于关节局部使用的软膏，利于骨关节炎的治疗和关节功能的恢复。
【主权项】
1.一种透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料的制备方法，其特征在于具体制备步骤为: 称取300?500g鸡软骨，按固液比1:8与水混合，混合后用质量分数25%氢氧化钠溶液调节pH为7.5?8.5，放入锅中沸腾煮制2?3h，取出冷却后剔除软骨上少量残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，放入烘箱中在50?60°C下干燥5?6h，干燥后粉碎、过筛得40?50目软骨颗粒； 将上述软骨颗粒按质量比1: 5与质量分数95%乙醇溶液混合，加入总质量0.5?0.7%碳酸氢钠粉末，搅拌混合后浸泡I?2h，向浸泡液中加入氯化钠固体，使氯化钠在浸泡液中的浓度为3?5%，继续浸泡2?3h后过滤取出得滤渣； 将上述滤渣按固液比1:7溶于水中，调节pH为8?9后向其中加入滤渣质量3?5%胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按质量比I: 2的混合酶，并在50?60 °(:保温酶解3?4h，酶解后对酶解液加热至沸腾，灭酶处理2?3min，灭酶后过滤得到粗硫酸软骨素溶液； 将上述粗硫酸软骨素溶液中加入溶液质量5?10%活性炭，在60?70 °C下脱色40?50min，脱色后过滤，将滤液用质量分数5%盐酸调节pH至6?7，调节后加入溶液体积2?3倍质量分数90%乙醇溶液，静置待沉淀完全析出后过滤，得滤渣即为硫酸软骨素，最后将硫酸软骨素按质量比1:80溶解蒸馏水中，将溶液用截留分子量为5000?6000Da透析袋透析20?30h，将透析液用纳滤膜进行纳滤浓缩，脱除平均分子量小于2500Da硫酸软骨素和杂质，将得到的浓缩液喷雾干燥即可得到高纯度小分子硫酸软骨素； 在装有搅拌器的三口烧瓶中，分别加入3?5g上述制备得到的硫酸软骨素、0.8?1.2g透明质酸和100?120mL蒸馏水，搅拌至固体溶解，向溶解液中加入总体积50?60%pH为7.5磷酸盐缓冲液，放入冰水浴中，在O?5 °C下加入8?1mL质量分数30%双氧水和0.1?0.3g过氧化二异丙苯，搅拌交联15?25min后移入水浴中在40?60 °C下继续交联I?2h，交联结束后停止反应，将反应物抽真空冷冻干燥，即可得到透明质酸接枝小分子硫酸软骨素复合材料。
【文档编号】C08J3/24GK106009068SQ201610469291
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月25日
【发明人】仇颖超, 王统军
【申请人】仇颖超