生产亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法

生产亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种生产α?亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法。本发明通过从多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)胞内克隆得到活性较高的Δ15脱饱和酶基因，连接至经过改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300，转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞内并通过共培养将Δ15脱饱和酶基因结合至圆红冬孢酵母的基因组上，实现多形汉逊酵母Δ15脱饱和酶在圆红冬孢酵母胞内的过表达，从而增加α?亚麻酸在圆红冬孢酵母胞内的产量。
【专利说明】
生产亚麻酸的圆红冬抱酵母及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及α-亚麻酸的生产领域，尤其设及一种生产α-亚麻酸的圆红冬抱酵母及 其制备方法和生产α-亚麻酸的方法。
【背景技术】
[0002] α-亚麻酸(Cis Δ 9,12,15,英文缩写ALA)属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，为全顺式 9,12,15-十八碳Ξ締酸，它在人体内不能合成，必须从体外食物中获取，多W不饱和甘油醋 的形式存在于亚麻巧、沙棘巧、大豆等植物中。α-亚麻酸在人体内通过一系列的碳链延长和 脱饱和反应能够被转化为机体必需的二十碳五締酸化ΡΑ)和二十二碳六締酸(DHA)，然而， 曰-亚麻酸比ΕΡΑ和DHA的作用更好并且更安全，它是构成人体组织细胞的主要成分，如果人 体缺乏，便会引起机体脂质体代谢素乱，会直接导致疲劳、健忘、视力减退、免疫力下降、动 脉粥样硬化等症状的发生。目前国内外已有明确报道:如果婴幼儿童或青少年缺乏α-亚麻 酸，会严重影响智力的正常发育。美国国家食品药品监督管理局的研究证明，缺乏α-亚麻酸 将导致儿童大脑及视网膜发育迟缓，营养吸收不均衡或者不能被有效吸收，同时会导致注 意力不集中和智力发育迟缓、弱视、多动症、肥胖、厌食W及免疫力低下等多种症状和疾病。 成年人缺乏α-亚麻酸，体内的维生素、矿物质、氨基酸、蛋白质等物质不能被有效吸收和利 用，甚至会出现代谢素乱症状。
[0003] 从自然界植物中提取α-亚麻酸的成本高且产率低，不适合工业化生产的需求。近 年来利用微生物生产多不饱和脂肪酸成为研究热点。利用微生物生产多不饱和脂肪酸具有 简单、过程可控、易放大、不受天气环境影响等优点。圆红冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides)是自然界中为数不多的可W合成多不饱和脂肪酸的酵母，运种产油酵母具有 营养需求简单、易进行放大和高密度培养、遗传背景比较清楚等优势。圆红冬抱酵母胞内可 W合成并积累α-亚麻酸，然而产量并不高，因而强化圆红冬抱酵母生产α-亚麻酸具有重要 的研究和应用价值。目前利用培养和发酵优化的方法对于增加圆红冬抱酵母生产α-亚麻酸 的效果并不理想，所W必须从基因水平强化圆红冬抱酵母胞内α-亚麻酸的代谢途径，进而 达到增加 α-亚麻酸产量的目的。然而，圆红冬抱酵母属于粘红酵母菌，对于运类酵母的遗传 操作方法比较有限。
[0004] 另外，α-亚麻酸在圆红冬抱酵母胞内的合成途径是先由硬脂酸经过Δ 9脱饱和酶 (FAD9)催化生成油酸;再由Δ 12脱饱和酶(FAD12)催化油酸生成亚油酸;最后经过Δ 15脱饱 和酶(FAD15)催化生成α-亚麻酸。在运条合成途径中Δ 15脱饱和酶是主要的限速酶，正是由 于圆红冬胞酵母胞内A 15脱饱和酶的低活性限制了α-亚麻酸的产量。但是如何增强Δ 15脱 饱和酶的活性，强化从亚油酸到α-亚麻酸的合成途径，进而增加圆红冬胞酵母合成α-亚麻 酸的产量是长期W来一直面临的重要难题。

【发明内容】

[0005] 为了克服现有技术无法大幅度提高圆红冬抱酵母(Rhodosporidium toruloides ACCC 20%1)生产α-亚麻酸的问题，本申请的发明人发现，从多形汉逊酵母化ansenula polymor地a)胞内克隆得到的Δ 15脱饱和酶基因在圆红冬抱酵母表达时显示出高活性，将 其连接至植物双元表达载体pCAMBIAl 300，转化到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞内，并通过共培养将Δ 15脱饱和酶基因转化至圆红冬抱酵母，实 现具有高活性的多形汉逊酵母A 15脱饱和酶在圆红冬抱酵母胞内的过表达，从而能够强化 圆红冬抱酵母生产α-亚麻酸的能力。具体地，本发明提供W下内容。
[0006] 本发明的一方面，提供一种圆红冬抱酵母菌株，其包含多形汉逊酵母Δ 15脱饱和 酶基因表达元件。在一个优选实施方案中，多形汉逊酵母A 15脱饱和酶基因表达元件包含 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的核巧酸序列。在另一优选实施方案中，本 发明的圆红冬抱酵母菌株能够过表达具有高活性的多形汉逊酵母Δ 15脱饱和酶。在另一优 选实施方案中，本发明的圆红冬抱酵母菌株具有强化α-亚麻酸生产的能力。
[0007] 本发明的另一方面，提供一种圆红冬抱酵母菌株的制备方法，其包括:将表达多形 汉逊酵母Δ 15脱饱和酶的基因或其片段引入圆红冬抱酵母菌株，从而强化所述圆红冬抱酵 母菌株的α-亚麻酸生产能力。优选地，所述表达多形汉逊酵母A 15脱饱和酶的基因具有SEQ ID NO:2所示的核巧酸序列。
[0008] 在一个优选的实施方案中，圆红冬抱酵母菌株的制备方法包括：
[0009] Δ 15脱饱和酶基因表达载体PCAMBIA-FAD15的构建，其中所述PCAMBIA-FAD15包含 沈Q ID NO: 1、SEQ ID NO:2和沈Q ID NO:3所示的核巧酸序列；
[0010] 利用所述PCAMBIA-FAD15质粒转化根癌农杆菌；
[0011] 将所述转化的根癌农杆菌与所述圆红冬抱酵母共培养，从而将Δ 15脱饱和酶基因 转化至所述圆红冬抱酵母的基因组。
[0012] 优选地，所述PCAMBIA-FAD15进一步包含潮霉素抗性基因化YGK)表达元件。优选 地，所述潮霉素抗性基因表达元件由GTO基因的启动子、潮霉素抗性基因和CaMV终止子组 成。优选地，所述潮霉素抗性基因具SEQ ID NO: 10所示的核巧酸序列。
[0013] 本发明的再一方面，提供一种生产α-亚麻酸的方法，其包括培养本发明所述的圆 红冬抱酵母菌株的步骤。
[0014] 在优选地实施方案中，生产α-亚麻酸的方法包括W下步骤：
[001引。利用YEPD培养基培养活化的圆红冬抱酵母菌株；
[0016] 2)收集步骤1)培养而得到的圆红冬抱酵母菌株，接种至补料发酵培养基进行补料 发酵，所述补料发酵培养基含有碳源、氮源和无机盐，补料发酵过程中，总碳氮比始终维持 在 100:0.7 ~1.5。
[0017] 活化的圆红冬抱酵母菌株可W直接采用活化状态的菌株，也可由保藏状态的菌株 活化而来。
[001引所述YEPD培养基或称为YPD培养基，即，酵母浸出粉腺葡萄糖培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium),按照常规配方配置即可。优选地，按照如下配方配 置:8~12g/L酵母粉，8~20g/L蛋白腺，15~25g/L葡萄糖，抑为5.8~6.0。若制固体培养基， 加入10~20g/L琼脂粉，优选为15g/L琼脂粉。在本发明的一个优选实施方式中，YEPD培养基 按照如下配方配置:lOg/L酵母粉，lOg/L蛋白腺，20g/L葡萄糖，pH=5.8~6.0。
[0019]步骤1)和步骤2)可W在发酵罐中进行。步骤2)中，补料发酵是指，通过补料流加所 述碳源维持所需的碳氮比。
[0020] 根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)中，所述碳源为含有葡萄 糖和木糖的混合碳源，所述氮源为谷氨酸钢或蛋白腺，所述无机盐含有钟元素、儀元素和憐 兀素。
[0021] 根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)中，碳源为含有15~25g/ L葡萄糖和25~35g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8~6.5g/L的谷氨酸钢或4.6~5.5g/L的蛋 白腺，所述无机盐包括0.3~0.7wt %的K出P〇4、0.1~0.3wt %的K2册〇4和0.3~0.7wt %的 MgClsnU上各成分的含量是指各成分在补料发酵培养基中的含量。补料发酵过程中，通过 流加所述碳源的水溶液（即，通过流加含有15~25g/L的葡萄糖和25~35g/L的木糖的混合 碳源水溶液），使总碳氮比始终维持在100:0.8~1.2。更优选地，步骤2)中，碳源为含有18~ 22g/L葡萄糖和28~32g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8~6.2g/L的谷氨酸钢或4.6~5.2g/L 的蛋白腺，所述无机盐包括0.4~0.6wt %的KH2PO4、0.1~0.%的K2HPO4和0.4~0.6wt % 的MgCl2,补料发酵过程中，通过流加所述混合碳源的水溶液（即，通过流加含有18~22g/L 的葡萄糖和28~32g/L的木糖的混合碳源水溶液），使总碳氮比始终维持在100:0.9~1.1。 根据本发明的一个优选实施方式，步骤2)中，碳源为含20g/L葡萄糖和30g/L木糖的混合碳 源，氮源为6.2g/L的谷氨酸钢或4.6g/L的蛋白腺，所述无机盐包括0.52wt %的KH2PO4、 0.16wt %的K2HPO4和0.48wt %的MgCl2，补料发酵过程中，通过流加所述碳源的水溶液（即， 通过流加含有18~22g/L的葡萄糖和28~32g/L的木糖的混合碳源水溶液），使总碳氮比始 终维持在100:1。
[0022] 根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤1)中，圆红冬抱酵母菌株在 YEPD培养基培养至0D6日日为10 W上。更优选地，培养至0〇6日日为12~15。
[0023] 根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)中，补料发酵的时间为80 ~15化。更优选地，补料发酵的时间为100~14化。
[0024] 根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤1)中，圆红冬抱酵母菌株在 YEP的夜体培养基中培养，培养条件为28~30°C，180~23化pm，培养40~60h;步骤2)中，补料 发酵的时间为100~13化。根据本发明的一个优选的实施方式，步骤1)中，圆红冬抱酵母在 YEPD液体培养基中培养，培养条件为30°C，200rpm，培养4她;步骤2)中，补料发酵的时间为 120h〇
[0025] 根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)中，收集步骤1)培养而得 的圆红冬抱酵母菌体的方法为：7000~9000巧m离屯、，收集菌体，用浓度为15~25mM，抑= 6.5~7的憐酸盐缓冲液洗涂菌体，再次离屯、收集菌体。根据本发明的一个优选的实施方式， 步骤2)中，收集步骤1)培养而得的圆红冬抱酵母菌体的方法为:80(K)rpm离屯、，收集菌体，用 20mM，pH=6.8的憐酸盐缓冲液洗涂菌体，再次离屯、收集菌体。
[0026] 根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，步骤2)得到的发酵液用有机溶 剂提取总油脂，所述有机溶剂可W为本领域采用的各种提取微生物总油脂的有机溶剂。优 选地，所述有机溶剂为体积比为2~5:1的正己烧和乙醇，更优选为体积比为2.5~3.5:1的 正己烧和乙醇。
[0027] 根据本发明所述的生产α-亚麻酸的方法，优选地，提取总油脂的方法为：7000~ 90(K)rpm离屯、所得发酵液，用pH=6.5~7的憐酸盐缓冲液洗涂离屯、的菌体，最后用浓度为5 ~7mol/L的盐酸重悬，70~90°C水浴酸解30~lOOmin;加入所述有机溶剂萃取其中的油脂， 重复萃取3~5次，合并上清液，蒸发所述有机溶剂后即得含α-亚麻酸的总油脂。根据本发明 的一个优选的实施方式，提取总油脂的方法为:80(K)rpm离屯、所得发酵液，用抑=6.8的憐酸 盐缓冲液洗涂离屯、的菌体，最后用6mol/L的盐酸重悬，80°C水浴酸解40min;加入所述有机 溶剂萃取其中的油脂，重复萃取3次，合并上清液，蒸发所述有机溶剂后即得含α-亚麻酸的 总油脂。
[00%]圆红冬抱酵母胞内油脂积累量能够达到细胞干重的60% W上，但是生产出来的油 脂一般用作生物柴油等能源用途。本发明的发酵培养方法强化了圆红冬抱酵母胞内油脂中 曰-亚麻酸的产量，可用于保健品，提升了圆红冬抱酵母油脂的利用价值。此外，采用本发明 优选的方案中，亦即W葡萄糖和木糖作为混合碳源、W谷氨酸钢或蛋白腺为优化氮源来发 酵圆红冬抱酵母，并保持发酵过程的碳氮比，运样可W显著增加圆红冬抱酵母胞内合成曰- 亚麻酸的量。
【附图说明】
[0029] 图1、pCAMBIA-FAD15表达载体的构建过程示意图。
[0030] 图2、利用重叠延伸PCR的方法得到Δ 15脱饱和酶基因表达框(GPD启动子+FAD15+ GPD终止子）。其中，Μ是标记物（marker) ; 1、2分别是Δ 15脱饱和酶融合基因表达框 (2678bp)〇
[0031 ]图3利用重叠延伸PCR的方法得到潮霉素抗性基因表达框(GPD启动子+HYGK)。其中 Μ是标记物(marker) ;1是潮霉素抗性基因 HYG^表达框(2111bp)。
[0032] 图4表示α-亚麻酸产量的对比的数据。其中，图4A表示野生型圆红冬抱酵母的α-亚 麻酸的产量;图4Β表示圆红冬抱酵母胞内强化Δ 15脱饱和酶的表达后α-亚麻酸的产量。
【具体实施方式】
[0033] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于 此。
[0034] 除非特别声明，本发明的表示重量百分比wt%。本发明的"mM"表示mmol/L。本 发明实施例中未限定配方的YEPD培养基均按照如下配方配置：10g/L酵母粉，10g/L蛋白腺， 20g/L葡萄糖，P册.8~6.0。
[0035] 本发明中，优选采用PCAMBIA1300载体来构建Δ 15脱饱和酶基因表达载体，因为能 够高效地转化根癌农杆菌。但是由于PCAMBIA1300载体上携带的CaMV 35S启动子是在植物 细胞中行使功能而在圆红冬抱酵母胞内无法发挥作用，所W要对表达A 15脱饱和酶基因的 载体PCAMBIA1300进行改造。为此，本发明人创造性地将圆红冬抱酵母的保守基因 3-憐酸甘 油醒脱氨酶（glyceraldehyde-3-地OS地ate dehy化ogenase ,GPD)基因的启动子和终止子 序列与多形汉逊酵母A 15脱饱和酶的开放阅读框连接在一起组成表达元件，然后将其连接 在PCAMBIA1300载体上的多克隆位点。结果表明运样的表达元件能够在圆红冬抱酵母胞内 高效表达具有高活性的A 15脱饱和酶。
[0036] 优选地，为了能够使潮霉素抗性基因在圆红冬抱酵母中表达，本发明人创造性地 构建了潮霉素抗性基因表达元件，并将该表达元件与PCAMBIA1300载体连接。优选地，将圆 红冬抱酵母3-憐酸甘油醒脱氨酶（肖17。日^1(1日117(1日-3-地〇3地日10(1日117化〇肖日]1日3日，6?〇)基 因的启动子与潮霉素抗性基因开放阅读框(SEQ ID NO: 10)连接在一起组成表达元件，终止 子可用PCAMBIA1300载体自身携带的CaMV终止子。
[0037]接下来，将Δ 15脱饱和酶FAD15表达元件和潮霉素抗性基因表达元件与 pCAMBIAl 300载体的连接。连接方法包括：
[003引 1)用EcoRI和BamHI双酶切连接的方法将Δ 15脱饱和酶FAD15表达元件连接在 pCAMBIAl 300载体上；
[0039] 2)用趾〇1和Bstxl双酶切将潮霉素抗性基因表达元件连接到PCAMBIA1300载体上。
[0040] 需要说明的是，对于连接步骤1)和2)的顺序没有特别限定，可优先进行步骤1)，然 后再进行步骤2)，反之亦可。可选地，可同时进行步骤1)和2)。
[0041 ]优选地，本发明的圆红冬抱酵母的制备方法中，包括PCAMBIA-FAD15质粒转化根癌 农杆菌。优选地，采用热击转化E.coil T1感受态细胞，富集培养后提取PCAMBIA-FAD15质 粒，然后进行根癌农杆菌转化。
[0042] 优选地，本发明的圆红冬抱酵母的制备方法中，包括根癌农杆菌转化圆红冬抱酵 母的步骤。优选地，转化方法包括将两种菌液混合，共培养从而进行转化的方法。
[0043] 优选地，本发明的圆红冬抱酵母的制备方法还包括根癌农杆菌转化圆红冬抱酵母 后得到的重组子的验证步骤。验证方法可采用本领域内通常使用的任何方法，包括但不限 于，PCR扩增验证法、酶切验证法、免疫验证法W及酶活性验证法等。从操作方法及成本节约 角度，优选PCR扩增验证法。具体地，提取共培养后的圆红冬抱酵母的基因组，并通过PCR扩 增来确认圆红冬抱酵母中是否存在多形汉逊酵母A 15脱饱和酶基因。
[0044] 实施例
[0045] 1.菌种与实验材料
[0046] 圆红冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides ACCC 20：341)和多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)购自中国农业生物菌种保藏管理中屯、，根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens LBA4404)购自普如汀生物技术（北京）有限公司。质粒、基因 组提取试剂盒购自TIANGEN公司，载体pCAMBIAl300购自Biovector公司，Easy P化DNA聚合 酶购自全氏金公司，尼龙膜Hybond-N+膜购自Amer sham公司。限制性内切酶购自肥B公司。化 学试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。
[0047] 2. Δ 15脱饱和酶基因表达载体PCAMBIA-FAD15的构建：
[0048] 1)多形汉逊酵母菌株和圆红冬抱酵母菌株分别接种在含YEPD培养基的50mLS角 瓶中过夜培养化，离屯、收集菌体，分别提取两种菌的基因组；
[0049] 2)W多形汉逊酵母和圆红冬抱酵母的基因组为模板，使用引物pGPD-F(SEQ ID N0:4)和pGPD-R(SEQ ID N0:5)、tGPD-F(SEQ ID N0:8)和tGPD-R(SEQ ID N0:9)、FAD15-F (沈Q ID N0:6)和FAD15-R(SEQ ID N0:7)分别克隆得到圆红冬抱酵母GPD的启动子(SEQ ID N0:1)和终止子序列（SEQ ID N0:3)W及多形汉逊酵母Δ 15脱饱和酶的开放阅读框(SEQ ID N0:2)；
[0050] 3)使用重叠延伸PCR的方法将上述Ξ段核巧酸序列进行拼接，重叠延伸PCR的方法 为:先将GPD启动子和Δ15脱饱和酶互为模板和引物进行扩增，条件为94°C预变性5min，94 °C变性40s，60°C退火3〇3,72°(：延伸1111111，20个循环；然后将产物取出加入引物口6口0斗和 FAD15-R再次进行上述条件的扩增，35个循环，即将得至化PD启动子和Δ 15脱饱和酶基因两 个片段的融合序列；
[0051 ] 4)再次使用步骤3)的方法，引物是pGPD-F和和tGPD-R，将第Ξ个片段GTO的终止子 序列连接到前述融合片段的下游，获得A 15脱饱和酶基因表达框（参见图2)。用EcoRI和 BamHI双酶切连接的方法将Ξ段序列融合片段连接在PCAMBIA1300载体上。
[0052] 3.潮霉素抗性基因表达载体的构建：
[0053] 1)将圆红冬抱酵母3-憐酸甘油醒脱氨酶(GPD)基因的启动子与潮霉素抗性基因开 放阅读框连接在一起组成表达元件，终止子使用PCAMBIA1300载体自身携带的CaMV终止子。 先W圆红冬抱酵母的基因组和载体PCAMBIA1300为模板，用引物proGPD-F(SEQ ID NO: 11) 和口'〇6口0-3(569 10^:12)、而邑斗（569 10^:13)和而邑-1?(569 10^:14)分别扩增出 GPD启动子和潮霉素抗性序列；
[0054] 2)潮霉素抗性基因表达元件的构建使用重叠延伸PCR法:先将GTO启动子和潮霉素 抗性基因开放阅读框互为模板和引物进行扩增，条件为94°C预变性5min，94°C变性40s，58 。(:退火20s，72°C延伸403,20个循环;然后将产物取出加入引物口'〇6口0斗和曲邑-1?再次进行 上述条件的扩增，35个循环，即将得到GTO启动子和潮霉素抗性基因两个片段的融合序列；
[0055] 3)与Δ 15脱饱和酶基因表达载体的构建过程相似，GPD启动子和潮霉素抗性基因 重叠延伸的引物分别为proGPD-F和proGPD-R、Hyg-F和Hyg-R。经过重叠延伸PCR的方法融合 成为潮霉素抗性基因 HYGK表达框。结果参见图3。潮霉素抗性基因与PCAMBIA1300载体连接 的酶切位点为化〇1和Bstxl。
[0056] 4. PCAMBIA-FAD15质粒转化根癌农杆菌
[0057] 1)将构建好的载体PCAMBIA-FAD15在42°C热击转化E.coil T1感受态细胞，富集培 养后提取PCAMBIA-FAD15质粒进行根癌农杆菌转化；
[005引2)首先进行根癌农杆菌感受态细胞的制备:挑取单菌落，接种于5ml LB培养基中， 28°C、220巧m，过夜培养。将1:50的菌液接种到100ml LB培养基中，培养至006日日=0.5左右。4 °(：、5000巧111、10111111，弃上清。用40111110%甘油重悬，冰浴30111111。4°(：、5000巧111、10111111，弃上 清。加入2ml 10%的甘油重悬，分装成每管100μΙ。在超净工作台中，将感受态与pCAMBIA- FAD15质粒混合液转入到预冷的0.2cm电击杯中，放入电转仪进行电转化。电转化条件为：电 压2400V、电容25μΡ、电阻200Ω ;电击后立即向电击杯中加入90化1 LB培养基并置于冰中 2min。将菌液转入到1.5ml ΕΡ管，28°C、150rpm解育化，涂布在含有50μg/ml卡纳霉素的LB固 体培养基上，30°C培养2~3d。
[0059] 5.根癌农杆菌转化圆红冬抱酵母
[0060] 分别挑取根癌农杆菌和圆红冬抱酵母单菌落于50μg/ml含卡纳霉素的LB培养基和 YPD培养基中，28 °C，220巧m培养24h。5000巧m，5min收集菌体，WIM培养基（50μg/ml卡纳霉 素)重悬菌体，稀释至〇〇6日日=0.2，继续培养化，至0〇6日日=0.6。W1:5稀释圆红冬抱酵母于新 鲜YPD培养基中，继续培养化，收集菌体，再次用IM培养基重悬，稀释至OD600 = 0.6。两种菌液 各取50μ1混合，将全部菌液涂于带有尼龙膜Hybond-N+膜(Amersham公司，美国）的IM平板 上，25 °C暗培养4她。将Hybond-N+膜转移至YPD (l〇〇μg/ml头抱霉素+200μg/ml潮霉素)上，30 °C培养2-3d。挑取初筛的转化子，在新的YPD(15化g/ml头抱霉素+300μg/ml潮霉素)上划线， 培养2-3d，挑取转化子，提取基因组进行PCR验证重组子。
[0061 ] 通过PCR验证得到5株本发明的圆红冬抱酵母菌株，分别命名为1号至5号。
[0062] (IM培养基成分：基本培养基（MM):化2册〇4 2g/L，KH2P〇4 1.45g/L，MgS〇4 · 7出0 0.6g/L,化Cl 0.3g/L，CaCl2*2H2〇 O.Olg/L,Glucose 2g/L，FeS〇4 0.001g/L，ZnS〇4*7H2〇 0.005g/L，CuS〇4 · 5此0 0.005g/L,曲B03 0.005g/L，MnS〇4 ·此0 0.005g/L,化2M0O4 · 2此0 0.005g/l，NH4N〇3 0.5g/L)，2-吗嘟乙横酸(MES)40mM，乙酷下香酬(AS)200yM，甘油0.5% )。
[0063] 6.圆红冬抱酵母总油脂的检测
[0064] 取1号圆红冬抱酵母W及野生型圆红冬抱酵母各10ml(5ml测生物量，5ml提油脂）， 离屯、收集菌体。测生物量的菌放入65°C烘2~3d;提油脂的菌加入5ml浓盐酸和0.5ml此0， 80°C水浴比，然后加入2ml正己烧和0.75ml无水乙醇，混合液来萃取其中的油脂，此步重复3 次，合并上清液，使用旋转蒸发仪将机溶剂蒸干即得微生物油脂，气相色谱质谱联用仪条 件:安捷伦6890N-5975C，HP-INN0WAX极性毛细管柱，0.25μπι X 250皿X 30m;载气:氮气;载气 流量：1.OmL/min，恒定流量;上样分流比为20:1;进样量进样口和检测器溫度为280°C ; 升溫程序：180 °C保持Imin，10°C/min升溫至220°C，2°C/min升溫至240°C，保持5min。260°C 后运行3min，全扫描。
[0065] 检测结果附图4所示，野生型圆红冬抱酵母在优化条件下α-亚麻酸的产量为 5.05%，而经过Δ 15脱饱和酶强化过表达的圆红冬抱酵母α-亚麻酸的产量达到了8.9%。
[0066] 另外，发明人W上述同相的方法检测了本申请2号-5号菌株的α-亚麻酸的产量。结 果如下表1所示。
[0067] 表 1 [006引
[0069] 通过上述实验说明，多形汉逊酵母Δ 15脱饱和酶在圆红冬抱酵母胞内的表达确实 有助于α-亚麻酸的产量的提高。
[0070] 本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技 术人员可W想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
【主权项】
1. 一种圆红冬孢酵母菌株，其包含多形汉逊酵母△ 15脱饱和酶基因表达元件。2. 根据权利要求1所述的圆红冬孢酵母菌株，其中所述多形汉逊酵母△ 15脱饱和酶基 因表达元件包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。3. 根据权利要求1或2所述的圆红冬孢酵母菌株，其中所述圆红冬孢酵母菌株过表达具 有活性的多形汉逊酵母A 15脱饱和酶。4. 根据权利要求1或2所述的圆红冬孢酵母菌株，其中所述圆红冬孢酵母菌株具有强化 α-亚麻酸生产的能力。5. -种圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其包括:将SEQ ID Ν0:2所示的核苷酸序列引入 圆红冬孢酵母菌株，从而使所述圆红冬孢酵母菌株过表达具有活性的多形汉逊酵母△ 15脱 饱和酶。6. 根据权利要求5所述的方法，其包括： A 15脱饱和酶基因表达载体的构建，其中所述表达载体包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； 利用所述表达载体转化根癌农杆菌以形成转化的根癌农杆菌； 将所述转化的根癌农杆菌与所述圆红冬孢酵母共培养，从而将A 15脱饱和酶基因转化 至所述圆红冬孢酵母。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述表达载体进一步包含潮霉素抗性基因表达元 件。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述潮霉素抗性基因表达元件由GPD基因的启动 子、潮霉素抗性基因和CaMV终止子组成。9. 一种生产α-亚麻酸的方法，其包括培养根据权利要求1至4任一项所述的圆红冬孢酵 母菌株的步骤。10. 根据权利要求9所述的方法，其包括以下步骤： 1) 培养活化的圆红冬孢酵母菌株； 2) 收集步骤1)培养而得到的圆红冬孢酵母菌株，接种至补料发酵培养基进行补料发 酵，所述补料发酵培养基含有碳源、氮源和无机盐，补料发酵过程中，总碳氮比始终维持在 100:0.7~1.5 〇
【文档编号】C12N15/81GK106010993SQ201610408364
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】祁峰, 黄建忠, 张明亮, 孙磊, 江贤章, 邹丽梅
【申请人】福建师范大学