多联耐药菌免疫活性蛋白及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明涉及多联耐药菌免疫活性蛋白及其制备方法和用途，其特征在于：以若干种耐药致病菌为原料，经培养扩增、灭菌浓缩、脫毒破壁,提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜，合成多联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；所述耐药致病菌包括铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌中的一种或二种组合，以及肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌中的二种以上组合。本发明用于制成适用于人体粘膜吸收的制剂，主要包括滴鼻液、口服液、片剂、冲剂、注射剂或喷喉雾剂。能够解决细菌耐药呈不断增长趋势、威胁人类和动物的健康的问题，具有良好的免疫效果。
【专利说明】
多联耐药菌免疫活性蛋白及其制备方法和用途
技术领域
[0001]本发明涉及一种多联耐药菌免疫活性蛋白及其制备方法和用途。属于生物制药技术领域。
【背景技术】
[0002]众所周知，致病性细菌对人类健康存在极大的危害性。抗生素具有医治效果以致人类寿命倍增。然而随着抗生素使用时间的延长，致病性细菌的耐药性增加，药致病菌快速滋生，使抗生素的抗菌效力减退。目前，世界各地广泛发生的细菌耐药呈不断增长趋势，威胁人类和动物的健康。耐药菌感染后果严重，包括病程迀延、住院时间延长、病死率上升、住院费用增加等。细菌耐药不仅威胁健康，还由于疾病导致生产力下降带来的经济损失(包括人和动物)。耐药控制需要长期投入，包括对发展中国家提供资金和技术支持，开发新的药物、诊断方法、疫苗和其他干预措施，并加强卫生系统管理，以确保更有效地使用抗菌药物。
[0003]因此，世界卫生组织2015年郑重提出对当前致病菌耐药问题全球行动计划，鼓励研究和投资开发新生物制品。
[0004]细菌耐药已经成为全球严峻的公共卫生问题，世界卫生组织(WHO)在2011年世界卫生日提出“遏制耐药一一今天不采取行动，明天就无药可用”的呼吁，并在2014年公布了全球耐药调查报告，对全球各国和地区耐药情况进行分析，并于12月发布了“控制细菌耐药全球行动计划(草案)(Draft global act1n plan on antimicrobial resistance)，，。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一，是为了解决细菌耐药呈不断增长趋势、威胁人类和动物的健康的问题，提供一种多联耐药菌免疫活性蛋白。
[0006]本发明的目的之二，是为了提供一种多联耐药菌免疫活性蛋白的制备方法。
[0007]本发明的目的之三，是为了提供一种多联耐药菌免疫活性蛋白的用途。
[0008]本发明的目的之一可以通过以下技术方案实现:
[0009]多联耐药菌免疫活性蛋白，其特征在于:以若干种耐药致病菌为原料，经培养扩增、灭菌浓缩、脫毒破壁，提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜，合成多联耐药菌免疫活性蛋白生物制品;所述耐药致病菌包括铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌中的一种或二种组合，以及肺炎克雷白氏菌，、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌中的二种以上组合。
[0010]本发明的目的之一还可以通过以下技术方案实现:
[0011 ] 一种优选方案是，所述多联耐药菌免疫活性蛋白，为具有被消化道粘膜被覆上皮吸收特性的蛋白质。
[0012]—种优选方案是，由铜绿假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌，共五种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成五联耐药菌免疫活性蛋白生物制品;或者由铜绿假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌和鲍氏不动杆菌，共四种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成四联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由铜绿假单胞菌、肺炎克雷白氏菌和流感嗜血杆菌，共三种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成三联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。
[0013]—种优选方案是，由嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌，共五种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成五联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌和鲍氏不动杆菌，共四种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成四联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌和流感嗜血杆菌，共三种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成三联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。
[0014]—种优选方案是，由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌，共六种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成六联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。
[0015]—种优选方案是，由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌，共十种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成十联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。
[0016]一种优选方案是，由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌和大肠艾希氏菌，共九种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成九联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。
[0017]一种优选方案是，由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌和结核杆菌，共八种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成八联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。
[0018]一种优选方案是，由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎双球菌，共七种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成七联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。
[0019]本发明的目的之二，可以通过采取如下技术方案达到:
[0020]多联耐药菌免疫活性蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
[0021]I)组成混合菌液
[0022]备好铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌，以及肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌;用所述铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌中的一种或二种组合，与肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌中的二种或以上组合，组成混合菌液；
[0023]2)耐药菌种扩增
[0024]取含I级菌种的混合菌液5ml、含2级菌种的混合菌液100ml、含3级菌种的混合菌液2000ml，含I级菌种的混合菌液用试管扩增，含2级菌种的混合菌液用小瓶扩增，含3级菌种的混合菌液用三角烧瓶扩增或直接种入发酵罐扩增；
[0025]3)采用基础培养基对耐药菌种培养
[0026]采用蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠、酵母浸膏和葡萄糖中的一种或二种以上组合为基础培养基，对铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌和感冒嗜血杆菌进行培养，采用前述基础培养基加乳糖构成乳糖培养基对金黄色葡萄球菌进行培养，所述基础培养基和乳糖培养基的Ph值为7.4-7.6；
[0027]其他细菌培养基按营养需要配备培养基；
[0028]4)制备多联耐药菌免疫活性蛋白
[0029]4-1)将耐药菌种放入液体基础培养基或乳糖培养基中，在37°C的温度条件下培养24-48小时后，收集菌液，经甲醛灭菌后进行离心分离、沉淀;然后弃上清、取沉淀物，将所述沉淀物在贮存罐中贮存，贮存温度为4_8°C ;
[0030]4-2)向贮存罐内重新投入基础培养基、进行二次发酵培养，经高温物理灭菌—接种新菌种—增菌培养—甲醛灭菌程序后，髙速连续离心取沉淀，弃上清、取沉淀物，沉淀物经破壁分离，提取细胞壁和细胞膜活性蛋白，形成多联免疫活性蛋白。
[0031]本发明的目的之二，还可以通过采取如下技术方案达到:
[0032]进一步地，步骤4-1)中，将耐药菌种放入液体基础培养基或乳糖培养基中，是指将菌体液化。
[0033]进一步地，步骤4-1)中，所述的离心分离为电度梯度离心分离，分离提取细胞壁和细胞膜活性蛋白。
[0034]进一步地，步骤4-2)中，甲醛灭菌中使用的甲醛浓度为0.1 % -0.5 %。
[0035]进一步地，步骤4-2)中，沉淀物经破壁分离，是指沉淀物用破壁机将其中的细菌破壁，使菌体的成份分离。
[0036]进一步地，步骤4-2)中，形成多联免疫活性蛋白，自釆弄集之日起有效期为2年6个月。
[0037]本发明的目的之三，可以通过采取如下技术方案达到:
[0038]多联耐药菌免疫活性蛋白的用途，其特征在于:用于制成适用于人体粘膜吸收的制剂，主要包括滴鼻液、口服液、片剂、冲剂、注射剂或喷喉雾剂。
[0039]本发明具有如下有益效果:
[0040]1、本发明涉及的多联耐药菌免疫活性蛋白，以若干种药致病菌为原料，经培养扩增、灭菌浓缩、脫毒破壁，提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜，合成多联耐药菌免疫活性蛋白生物制品;所述耐药致病菌包括铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌中的一种或二种组合，以及肺炎克雷白氏菌，、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌中的二种以上组合；因此，能够解决细菌耐药呈不断增长趋势、威胁人类和动物的健康的问题，是对耐药菌抗感染的功能制品，既能诱发消化道粘膜免疫，同時又可提髙系统兔疫，有的放矢，达到代替抗生素抗耐药致病菌的治疗目的，具有良好的免疫效果。
[0041]2、本发明涉及的多联耐药菌免疫活性蛋白的特例，采用铜绿假单胞菌(共有11个型，可以只用一个型，例如第6型)、嗜麦芽假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白氏菌、感冒嗜血杆菌和鲍氏不动杆菌为原料，分别培养扩增、灭活脫毒、破壁分离提取细胞壁、细胞膜和莢膜活性蛋白，合成六联耐药菌免疫活性蛋白制品，用于耐药致病菌感染患者提高自动免疫，具有良好的免疫效果。
[0042]3、本发明涉及的多联耐药菌免疫活性蛋白，可用于制成适用于人体粘膜吸收的制剂，主要包括滴鼻液、口服液、片剂、冲剂、注射剂或喷喉雾剂，用于人体粘膜吸收，以达到治疗的目的，具有良好的免疫及治疗效果。
【具体实施方式】
[0043]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0044]具体实施例1:
[0045]本实施例涉及的多联耐药菌免疫活性蛋白，由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌，共六种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成六联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。
[0046]所述多联耐药菌免疫活性蛋白，为具有被消化道粘膜被覆上皮吸收特性的蛋白质。
[0047]本实施例涉及的多联耐药菌免疫活性蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
[0048]I)组成混合菌液
[0049]备好铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌，以及肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌;用所述铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌中的一种或二种组合，与肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌中的二种或以上组合，组成混合菌液；
[0050]2)耐药菌种扩增
[0051 ] 取含I级菌种的混合菌液5ml、含2级菌种的混合菌液100ml、含3级菌种的混合菌液2000ml，含I级菌种的混合菌液用试管扩增，含2级菌种的混合菌液用小瓶扩增，含3级菌种的混合菌液用三角烧瓶扩增或直接种入发酵罐扩增；
[0052]3)采用基础培养基对耐药菌种培养
[0053]采用蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠、酵母浸膏和葡萄糖中的一种或二种以上组合为基础培养基，对铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌和感冒嗜血杆菌进行培养，采用前述基础培养基加乳糖构成乳糖培养基对金黄色葡萄球菌进行培养，所述基础培养基和乳糖培养基的Ph值为7.4-7.6；
[0054]其他细菌培养基按营养需要配备培养基；
[0055]4)制备多联耐药菌免疫活性蛋白
[0056]4-1)将耐药菌种放入液体基础培养基或乳糖培养基中，在37°C的温度条件下培养24-48小时后，收集菌液，经甲醛灭菌后进行离心分离、沉淀;然后弃上清、取沉淀物，将所述沉淀物在贮存罐中贮存，贮存温度为4-8°C ;
[0057]4-2)向贮存罐内重新投入基础培养基、进行二次发酵培养，经高温物理灭菌—接种新菌种—增菌培养—甲醛灭菌程序后，髙速连续离心取沉淀，弃上清、取沉淀物，沉淀物经破壁分离，提取细胞壁和细胞膜活性蛋白，形成多联免疫活性蛋白。
[0058]本实施例中:
[0059]步骤4-1)中，将耐药菌种放入液体基础培养基或乳糖培养基中，是指将菌体液化。所述的离心分离为电度梯度离心分离，分离提取细胞壁和细胞膜活性蛋白。
[0060]步骤4-2)中，甲醛灭菌中使用的甲醛浓度为0.1 %-0.5%。沉淀物经破壁分离，是指沉淀物用破壁机将其中的细菌破壁，使菌体的成份分离。形成多联免疫活性蛋白，自釆弄集之日起有效期为2年6个月。
[0061 ] 本实施例还涉及如下工艺流程:
[0062]原液合并:加防腐剂2，5-5，Og/L，将不同菌种的原液，按相当浓度组合成多联免疫活性蛋白；
[0063]透析:流水透析24h，用PBS稀释至配比溶度，成品不加防腐剂；
[0064]分装:稀释成1ml/瓶，相当含菌浓度6*1010，1*1010胶囊或糖丸，(成品)。
[0065]生产设备:
[0066]超净工作台，显微镜髙压锅炉，培养箱(房)，高速连续离心机2台，发酵罐(50/L)GMP流水线2条:
[0067]1-生产流程分别将任一2/L耐药菌种入30/L培养液中(50/L发酵罐)—37°C培养24-48小时—收集菌液—甲醛灭菌后—离心—弃上清—取沉淀物—贮存4-8 °C;
[0068]2-二次发酵—罐内重新培养基投料—高温物理灭菌—接种新菌种—分别逐一增菌培养4甲醛灭菌(0，I %-0，5%)4髙速连续离心4取沉淀，自釆弄集之曰起有效期为2年6个月；
[0069]检验室包括；
[0070](I)产品检验室:产品为无菌乳白色微混浊液体，(不应有摇不散沉淀和异物)；
[0071 ] (2)含量测定:用细菌浊度测定浓度，和分光光度法测定，在660nm波长下A值应为；
[0072](3)异常毒性试验:按[生物制品异常毒性试验规程]进行。以PBS将原液稀释成每Iml活性蛋白，相当6X109(细菌浊度)，取0，5ml腹腔射18—20g小鼠5只。小鼠注射前称取体重，计算所注小鼠的总体重，观察7天，小鼠健存，总体重应有增加。
[0073](4)防腐剂含量测定。
[0074](5)环保实验室:枯草杆菌无害化处理。
[0075](6)包装前，产品检验应全部合格。
[0076]生产用水:
[0077]生产用水源水符合国家饮用水标准;纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。
[0078]生产用器具
[0079]直接用于生产的金属或玻璃器具，经严格清洗及灭菌处理。
[0080]生产及检定用动物
[0081 ]小鼠、豚鼠符合清洁级标准。
[0082] 3、菌种
[0083 ]有关菌种的规定检定按《疫苗制造及检定规程》项进行。
[0084]4、原液制备
[0085]4-1生产用菌种
[0086]将工作种子批菌种启开后，接种于肝浸液琼脂斜面或其他适宜培养基上，置37°C培养-48小时为第一代菌种。第一代菌种在2_8°C可以保存15日。
[0087]将第一代菌种移种肝琼脂或其他适宜培养基上，置37°C培养-48小时为第二代菌种，经肉眼纯菌检查合格后，用灭菌生理氯化钠溶液洗下菌苔制成悬液。以此作为生产用菌种，用于生产。
[0088]4-2生产用培养基
[0089]用肝浸液琼脂或国家药品管理当局批准的其他培养基。
[0090]六个耐药菌分别菌种接种和培养(接种量和浓度相等)。
[0091]于培养基中接种生产用菌种后，置37°C培养24-48小时，肉眼逐瓶检查，有杂菌则废弃。
[0092]4-3采集合并(六联细菌浓度相等)
[0093]用灭菌生理氯化钠溶液洗下菌苔或刮取菌苔，制成菌液，合并至灭菌瓶内，合并后的菌液做纯菌试验。
[0094]4-4 原液
[0095]合并后原液按“中国细菌浊度标准”将菌液的浓度，调为每Iml相当含菌6*1011
[0096]随后加入苯酚终浓度O，25—O，5/L杀菌。
[0097]4-5细菌破壁
[0098]用破壁机将细菌破壁连续高速离心弃细菌内毒素，取沉淀PBS洗三次，
[0099]4-6半成品配制用灭菌生理氯化钠溶液将无菌试验合格的菌液稀释为相当含菌10ml/6*1010
[0100]做无菌试验，应无杂菌生长。
[0101]4-7半成品检定
[0102]按3.2项进行。
[0103]分批按《生物制品分批规程》进行。
[0104]4-8 分装
[0105]按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。制品内不加防腐剂。装安瓿后应于70-80°C加热I小时。
[0106]4-9 规格
[0107]滴鼻用规格为每10ml，相当含菌6*1010。
[0108]口腹胶囊(粒)相当含菌(1*1010)
[0109]4-10 包装
[0110]按《生物制品包装规程》进行。
[0111]5 检定
[0112]5-1无菌试验
[0113]按《生物制品无菌试验规程》A项进行。
[ΟΙ14] 5-2半成品检定
[0115]无菌试验
[0116]除按《生物制品无菌试验规程》A项进行外，另接种2管琼脂斜面，置37°C培养7天，应无杂菌及本菌生长。
[0117]本实施例是由铜绿假单胞菌，嗜麦芽假单胞菌，肺炎克雷白氏菌，流感嗜血杆菌，鲍氏不动杆菌，金黄色葡萄球菌，六种耐药细菌为原料，通过培养扩增，灭菌浓缩，脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁，细胞膜和莢膜的活性蛋白。合成六联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。
[0118]具体实施例2:
[0119]本发明具体实施例2的特点是:由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌，共十种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成十联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。其制备方法及用途同具体实施例1。
[0120]具体实施例3:
[0121]本发明具体实施例3的特点是:由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌和大肠艾希氏菌，共九种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成九联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。其制备方法及用途同具体实施例1。
[0122]具体实施例4:
[0123]本发明具体实施例4的特点是:由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌和结核杆菌，共八种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成八联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。其制备方法及用途同具体实施例1。
[0124]具体实施例5:
[0125]本发明具体实施例5的特点是:由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎双球菌，共七种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成七联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。其制备方法及用途同具体实施例1。
[0126]具体实施例6:
[0127]本发明具体实施例6的特点是:由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌，共十种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成十联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。其制备方法及用途同具体实施例1。
[0128]具体实施例7:
[0129]本发明具体实施例7的特点是:由铜绿假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌，共五种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成五联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由铜绿假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌和鲍氏不动杆菌，共四种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成四联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由铜绿假单胞菌、肺炎克雷白氏菌和流感嗜血杆菌，共三种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成三联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。其制备方法及用途同具体实施例1。
[0130]具体实施例7:
[0131]本发明具体实施例7的特点是:由嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌，共五种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成五联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌和鲍氏不动杆菌，共四种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成四联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌和流感嗜血杆菌，共三种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成三联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。其制备方法及用途同具体实施例1。
[0132]本发明是一种从耐药致病菌提取的蛋白质。由耐药致病菌经灭活脫毒，提取的细胞壁，细胞膜和莢膜免疫活性蛋白，是可被消化道粘膜被覆上皮吸收的蛋白质。研究表明活性蛋白从消化道粘膜吸入，是耐药致病菌活性蛋白摄入的最佳途径，可从粘瞋吸收的活性蛋白质，为研制与开发免疫活性蛋白提供重要依据。研究证明耐药致病菌的细胞壁，细胞膜和荚膜蛋白质，可提高杌体主动免疫。通过六联耐药致病菌活性蛋白制品，对小鼠灌胃诱发免疫反应研究。用适量六联耐葯菌活性蛋白给小鼠灌胃后，观察到小鼠的血清和小肠冲洗液中特异性IgA，IgG抗体显著升高。结果证明六联致病菌活性蛋白制品，能显著诱发系统NALT，GALT免疫反应，表明本发明的耐药菌活性蛋白能达到良好的免疫效果，是对耐药菌抗感染的功能制品。既能诱发消化道粘膜免疫，同時又可提髙系统兔疫，有的放矢，达到代替抗生素抗耐药致病菌的治疗目的。
【主权项】
1.多联耐药菌免疫活性蛋白，其特征在于:以若干种耐药致病菌为原料，经培养扩增、灭菌浓缩、脫毒破壁，提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜，合成多联耐药菌免疫活性蛋白生物制品;所述耐药致病菌包括铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌中的一种或二种组合，以及肺炎克雷白氏菌，、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌中的二种以上组合。2.根据权利要求1所述的多联耐药菌免疫活性蛋白，其特征在于:所述多联耐药菌免疫活性蛋白，为具有被消化道粘膜被覆上皮吸收特性的蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的多联耐药菌免疫活性蛋白，其特征在于:由铜绿假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌，共五种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成五联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由铜绿假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌和鲍氏不动杆菌，共四种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成四联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由铜绿假单胞菌、肺炎克雷白氏菌和流感嗜血杆菌，共三种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成三联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。4.根据权利要求1或2所述的多联耐药菌免疫活性蛋白，其特征在于:由嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌，共五种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成五联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌和鲍氏不动杆菌，共四种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成四联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌和流感嗜血杆菌，共三种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成三联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。5.根据权利要求1或2所述的多联耐药菌免疫活性蛋白，其特征在于:由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌和金黄色葡萄球菌，共六种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成六联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。6.根据权利要求1或2所述的多联耐药菌免疫活性蛋白，其特征在于:由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌，共十种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成十联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌和大肠艾希氏菌，共九种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成九联耐药菌免疫活性蛋白生物制品;或者由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌和结核杆菌，共八种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成八联耐药菌免疫活性蛋白生物制品；或者由铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎双球菌，共七种耐药细菌为原料，通过培养扩增、灭菌浓缩和脫毒破壁，分别提取细菌的细胞壁、细胞膜和莢膜的活性蛋白，合成七联耐药菌免疫活性蛋白生物制品。7.多联耐药菌免疫活性蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 1)组成混合菌液 备好铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌，以及肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌；用所述铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌中的一种或二种组合，与肺炎克雷白氏菌、流感嗜血杆菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌、大肠艾希氏菌和白色葡萄球菌中的二种或以上组合，组成混合菌液； 2)耐药菌种扩增 取含I级菌种的混合菌液5 m 1、含2级菌种的混合菌液1 O m 1、含3级菌种的混合菌液2000ml，含I级菌种的混合菌液用试管扩增，含2级菌种的混合菌液用小瓶扩增，含3级菌种的混合菌液用三角烧瓶扩增或直接种入发酵罐扩增； 3)采用基础培养基对耐药菌种培养 采用蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠、酵母浸膏和葡萄糖中的一种或二种以上组合为基础培养基，对铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、肺炎克雷白氏菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌和感冒嗜血杆菌进行培养，采用前述基础培养基加乳糖构成乳糖培养基对金黄色葡萄球菌进行培养，所述基础培养基和乳糖培养基的Ph值为7.4-7.6； 4)制备多联耐药菌免疫活性蛋白 4-1)将耐药菌种放入液体基础培养基或乳糖培养基中，在37°C的温度条件下培养24-48小时后，收集菌液，经甲醛灭菌后进行离心分离、沉淀;然后弃上清、取沉淀物，将所述沉淀物在贮存罐中贮存，贮存温度为4-8°C ; 4-2)向贮存罐内重新投入基础培养基、进行二次发酵培养，经高温物理灭菌—接种新菌种—增菌培养—甲醛灭菌程序后，髙速连续离心取沉淀，弃上清、取沉淀物，沉淀物经破壁分离，提取细胞壁和细胞膜活性蛋白，形成多联免疫活性蛋白。8.根据权利要求7所述的多联耐药菌免疫活性蛋白的制备方法，其特征在于:步骤4-1)中，将耐药菌种放入液体基础培养基或乳糖培养基中，是指将菌体液化;所述的离心分离为电度梯度离心分离，分离提取细胞壁和细胞膜活性蛋白。9.根据权利要求7所述的多联耐药菌免疫活性蛋白的制备方法，其特征在于:步骤4-2)中，甲醛灭菌中使用的甲醛浓度为0.1 %-0.5%;沉淀物经破壁分离，是指沉淀物用破壁机将其中的细菌破壁，使菌体的成份分离;形成多联免疫活性蛋白，自釆弄集之日起有效期为2年6个月。10.多联耐药菌免疫活性蛋白的用途，其特征在于:用于制成适用于人体粘膜吸收的制剂，主要包括滴鼻液、口服液、片剂、冲剂、注射剂或喷喉雾剂。
【文档编号】A61K39/085GK106011007SQ201610398980
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】余国华, 余永宁
【申请人】余国华, 余永宁