一种超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法
【专利摘要】本发明公开了一种超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，该方法包括如下步骤：(1)制备富硒土壤悬液；(2)增菌培养；(3)继代培养；(4)稀释涂布平板；(5)平板划线；(6)活化；(7)革兰氏染色；(8)总DNA提取；(9)16S rDNA基因扩增进行鉴定。本发明采用在富硒环境中生存的超耐硒细菌，具有超强耐硒能力，并且材料成本低、实验方法简单和对环境无污染的优点。
【专利说明】
-种超耐砸细菌分离、纯化及鉴定的方法
技术领域
[0001] 本发明属于耐砸微生物技术领域，具体设及一种超耐砸细菌分离、纯化及鉴定的 方法。
【背景技术】
[0002] 砸是很多生物必需的微量元素，在生物体内，砸被合成为砸蛋白，有些砸蛋白具有 抗氧化功能，同时，能够防治一些癌症。砸在含量低时，对生物有益，在含量高时，对人类和 动物有害，在人体必需微量元素中，砸从不足到产生毒性，范围最窄。
[0003] 目前已报道的耐砸微生物有：嗜麦芽寡养单胞菌、芽抱杆菌、罗尔斯通菌、陶厄氏 菌、脱硫微菌、超嗜热古菌、根瘤菌、假单胞菌等，但是，对砸的耐受性都不是很高。关于赖氨 酸芽抱杆菌的报道有:李婷等(2013)报告一株具有吸附功能的微生物固定化载体对间甲酪 的降解。化yat.et.al(20l3)报告Lysinibacilluspakis1:anensis耐棚酸。B址uguna.et.al (2011)报告从柴油污染±壤中分离出的球形赖氨酸芽抱杆菌化ysinibacillus S地aericus)能够对二苯并嚷吩产生脱硫作用。但是，关于砸的化合物对于赖氨酸芽抱杆菌 (Lys inibaci 1 lus)毒性或影响的报道几乎没有。
[0004] -些微生物对砸具有耐受性，原因是能够将较强毒性的无机砸还原为低毒或无毒 的单质砸和挥发态的砸化物，有实验已经证实，运种单质砸是一种W蛋白质为核，红色单质 砸为膜的砸-蛋白复合物，粒径纳米级，在生物补砸方面有很高的应用价值。另外，郑青山等 (2002)研究发现，红色单质砸对烟草特异性亚硝胺类化合物所致的细胞氧化损伤有保护作 用。
【发明内容】
[0005] 根据W上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种超耐砸细菌分 离、纯化及鉴定的方法，目的是通过加入亚砸酸盐的培养基得到耐砸细菌，并对其进行鉴 定。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种超耐砸细菌分离、纯化及鉴定的方法，该方法包括如下步骤，
[000引（1)制备富砸±壤悬液；
[0009] (2)增菌培养:取步骤（1)制备的富砸±壤悬液加入到含浓度为100-200mg · L-1亚 砸酸盐的LB液体培养基中，并置于振荡培养基中振荡培养；
[0010] (3)继代培养:将步骤(2)振荡培养后的菌液接种于含浓度为100-200mg · L-1亚砸 酸盐的LB液体培养基中，菌液的接种量为该LB液体培养基总体积的3%-7%，之后置于振荡 培养箱中振荡培养，如此重复3-5次；
[0011] (4)稀释涂布平板:将步骤（3)得到的菌液用无菌水稀释1〇1-107倍，取稀释105、 1〇6、1〇7菌液涂布于含亚砸酸盐的LB固体培养基上，置于生化培养箱中恒溫培养;所述稀释 1〇5、106、107菌液的体积优选为50-150化；
[0012] (5)平板划线；取步骤（4)长出的单菌落结合平板划线法接种于含浓度为100- 200mg · [1亚砸酸盐的LB液体培养基中，之后置于生化培养箱中恒溫培养；
[0013] (6)活化:取步骤(5)长出的菌落接种于LB液体培养基中，之后置于振荡培养箱中 培养；
[0014] (7)革兰氏染色:取步骤(5)长出的菌落结合平板划线法接种于LB液体培养基中， 之后置于生化培养箱中恒溫培养，挑取单菌落进行革兰氏染色；
[001引 （8)总DNA提取；
[0016] (9)168 rDNA基因扩增进行鉴定。
[0017] 所述亚砸酸盐为亚砸酸钢。
[001引所述16S rDNA基因扩增的引物包括序列号为SEQ ID N0.1的UF和序列号为SEQ ID NO. 2的UR，其中，
[0019] UF为5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，M为A或C;
[0020] UR为5 '-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 '。
[0021] 所述扩增的反应体系为30μ1，包括dNTPs化L，10Xbuffer 酶化 L，引物UF和UR各化L，d地2〇 1化L，总DNA模板化L。
[0022] 所述扩增的反应条件为：94°C预变性5min;94°C变性45s，55°C退火4s，72°C延伸 1.5min，30个循环；最后在72°C延伸lOmin。
[0023] 所述振荡培养箱恒溫培养的溫度为35-37Γ，转速160-20化· min-i，培养时间为8- 1地。优选的，振荡培养箱恒溫培养的溫度为35°C，转速18化· mirTi，培养时间为12h。
[0024] 步骤(4)和(5)中所述生化培养箱恒溫培养的溫度为36-38°C，培养时间24-7化，步 骤(7)中所述生化培养箱恒溫培养的溫度为36-38°C，培养时间18-24h。优选的，步骤(4)和 (5)中生化培养箱恒溫培养的溫度为37°C，培养时间4她。步骤(7)中生化培养箱恒溫培养的 溫度37°C，培养时间20h。
[0025] 步骤（1)制备富砸±壤悬液的方法为取富砸±壤样品，加入含有已灭菌的憐酸盐 缓冲液的容器中并置于振荡培养箱中振荡，培养溫度为25°C，转速18化· mirTi，振荡时间为 30min，之后静置20-40min，取悬浮液经离屯、、弃去上清液，再加入憐酸缓冲液得到。所述离 屯、机的转速为5000r · min-i，离屯、时间为lOmin。
[0026] 所述方法还包括耐砸能力测定，耐砸能力测定的方法为取步骤(6)得到的菌液，W 体积分数为0.5%-1.5%的耐砸细菌接种量接种于含砸酸盐的LB液体培养基中并置于振荡 培养箱中培养，之后每隔化用分光光度计测菌液的吸光度值，绘制细菌的生长曲线，振荡培 养箱的溫度为35°C，转速为18化· min-i，所述振荡培养时间为24-3化，LB液体培养基中含砸 酸盐的量为0-400mM。
[0027] 所述超耐砸细菌为Lysinibacillus xylanil}fticus和Lysinibacillus macroideso
[0028] 本发明有益效果是:本发明W天然富砸±壤为材料，从中分离筛选出两株超耐砸 细菌B1 和B2,细菌B1 为Lysinibacillus xylanilyticus,B2^Lysinibacillus macroides, 均具有较高的耐砸水平，当培养基中亚砸酸钢含量为160mM时，细菌B1在2化后进入对数生 长期，细菌B2在化后进入对数生长期，当培养基中砸酸钢含量为400mM时，细菌B1在化后进 入对数生长期，细菌B2在1化后进入对数生长期。本发明具有材料成本低、实验方法简单和 对环境无污染的优点，具有较好的开发利用前景。
【附图说明】
[0029] 下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：
[0030] 图1是本发明的流程图；
[0031 ]图2是本发明两株超耐砸细菌分离、纯化的形态图；
[0032] 图3是本发明的两株超耐砸细菌的耐砸能力检测图；
[0033] 图4是本发明的两株超耐砸细菌的革兰氏染色结果图；
[0034] 图5是本发明的两株超耐砸细菌总DNA、16S rDNA的琼脂糖凝胶电泳检测图；
[0035] 图6是本发明的两株超耐砸细菌基于16S rDNA基因序列的系统发育树。
【具体实施方式】
[0036] 下面对照附图，通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，W帮助本领 域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
[0037] -种超耐砸细菌分离、纯化及鉴定的方法，其具体步骤包括：
[0038] (1)制备±壤样品悬液
[0039] 称取2g富砸±壤样品，加入放置有已灭菌的50mL憐酸盐缓冲液的锥形瓶中，置于 振荡培养箱中振荡，振荡培养箱的溫度为25°C，转速为18化· mirfi，振荡时间为30min，接着 静置30min，取30mL悬浮液于已灭菌的50mL离屯、管中，放置于离屯、机中离屯、，所述离屯、机的 转速为5000r · mirfi，离屯、时间为lOmin，弃去上清液，再加入5mL憐酸盐缓冲液W悬浮沉淀。
[0040] (2)增菌培养
[0041 ]取步骤（1)制备的±壤样品悬液ImL，加入到放置有含化2Se〇3的LB液体培养基(酵 母提取物5g · [1，氯化钢lOg · [1，膜蛋白腺lOg · [1，抑=7.2)的锥形瓶中，船25603浓度为 150mg · L-1，LB液体培养基的量为50mL，置于振荡培养箱中振荡培养，振荡培养箱的溫度为 35°C，转速为180r · min-i，培养时间为lOh。
[0042] (3)继代培养
[0043] 取步骤(2)菌液接种到放置有含化2Se〇3的LB液体培养基的锥形瓶中，菌液接种量 为5% (体积分数），化2Se〇3浓度为150mg · L-i，LB液体培养基的量为50mL，置于振荡培养箱 中振荡培养，振荡培养箱的溫度为35°C，转速为18化· mirTi，培养时间为lOh;如此重复4次。
[0044] (4)稀释涂布平板
[0045] 将步骤(3)菌液用无菌水稀释1〇1-107倍，取105、10 6、107菌液涂布于含化2Se〇3的LB 固体培养基上，置于生化培养箱中恒溫培养，涂布的菌液体积为lOOyL，化2Se〇3浓度为 150mg · [1，生化培养箱的溫度为37°C，培养时间为4甜，结果如图2(上)所示，菌斑颜色为红 色，菌体较湿润，圆形边缘，边缘整齐，易挑取。
[0046] (5)平板划线
[0047] 用接种环挑取步骤(4)长出的单菌落，结合平板划线法，接种于含NasSe化的LB固体 培养基上，置于生化培养箱中恒溫培养，培养基成分及培养条件同步骤(4)，结果如图2(下） 所示，划线结果表明，细菌单菌落形态规整。
[0048] (6)活化
[0049]用接种环挑取步骤(5)长出的单菌落，接种于放置有LB液体培养基的锥形瓶中，接 着将接种后的锥形瓶放置在振荡培养箱中培养，培养基的量为25mL，振荡培养箱的溫度为 35°C，振荡培养箱的转速为18化· min-i，振荡培养时间为12h。
[00加](7)耐砸能力测定
[0051]取步骤(6)培养的菌液，接种于放置有含Na2Se〇3的LB液体培养基的锥形瓶中，接着 将接种后的锥形瓶放置在振荡培养箱中培养，从第化开始，每隔化，用分光光度计测菌液的 吸光度值，绘制细菌的生长曲线，LB液体培养基中含化2Se化的量为0、20、40、80、160mM，耐砸 细菌接种量为1 % (体积分数），LB液体培养基的体积为50mL，振荡培养箱的溫度为35°C，振 荡培养箱的转速为18化· mirTi，振荡培养时间为30h;按相同接种量和相同培养条件，不同 条件为LB液体培养基中含砸酸钢，砸酸钢的浓度为0、50、100、200、400mM，结果如图3所示， 超耐砸细菌B1和B2均具有较高的耐砸水平，当培养基中亚砸酸钢含量为160mM时，细菌B1在 2化后进入对数生长期，细菌B2在化后进入对数生长期，当培养基中砸酸钢含量为400mM时， 细菌B1在化后进入对数生长期，细菌B2在1化后进入对数生长期。
[0化2] (8)革兰氏染色
[0053]用接种环挑取步骤(5)长出的单菌落，结合平板划线法，接种于LB固体培养基，置 于生化培养箱中恒溫培养，挑取单菌落用于革兰氏染色，在100倍油镜下观察细胞形态，选 择已知革兰氏染色结果的金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和大肠杆菌(革兰氏阴性菌)作 为对照，生化培养箱的溫度为37°C，培养时间为20h，结果如图4所示，结果表明B1和B2均为 革兰氏阳性杆菌。
[0化4] (9)总DNA提取
[0055]根据步骤(8)结果，按革兰氏阳性细菌处理，采用化up柱式细菌基因组DNA抽提试 剂盒(上海生工生物工程有限公司）提取细菌总DNA，提取的DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳进 行检测，4S green染色，ADNA/Hind虹作为DNA Marker,结果如图5(左）所示，结果表明，DNA 片段大小在2000化P左右。
[0化6] (10)168 rDNA基因扩增
[0057] 将步骤(9)提取的细菌总DNA用细菌16S rDNA通用引物为序列号为SEQ ID NO. 1的 卵5'-46461'門64^1了66(：1'〔46-3'（]\1为4或〇和序列号为569 10^.2的邮5'- ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'对16S rDNA基因全长进行扩增，所述扩增的反应体系为30μ1， 包括dNTPs化LaOXbuffer化^]\%2+2化，了日9酶化L，引物各化L，d地2〇 1化L，总DM模板化 L，所述扩增的反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性45s，55°C退火4s，72°C延伸1.5min， 30个循环;最后在72°C延伸lOmin，引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR扩增产物用 1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，4S green染色，DNA Marker-F作为Marker，结果如图5 (右）所 示，结果显示扩增产物特异性较好，目的条带较明亮，条带大小在1500bp左右，根据琼脂糖 凝胶电泳的结果，将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，根据测序结 果，将序列在http://www.ezbiocloud.net中进行同源性比对分析，根据比对分析结果，选 取相似性最高（均大于96%)的前10个基因序列，使用ClustalXa. 83)软件进行多重比对， 比对结果使用MEGA5.10建立系统发育树，W芽胞乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus) 作为外源菌，结果如图6所示，B1和B2均属于赖氨酸芽抱杆菌化ysinAacillus)，其中，B1和 Lysinibacillus xylanil}fticus同源性可信度达到98%，B2和Lysinibacillus bo;ronitolerans、Lysinibacillus macroides同源性可信度达到98%。
[005引（11)耐低溫检验
[0059] 取步骤(6)培养的菌液接种于放置有含化2Se〇3的LB液体培养基的锥形瓶中，接着 将接种后的锥形瓶放置在振荡培养箱中培养，化2Se〇3浓度为150mg · l/i，LB液体培养基的 体积为25mL，振荡培养箱的溫度为35°C，振荡培养箱的转速为18化· min-i，振荡培养时间为 1化，接着将菌液稀释，稀释倍数为1〇1-1〇6,然后取稀释的1〇6菌液涂布于含NasSe化的LB固体 培养基上，置于4°C冰箱中恒溫培养，观察菌落形态特征，涂布的菌液量为lOOyL，所述 NasSeO洽量为150mg · L-1，培养时间为72h，结果如下表1所示，结果表明两株细菌均能够在 4°C条件下生长，具有一定的耐低溫能力，根据(：〇〇'6￥；^3.61:.曰1(2012)研究结果，确定81为 Lysinibacillus xylanilyticus，B2为Lysinibacillus macroides。
[0060] 表 1
[0061]
[0062]上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式 的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改 进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发 明的保护范围应该W权利要求书所限定的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤， (1) 制备富硒土壤悬液； (2) 增菌培养:取步骤（1)制备的富硒土壤悬液加入到含浓度为100-200mg · I/1亚硒酸 盐的LB液体培养基中，并置于振荡培养基中振荡培养； (3) 继代培养:将步骤(2)振荡培养后的菌液接种于含浓度为100-200mg · I/1亚硒酸盐 的LB液体培养基中，菌液的接种量为该LB液体培养基总体积的3%-7%，之后置于振荡培养 箱中振荡培养，如此重复3-5次； (4) 稀释涂布平板:将步骤(3)得到的菌液用无菌水稀释lOllO7倍，取稀释105、10 6、107 菌液涂布于含100-200mg · Γ1亚硒酸盐的LB固体培养基上，置于生化培养箱中恒温培养； (5) 平板划线；取步骤(4)长出的单菌落结合平板划线法接种于含100-200mg · I/1亚硒 酸盐的LB液体培养基中，之后置于生化培养箱中恒温培养； (6) 活化:取步骤(5)长出的菌落接种于LB液体培养基中，之后置于振荡培养箱中培养； (7) 革兰氏染色:取步骤(5)长出的菌落结合平板划线法接种于LB液体培养基中，之后 置于生化培养箱中恒温培养，挑取单菌落进行革兰氏染色； (8) 总DNA提取； (9) 16S rDNA基因扩增进行鉴定。2. 根据权利要求1所述超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，其特征在于，所述亚硒酸 盐为亚硒酸钠。3. 根据权利要求1所述超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，其特征在于，所述16S rDNA基因扩增的引物包括序列号为SEQ ID NO. 1的UF和序列号为SEQ ID NO.2的UR，其中， UF为 5 ' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 '，M为A或C; UR为5 '-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 '。4. 根据权利要求3所述超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，其特征在于，所述扩增的 反应体系为30μ1，包括dNTPs 2yL，10 X buf f er 3yL，Mg2+2yL，Tap酶lyL，引物UF和UR各lyL， ddH20 19yL，总 DNA 模板 lyL。5. 根据权利要求3所述超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，其特征在于，所述扩增的 反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性45s，55°C退火4s，72°C延伸1.5min，30个循环;最后 在 72°C 延伸 lOmin。6. 根据权利要求1所述超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，其特征在于，所述振荡培 养箱恒温培养的温度为35-37°C，转速160-200r · min-、培养时间为8-14h。7. 根据权利要求1所述超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，其特征在于，步骤(4)和 (5)中所述生化培养箱恒温培养的温度为36-38°C，培养时间24-72h，步骤(7)中所述生化培 养箱恒温培养的温度为36-38°C，培养时间18-24h。8. 根据权利要求1所述超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，其特征在于，步骤(1)制备 富硒土壤悬液的方法为取富硒土壤样品，加入含有已灭菌的磷酸盐缓冲液的容器中并置于 振荡培养箱中振荡，培养温度为25°C，转速180r ?mirT1，振荡时间为30min，之后静置20-40min，取悬浮液经离心、弃去上清液，再加入磷酸缓冲液得到。9. 根据权利要求1所述超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，其特征在于，所述方法还 包括耐硒能力测定，耐硒能力测定的方法为取步骤(6)得到的菌液，以体积分数为0.5%- 1.5%的耐硒细菌接种量接种于含亚硒酸盐或硒酸盐的LB液体培养基中并置于振荡培养箱 中培养，之后每隔3h用分光光度计测菌液的吸光度值，绘制细菌的生长曲线，振荡培养箱的 温度为35°C，转速为180r · mirT1，所述振荡培养时间为24-36h，LB液体培养基中含硒酸盐的 量为0-400mM，LB液体培养基中含亚硒酸盐的量为0-160mM。10.根据权利要求1所述超耐硒细菌分离、纯化及鉴定的方法，其特征在于，所述超耐硒 细菌为Lysinibacillus xylanilyticus和Lysinibacillus macroides。
【文档编号】C12Q1/04GK106011021SQ201610527569
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】杨如意, 李静, 邵宗圆, 苏楠楠
【申请人】安徽师范大学